趙延存， 劉 坤，， 孫連波， 錢(qián)國(guó)良， 劉鳳權(quán)，

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇南京 210095)

梨是我國(guó)第三大水果，種植范圍廣，我國(guó)梨樹(shù)栽培面積約108.5萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)1 579.5萬(wàn)t，約占世界總產(chǎn)量的 2/3[1-2]。梨樹(shù)腐爛病又稱(chēng)爛皮病，是梨樹(shù)上危害最嚴(yán)重的枝干病害，在我國(guó)各地梨園均有發(fā)生，特別是新疆、西北、華北和東北產(chǎn)區(qū)發(fā)生危害較嚴(yán)重，對(duì)我國(guó)梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[3]。庫(kù)爾勒香梨是新疆庫(kù)爾勒地區(qū)的優(yōu)質(zhì)特色地方梨品種，因其品質(zhì)佳而遠(yuǎn)銷(xiāo)國(guó)內(nèi)外。然而，近年來(lái)梨樹(shù)腐爛病危害嚴(yán)重，許多香梨園中梨樹(shù)腐爛病病株率高達(dá)100%，90%的梨樹(shù)死亡植株是由腐爛病危害所致，嚴(yán)重制約了香梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-5]。

在新疆地區(qū)，白楊樹(shù)常作為防護(hù)林栽種于梨園四周，白楊樹(shù)腐爛病也發(fā)生危害較嚴(yán)重。在病害調(diào)研過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)白楊樹(shù)腐爛病癥狀與梨樹(shù)腐爛病癥狀極為相似，因此推測(cè)這2種樹(shù)木上的腐爛病病菌可能存在交叉侵染現(xiàn)象。已有研究表明，白楊樹(shù)腐爛病病菌可以危害蘋(píng)果樹(shù)、梨樹(shù)等[6-7]，蘋(píng)果樹(shù)和梨樹(shù)腐爛病病菌也可以危害楊樹(shù)[8-10]。為驗(yàn)證香梨腐爛病病菌和白楊樹(shù)腐爛病病菌的交叉侵染，分別采集了香梨樹(shù)及白楊樹(shù)腐爛病的樣品，對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行交叉接種侵染試驗(yàn)，以確定香梨腐爛病的侵染源，為新疆香梨腐爛病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 庫(kù)爾勒香梨樹(shù)的腐爛病樣品以及種植于梨園周?chē)讞顦?shù)的腐爛病樣品，均采自新疆庫(kù)爾勒地區(qū)。

1.1.2 接種材料 庫(kù)爾勒香梨枝條、葉片、果實(shí)，白楊樹(shù)枝條。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PDA)：200 g去皮馬鈴薯，切成小塊，加20 g瓊脂，1 000 mL水煮沸30 min，4層紗布過(guò)濾，濾液中加入20 g蔗糖，用水補(bǔ)足1 000 mL。

1.1.4 引物 采用ITS通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對(duì)菌株的總DNA進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定 采用組織分離法，從病斑的病健交界處取樣，置于PDA平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)，待組織周?chē)L(zhǎng)出真菌菌絲，從邊緣處打孔，將菌絲塊移植于新的PDA平板上，并對(duì)其進(jìn)行編號(hào)。利用真菌DNA提取試劑盒(OMEGA)提取每個(gè)菌株的總DNA，然后利用ITS通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)及測(cè)序，并將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.2.2 病原菌的驗(yàn)證試驗(yàn) 依據(jù)柯赫氏法則，采用打孔法，首先選取粗細(xì)相同的枝條，消毒后截成15 cm長(zhǎng)的小段，上端用石蠟封口，然后用直徑為0.8 cm的打孔器在樹(shù)枝上打孔，將菌絲塊長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的一面緊貼傷口部位，以只接種PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，然后用封口膜將傷口部位包扎好，將枝條插入滅菌的濕沙盤(pán)中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)，接種5 d后測(cè)量病斑長(zhǎng)度，每個(gè)病菌重復(fù)3次。將從梨樹(shù)上的分離物回接梨樹(shù)枝條，同時(shí)將從白楊樹(shù)上的分離物回接白楊樹(shù)枝條，觀察其發(fā)病情況，并從發(fā)病部位再次分離病原菌，并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。

1.2.3 病原菌的交叉侵染試驗(yàn) 采用打孔法將梨樹(shù)上的分離物接種于白楊樹(shù)枝條，同時(shí)將白楊樹(shù)上的分離物接種于梨樹(shù)枝條，觀察其能否產(chǎn)生交叉侵染現(xiàn)象，并對(duì)發(fā)病部位再次進(jìn)行病原菌的分離和鑒定。

