1.研究背景

研究表明，有五分之一以上的歐美人飽受慢性疼痛的困擾。臨床數(shù)據(jù)表明睡眠和疼痛可以相互影響—疼痛會(huì)影響睡眠，同樣睡眠不足可能會(huì)加劇疼痛。 如燒傷病人出院后是否出現(xiàn)失眠癥狀，是預(yù)測(cè)燒傷后慢性疼痛是否發(fā)生的一項(xiàng)指標(biāo)；對(duì)于纖維肌痛的病人，不能恢復(fù)精神效果的睡眠往往與更多的疼痛相聯(lián)系，反之恢復(fù)精神良好的睡眠可以緩解疼痛。 睡眠-覺(jué)醒模式和痛敏都受遺傳、壓力和環(huán)境的影響，而恰恰這些因素是在以人為研究目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)中不能控制的。為解決這個(gè)問(wèn)題，我們使用雜交的C57BL/6J小鼠，在可控條件下使用多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)記錄系統(tǒng) （腦電圖EEG、肌電圖EMG）來(lái)研究睡眠不足和痛敏之間的關(guān)系。

2.主要研究方法

過(guò)去在研究長(zhǎng)期剝奪睡眠的嚙齒類動(dòng)物時(shí)，使用的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程往往涉及長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)迫活動(dòng)進(jìn)而減少睡眠或剝奪選擇性快速動(dòng)眼睡眠 (REMS)，盡管以上實(shí)驗(yàn)流程改變了痛閾，但是到底是應(yīng)激 (Stress)還是睡眠剝奪導(dǎo)致了痛敏是難以解釋清楚的。

為了在不形成應(yīng)激的情況下剝奪實(shí)驗(yàn)鼠的睡眠，本文的實(shí)驗(yàn)者采用持續(xù)不斷地監(jiān)測(cè)小鼠的腦電圖和肌電圖的方法。當(dāng)非快動(dòng)眼睡眠 (NREMS) 開(kāi)始（一種睡眠嘗試）時(shí)，在小鼠身邊放置一個(gè)新物體（不觸碰到小鼠）來(lái)喚醒小鼠。實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)小鼠的總NREMS時(shí)間平均減少了98±0.4%，而REMS在所有的實(shí)驗(yàn)鼠都消失了；伴隨著睡眠剝奪持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng) (12 h)，小鼠睡眠壓力較高，嘗試進(jìn)入NREMS的次數(shù)更多，進(jìn)入非干擾睡眠前的潛伏期變短。實(shí)驗(yàn)者通過(guò)常規(guī)的熱痛和機(jī)械痛檢測(cè)，對(duì)小鼠在睡眠剝奪了6、9或12 h后進(jìn)行痛閾測(cè)定，進(jìn)而對(duì)這種急性睡眠剝奪 (ASD) 進(jìn)行了量效分析。

3.主要研究結(jié)果

對(duì)于睡眠剝奪了9或12 h的ASD雄鼠，與其基礎(chǔ)痛閾以及對(duì)照組小鼠痛閾相比， ASD增加了小鼠對(duì)傷害性熱刺激和機(jī)械刺激的反應(yīng)，在恢復(fù)睡眠24 h后其痛閾恢復(fù)到基礎(chǔ)痛閾水平；此外，睡眠剝奪9 h增加了在足底注射辣椒素 （一種TRPV1激動(dòng)劑）ASD小鼠的傷害性反應(yīng)（舔爪）；而雌鼠在ASD 9 h后的行為表型與雄鼠類似。無(wú)論是雄鼠還是雌鼠，ASD (9和12 h) 僅僅增加了對(duì)高機(jī)械力 (von Frey 0.4～2.0 g) 即傷害性刺激的反應(yīng)，卻不影響對(duì)低機(jī)械力 (0.07～0.16 g) 即非傷害性刺激的反應(yīng)。即感受高機(jī)械刺激的痛覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元受到了影響，而感受低機(jī)械閾值的神經(jīng)纖維不受影響；溫和的輕觸刺激 (Brush) 以及丙酮誘發(fā)的冷痛卻不受ASD的影響；在熱梯度選擇實(shí)驗(yàn)中，ASD 9 h的小鼠會(huì)選擇避開(kāi)熱傷害刺激的溫度（40～50 ℃）區(qū)域，這種選擇行為在恢復(fù)睡眠一晚后回歸正常。

