王 穎 王立娜 劉春雨 王 靜 黃志強(qiáng) 張由芹 朱明珠 蔡梅超

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

天龍別名壁虎、守宮，為壁虎科動(dòng)物無蹼壁虎(GekkoswinhonisGunther)等的全體[1]，味咸性寒，具有祛風(fēng)定驚、散結(jié)解毒、通絡(luò)止痛等功效。近代研究表明，天龍具有抗腫瘤的作用，壁虎中主要含有與馬峰毒相似的有毒物質(zhì)以及組織胺類和蛋白質(zhì)類成分。現(xiàn)代藥理研究表明,動(dòng)物類藥材發(fā)揮作用的主要為其小分子肽[2～4]，動(dòng)物藥在酶解之后其生物活性普遍高于原品[5～7]。顧響響[8]等研究表明，鮮壁虎酶解后增加了鮮壁虎粗提物對小鼠H22移植瘤的抑制作用。

本文以天龍凍干粉為底物，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶5種蛋白酶進(jìn)行水解，同時(shí)以水提天龍粉作為對照組，測定每種蛋白酶的水解度，評價(jià)5種蛋白酶對天龍粉的水解效果，為天龍抗腫瘤活性成分及天龍加工方法的改進(jìn)提供新思路，為臨床用藥提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑

胰蛋白酶、 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、甘氨酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶( 上海源葉生物科技有限公司)；茚三酮、果糖、鄰苯二甲酸氫鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、0.1 mol/l 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液40%氫氧化鈉溶液、4%硼酸溶液；所有試劑均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。

1.2 儀器

KDN-2C 定氮儀配四孔消化爐( 上海纖檢儀器有限公司)；PHS-25型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司； UV9100B 可見分光光度計(jì)( 北京萊伯泰科儀器有限公司)等。

1.3 藥材

天龍購自安徽亳州市，天龍粉為冷凍干燥天龍粉，批號為20150801。

2 方 法

2.1 天龍粉水解液的制備

稱取天龍凍干粉6份，每份精密稱取1.000 0 g，分別加入250 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶30加入定量蒸餾水，超聲提取30 min，按表1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別得到6種天龍粉酶解粗液，然后分別在3 000 r/min條件下，離心10 min，抽濾，定容至100 mL，得最終天龍酶解液。

表1 5種蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of five kinds of protease

2.2 茚三酮顯色法測定蛋白質(zhì)的水解度

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取茚三酮0.5 g，磷酸氫二鈉10 g，果糖0.3 g，磷酸二氫鉀6 g，用40%乙醇溶液，定容至100 mL，即得茚三酮顯色劑。

精密稱取干燥過的甘氨酸0.100 0 g，加蒸餾水溶解后定容至100 mL，然后再取出2 mL定容到100 mL容量瓶中,即得 20 ug/mL 的溶液，分別量取0、1、2、3、4、5 mL定容到10 mL的容量瓶中,再分別從各稀釋液取2 mL于試管中，加入1.00 mL顯色劑，混勻，在沸水浴中加熱15 min，在冷水中迅速放涼，各加入5 mL40%乙醇溶液，混勻后，放置15 min,在570 nm處用分光光度計(jì)測定吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2樣品中游離氨基酸含量測定

將6種天龍粉水解液適量定量，按照一定的稀釋倍數(shù)稀釋到適宜的濃度，按照“2.2.1”方法測定樣品的吸光度A，并計(jì)算樣品中游離氨基酸的含量。

2.3 水解度的測定

用茚三酮法測定水解液中的游離氨基肽氮含量，用凱氏定氮法測定原料中總氮量，按照下式計(jì)算水解度。

式中：A：料中的總氮數(shù)；B：水解液中的氨基氮數(shù)；C：原料中游離的氨基氮數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 氨基肽氮含量的測定

3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為橫坐標(biāo)，以甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的-NH2濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=4.978X-0.028，相關(guān)系數(shù)r2=0.9984。

3.1.2樣品中氨基肽氮的含量測定結(jié)果

如表2所示。

表2 水解液中的氨基肽氮含量Tabke 2 Content of amino nitrogen in Hydrolysate

3.2 樣品的水解度測定結(jié)果

用凱氏定氮法測定1.000 0 g原料中總氮的含量為21.679 mg/mL。根據(jù)公式計(jì)算出四種蛋白質(zhì)的水解度，結(jié)果如圖1所示，彈性蛋白酶的水解能力最高，DH為73.18%，胃蛋白酶的水解度為76.33%，木瓜蛋白酶的水解度為57.34%，胰凝乳蛋白酶的水解度較低，DH為34.05%。胰蛋白酶的水解度最低，DH為29.68%。

圖1 五種蛋白酶的水解度Fig 1 Hydrolysis degree of five kinds of proteases

4 討 論

本研究利用五種不同的酶將天龍粉酶解，其中經(jīng)彈性蛋白酶和胃蛋白酶酶解后的水解度較高，木瓜蛋白酶的水解度次之，而胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的水解度較低。這是不同種類的酶具有不同的酶切位點(diǎn)。胃蛋白酶是胃中主要消化的蛋白酶，能夠水解芳香族或其他疏水氨基酸的羧基或氨基形成的肽鍵；彈性蛋白酶具有廣泛的水解活性對明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質(zhì)都有降解作用，是一種廣譜的肽鏈內(nèi)切酶[9]，能夠水解丙氨酸、甘氨酸及短脂肪鏈氨基酸的羧基形成的肽鍵；胰蛋白酶是小腸中主要消化的蛋白酶，只是專一地水精氨酸、解賴氨酸羧基形成的肽鍵；胰凝乳蛋白酶是專一地水解由芳香族氨基酸或帶有較大非極性側(cè)鏈的氨基酸羧基形成的肽鍵；木瓜蛋白酶是食品工業(yè)中常用的蛋白酶，具有較寬的底物特異性，作用于蛋白質(zhì)中的L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸殘基羧基參與形成的肽鏈。

很多研究表明，動(dòng)、植物中的小分子肽具有很好的抗腫瘤效果。有研究表明，某些動(dòng)物藥經(jīng)酶解后釋放出活性多肽，表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性，因此，從動(dòng)物藥酶解產(chǎn)物中發(fā)掘出高效低毒的活性多肽，可能是新藥發(fā)現(xiàn)的一條新途徑。本研究考察不同酶對天龍粉的酶解效果，以水解度為評判指標(biāo)，可以為下一步藥理實(shí)驗(yàn)探究天龍不同酶解物的抗腫瘤效果，提供參考，也可以為下一步天龍抗腫瘤活性成分及天龍加工方法的改進(jìn)提供新思路，為臨床用藥提供新途徑。

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