1.2.4 病原菌在梨樹(shù)上的致病性研究 將白楊樹(shù)上分離得到的病原物通過(guò)打孔法接種于梨樹(shù)枝條和梨果實(shí)上，并通過(guò)針刺法接種于梨樹(shù)葉片，觀察發(fā)病情況。統(tǒng)計(jì)病原菌在梨果實(shí)上發(fā)病6 d后的病斑大小。將白楊樹(shù)上的分離物在梨果實(shí)上繼代接種3代，即不斷從發(fā)病部位分離病原菌并再次接種，觀察各代病原菌的致病性變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

從梨樹(shù)樣品中共分離得到23株疑似病原菌的菌株，從白楊樹(shù)樣品中共分離得到35株疑似病原菌的菌株，將這些菌株進(jìn)行rDNA-ITS測(cè)序，并將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)梨樹(shù)樣品分離物中有8株菌株與梨腐爛病病菌具有較高的同源性，而白楊樹(shù)樣品分離物中有11株菌株與白楊樹(shù)腐爛病病菌有較高的同源性，另有9株菌株與柳樹(shù)腐爛病病菌有較高的同源性，同源性均高于99%。再結(jié)合培養(yǎng)性狀觀察，最終將這些菌株分別鑒定為梨樹(shù)腐爛病病菌(Valsamalivar.pyri)、白楊樹(shù)腐爛病病菌(Valsasordida)、柳樹(shù)腐爛病病菌(Cytosporatranslucens)。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

3種腐爛病病菌的培養(yǎng)性狀如圖1所示，A1、B1、C1分別為梨樹(shù)、白楊樹(shù)、柳樹(shù)腐爛病病菌培養(yǎng)5 d后的菌落形態(tài)，其中梨樹(shù)腐爛病病菌菌落呈白色，菌絲氣生性較弱，緊貼著培養(yǎng)基生長(zhǎng)；白楊樹(shù)腐爛病病菌菌落呈橘紅色，菌絲氣生性較強(qiáng)，呈絲狀，不緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)；柳樹(shù)腐爛病病菌菌落呈褐綠色，菌絲的氣生性也較弱，緊貼著培養(yǎng)基生長(zhǎng)。A2、B2、C2分別為梨樹(shù)、白楊樹(shù)、柳樹(shù)腐爛病病菌培養(yǎng) 15 d 后的菌落形態(tài)，可以看出3種菌株均已產(chǎn)生分生孢子器，突起于培養(yǎng)基上方，其中梨樹(shù)腐爛病病菌的分生孢子器呈墨綠色，較大；白楊樹(shù)及柳樹(shù)腐爛病病菌的分生孢子器呈白色，白楊樹(shù)腐爛病病菌的分生孢子器較大也比較密集， 柳樹(shù)腐爛病病菌的分生孢子器較小，且比較稀疏。

2.3 病原菌的回接驗(yàn)證及交叉侵染試驗(yàn)

將梨樹(shù)、白楊樹(shù)和柳樹(shù)腐爛病病菌分別回接到各自寄主的枝條上，發(fā)病率分別為100.0%、73.7%、56.3%(表1)，其病害癥狀如圖2所示，與所采集樣品的病害癥狀相似。從發(fā)病部位再次分離病菌，進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子鑒定，結(jié)果證實(shí)分離物與接種的病原菌相同，依據(jù)柯赫氏法則證明從所采集樣品上獲得的分離物即為這2種枝條的致病菌。

將已驗(yàn)證的病原菌進(jìn)行交叉侵染試驗(yàn)，即選取梨樹(shù)腐爛病病菌接種白楊樹(shù)枝條，再選取白楊樹(shù)、柳樹(shù)腐爛病病菌接種梨樹(shù)枝條，觀察交叉接種后的發(fā)病情況。由表1可知，白楊樹(shù)、柳樹(shù)腐爛病病菌接種到梨樹(shù)枝條后發(fā)病率分別為 45.8%、63.0%，而梨樹(shù)腐爛病病菌接種白楊樹(shù)枝條后發(fā)病率僅為 8.9%。從以上枝條的發(fā)病部位再次分離病菌，并進(jìn)行形態(tài)及分子鑒定，結(jié)果證實(shí)分離物與接種的病原菌相同，說(shuō)明這些病原菌之間可以交叉侵染。