為了研究由ASD產(chǎn)生的痛敏是否反應(yīng)出一般性的高反應(yīng)狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)者利用一系列不同強(qiáng)度的噪音刺激來(lái)檢測(cè)小鼠的震驚反射。結(jié)果表明ASD 9 h后的實(shí)驗(yàn)鼠其震驚反射幅度降低（特別是對(duì)高強(qiáng)度脈沖的噪音），而不影響震驚反射的頻率及反射潛伏期，睡眠恢復(fù)后可以使實(shí)驗(yàn)鼠已降低的震驚反射幅度恢復(fù)至實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)水平。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上發(fā)現(xiàn)是否適用于長(zhǎng)期睡眠不足的情況，實(shí)驗(yàn)者又制作了一種溫和的慢性睡眠剝奪(CSD) 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在前面的ASD模型中，每天造成小鼠6 h的睡眠剝奪不足以產(chǎn)生痛敏，但連續(xù)五天的6 h睡眠剝奪(在每天早上七點(diǎn)給光的時(shí)候開(kāi)始)，這樣的實(shí)驗(yàn)流程延長(zhǎng)了刺激時(shí)間（睡眠剝奪時(shí)間），同時(shí)可以保證實(shí)驗(yàn)鼠血漿內(nèi)的皮質(zhì)酮保持在正常水平，這意味著可以使實(shí)驗(yàn)鼠處于非應(yīng)激狀態(tài)。在CSD過(guò)程中，由于實(shí)驗(yàn)鼠探索新物體的活動(dòng)增加，而導(dǎo)致自發(fā)活動(dòng)較實(shí)驗(yàn)前有所增加，但總的日?；顒?dòng)模式在睡眠剝奪期間與實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)值基本類似。

與基礎(chǔ)值相比，CSD可顯著降低實(shí)驗(yàn)鼠的NREMS時(shí)間（CSD 1 d減少98%，而持續(xù)5 d可以使減少95%），幾乎沒(méi)有REMS。被睡眠剝奪的五天里，實(shí)驗(yàn)鼠的睡眠壓力在逐步增加，表現(xiàn)為在睡眠剝奪期間更多次地嘗試進(jìn)入NREMS和一旦有機(jī)會(huì)進(jìn)入睡眠時(shí)的潛伏期縮短。

長(zhǎng)時(shí)間清醒后則是反彈性睡眠，表現(xiàn)為NREMS和REMS時(shí)間均穩(wěn)定地增加。盡管CSD導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)鼠睡眠壓力累計(jì)性增加，在實(shí)驗(yàn)的1、3和5 d時(shí)，一旦有機(jī)會(huì)進(jìn)入睡眠時(shí)實(shí)驗(yàn)鼠表現(xiàn)出相似程度的反彈性的NREMS和REMS，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)鼠每天的睡眠時(shí)間不能完全恢復(fù)到實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)水平，這就意味著第5天后實(shí)驗(yàn)鼠的累計(jì)凈睡眠缺乏達(dá)7.9±1.5 h。睡眠穩(wěn)態(tài)的另一個(gè)指標(biāo)是在NREMS期間增加了腦電圖的慢波活動(dòng)(SWA) (0.5～4.0 Hz)，也是睡眠缺乏和睡眠強(qiáng)度的一個(gè)指標(biāo)。光譜分析表明，NREMS的SWA比實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)值增加約50%（14：00～19：00測(cè)量），并在CSD的1和5 d的NREMS過(guò)程中有著同等程度的累積和EEG分辨率，表明一旦有睡眠機(jī)會(huì)，睡眠剝奪鼠具有相似的向深度睡眠轉(zhuǎn)換。