表1 病原菌回接梨樹(shù)、白楊樹(shù)枝條的發(fā)病率

2.4 病原菌在梨樹(shù)上的致病性研究

為研究白楊樹(shù)上的腐爛病病菌對(duì)梨樹(shù)的危害，將其與梨樹(shù)腐爛病病菌一起接種于梨樹(shù)，觀察致病情況。將3種病原菌接種于梨樹(shù)枝條，由梨樹(shù)、白楊樹(shù)、柳樹(shù)腐爛病病菌引起的發(fā)病率分別為100.0%、45.8%、63.0%；將3種病原菌接種梨樹(shù)葉片，發(fā)病率分別為100.0%、6.7%、44.4%，且柳樹(shù)、白楊樹(shù)腐爛病病菌在梨樹(shù)葉片上引起的病斑較小(圖3)；將3種病原菌接種于庫(kù)爾勒香梨果實(shí)上，致病率均為100%，病害癥狀如圖4所示，白楊樹(shù)、柳樹(shù)腐爛病病菌引起的病害癥狀顏色均較深，其病斑與梨樹(shù)腐爛病病菌引起的病害癥狀完全不同，三者的病斑大小表現(xiàn)為梨樹(shù)腐爛病病菌>柳樹(shù)腐爛病病菌>白楊樹(shù)腐爛病病菌。綜合分析3種病原菌在梨樹(shù)枝條、葉片和果實(shí)上的致病情況，梨腐爛病病菌在梨樹(shù)上的致病性最強(qiáng)，其次為柳樹(shù)腐爛病病菌，而白楊樹(shù)腐爛病病菌的致病力最弱。

為進(jìn)一步研究白楊樹(shù)上的腐爛病病菌侵染梨樹(shù)后其致病力的變化情況，將梨樹(shù)果實(shí)發(fā)病后分離獲得的菌株作為2代進(jìn)行接種，將再次分離得到的菌株作為3代進(jìn)行接種，觀察繼代接種后病原菌的致病力變化情況。由圖5可知，柳樹(shù)腐爛病病菌的2代致病力有所下降，但3代致病力又有所上升，且高于1代的致病力。白楊樹(shù)腐爛病病菌的致病力則逐代增強(qiáng)。因此，推測(cè)這2種病菌反復(fù)侵染梨樹(shù)后，其致病力會(huì)逐漸增強(qiáng)。

3 討論

腐爛病是危害果樹(shù)和林木枝干的主要病害，一些來(lái)源于不同寄主的腐爛病病原菌能夠侵染其他寄主植物，引起危害[11-14]。本試驗(yàn)通過(guò)柯赫氏法則、ITS序列和菌落形態(tài)特征確定了引起庫(kù)爾勒地區(qū)香梨梨樹(shù)腐爛病的病原菌為Valsamalivar.pyri，引起白楊樹(shù)腐爛病的病原菌為Valsasordida和Cytosporatranslucens。本研究發(fā)現(xiàn)，白楊樹(shù)上分離得到的2種腐爛病病菌均能夠成功侵染香梨梨樹(shù)枝條，這與郭眾仲等的研究結(jié)果[13]一致。但是，本研究發(fā)現(xiàn)分離鑒定的梨樹(shù)腐爛病病菌對(duì)白楊樹(shù)枝條的侵染成功率僅為8.9%，且病斑擴(kuò)展較小。周玉霞等研究發(fā)現(xiàn)，梨樹(shù)腐爛病病菌不能侵染白楊樹(shù)枝條[15]，本研究的結(jié)果與之相符，這表明白楊樹(shù)對(duì)梨樹(shù)腐爛病病菌的侵染具有較強(qiáng)的抵抗能力。

雖然在室內(nèi)試驗(yàn)中白楊樹(shù)上的腐爛病病菌可以侵染梨樹(shù)枝條，但是其接種發(fā)病率和致病力均明顯低于梨樹(shù)腐爛病病菌。另外，梨樹(shù)腐爛病病菌在梨樹(shù)各類(lèi)傷口上均表現(xiàn)出強(qiáng)大的生存競(jìng)爭(zhēng)能力，限制了其他腐爛病病菌的定殖侵染。但繼代接種試驗(yàn)結(jié)果表明，白楊樹(shù)腐爛病病菌的致病力可以在梨樹(shù)寄主上逐代變強(qiáng)。長(zhǎng)期疏于對(duì)果園周邊白楊樹(shù)腐爛病的管理和防治，可能導(dǎo)致其成為梨樹(shù)腐爛病的潛在侵染源。

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