與基礎(chǔ)閾值或者對(duì)照組小鼠相比，持續(xù)5 d的CSD會(huì)逐漸增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)鼠的熱痛敏，在第5 d時(shí)達(dá)到高峰。在CSD的第5 d，實(shí)驗(yàn)鼠對(duì)von Frey刺激誘發(fā)的機(jī)械痛敏也增強(qiáng)，然而對(duì)于非傷害性機(jī)械刺激（毛刷或者低強(qiáng)度的von Frey纖毛）的敏感性則沒(méi)有變化。由于對(duì)照組小鼠在反復(fù)檢測(cè)中的痛敏沒(méi)有變化，同時(shí)CSD鼠在2 d的恢復(fù)性睡眠后，熱痛敏和機(jī)械痛敏都恢復(fù)至基礎(chǔ)閾值水平，所以實(shí)驗(yàn)者得出結(jié)論：對(duì)于CSD鼠，累積性睡眠不足導(dǎo)致了痛覺(jué)過(guò)敏。

小鼠睡眠期間被喚醒會(huì)導(dǎo)致睡眠質(zhì)量降低。為了證實(shí)慢性（超過(guò)5 d）片段性睡眠是否改變了小鼠的痛敏閾值，實(shí)驗(yàn)者又設(shè)計(jì)了一種實(shí)驗(yàn)，每分鐘將鼠籠向上進(jìn)行一次快速但溫和的運(yùn)動(dòng)，使實(shí)驗(yàn)鼠在有限的壓力下和沒(méi)有強(qiáng)制性自主活動(dòng)的條件下醒來(lái)。這種干預(yù)將NREMS平均持續(xù)時(shí)間減少了約60%，總REMS時(shí)間減少了約65%，但卻不影響實(shí)驗(yàn)鼠對(duì)傷害性熱刺激和機(jī)械刺激的敏感性。

為進(jìn)一步研究睡眠缺失導(dǎo)致痛敏的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)者首先檢測(cè)了環(huán)氧合酶(COX)是否在其中有著重要作用。炎癥時(shí)花生四烯酸在COX作用下可以生成前列腺素，而前列腺素是傷害性感受器的增敏劑，并與睡眠受限后的自發(fā)性疼痛相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在9 h的ASD結(jié)束前30 min給予非選擇性COX抑制劑布洛芬 (30 mg/kg)皮下注射，對(duì)睡眠剝奪誘發(fā)實(shí)驗(yàn)鼠的熱痛敏和機(jī)械痛敏沒(méi)有影響；而在睡眠剝奪9 h后，給予實(shí)驗(yàn)鼠皮下注射5 mg/kg的嗎啡，該劑量能抑制正常鼠的熱痛而不影響其機(jī)械痛閾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由睡眠不足引起的熱痛敏略有緩解，而對(duì)機(jī)械痛敏則沒(méi)有影響。總之，對(duì)于睡眠剝奪鼠，嗎啡的鎮(zhèn)痛作用有很大程度地減弱了。

為了研究睡眠不足所產(chǎn)生的痛敏是否與警覺(jué)性降低有關(guān)，實(shí)驗(yàn)者又使用了兩種覺(jué)醒促進(jìn)劑：A1和A2A腺苷受體拮抗劑Caffeine和促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的Moda fi nil。在9 h的ASD結(jié)束前2 h，用以上藥物促進(jìn)覺(jué)醒約3 h（20 mg/kg的Caffeine,45 mg/kg的Moda fi nil腹腔注射），可以減少實(shí)驗(yàn)鼠的睡眠嘗試和延長(zhǎng)NREMS的入睡潛伏期，表明提高了實(shí)驗(yàn)鼠的警覺(jué)性。在警覺(jué)提高期間，Caffeine和Moda fi nil均可阻斷睡眠剝奪誘發(fā)的機(jī)械痛敏，并部分降低熱痛敏。在熱梯度選擇實(shí)驗(yàn)中，Caffeine還能增加實(shí)驗(yàn)鼠在傷害性熱區(qū)域的時(shí)間。但Caffeine并沒(méi)有使睡眠剝奪鼠已經(jīng)降低的聽(tīng)覺(jué)驚恐反射恢復(fù)到正常水平，而是預(yù)防了睡眠剝奪后通常發(fā)生的前脈沖抑制性驚厥缺陷，表明在一定程度上是通過(guò)調(diào)控感覺(jué)運(yùn)動(dòng)門控發(fā)揮作用的。在對(duì)照組中，Caffeine和Moda fi nil均不影響傷害性熱痛敏、機(jī)械痛敏以及在足底注射完全弗氏佐劑后誘發(fā)的炎性痛敏，這表明Caffeine和Moda fi nil不是通過(guò)它們的鎮(zhèn)痛效應(yīng)進(jìn)而抑制睡眠不足所誘發(fā)的痛敏的。

為了檢測(cè)瞬時(shí)提高警覺(jué)性是否可以緩解CSD(5 d) 引起的痛敏，實(shí)驗(yàn)者在CSD最后一天的11：00時(shí)一次性給予Caffeine (20 mg/kg，腹腔注射)，發(fā)現(xiàn)可以阻斷實(shí)驗(yàn)鼠的睡眠和痛敏，但不能改善睡眠不足，即在一旦有機(jī)會(huì)進(jìn)入睡眠期間維持強(qiáng)勁的NREMS反彈。因此，瞬時(shí)恢復(fù)警覺(jué)性是可以改善CSD導(dǎo)致的痛敏。

4.討論

無(wú)論是雄鼠還是雌鼠，無(wú)應(yīng)激的CSD都可以誘發(fā)熱痛敏、機(jī)械痛敏和增強(qiáng)炎性痛敏，這與人在睡眠剝奪一晚或兩晚后觀察到的癥狀是類似的。Caffeine和Moda fi nil對(duì)睡眠剝奪鼠具有鎮(zhèn)痛作用表明，睡眠剝奪導(dǎo)致的警覺(jué)性降低是誘發(fā)痛敏的主要因素。盡管Caffeine和Moda fi nil通過(guò)不同的分子靶點(diǎn)發(fā)揮覺(jué)醒作用，但促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放是它們的共同點(diǎn)。睡眠剝奪可下調(diào)多巴胺的D2和D3受體，Caffeine恰恰可以上調(diào)D2和D3受體的表達(dá)，進(jìn)而增加多巴胺與D2受體的結(jié)合，而Moda fi nil是通過(guò)抑制多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)而促進(jìn)了多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)的功能。中腦邊緣系統(tǒng)中的多巴胺在疼痛過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，減少多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放可以增加健康受試者的疼痛和纖維肌痛病人的痛敏。 因此，睡眠剝奪引起多巴胺信號(hào)傳遞的減少可能是睡眠剝奪誘發(fā)痛敏的一個(gè)重要因素。

睡眠剝奪導(dǎo)致疼痛信號(hào)被放大，提高警覺(jué)性得以翻轉(zhuǎn)，預(yù)示了可以研發(fā)一類新型鎮(zhèn)痛藥—“狀態(tài)依賴性鎮(zhèn)痛藥”，此類藥物不直接作用于疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展過(guò)程，而是通過(guò)改善能促進(jìn)疼痛惡化的生理病理環(huán)境進(jìn)而緩解疼痛的。Caffeine是許多鎮(zhèn)痛藥的一種添加劑，但迄今為止還沒(méi)有任何理論依據(jù)。所以，研究者推斷咖啡因?qū)?duì)睡眠剝奪者有鎮(zhèn)痛作用。雖然覺(jué)醒促進(jìn)劑對(duì)睡眠不足引起的痛敏有效，但并不能消除隨著時(shí)間推移而累積起來(lái)的實(shí)際性睡眠缺乏。個(gè)體在任何時(shí)候的疼痛程度都能夠部分反映出他近期的睡眠狀況和接觸咖啡因的情況，這些因素都可能對(duì)臨床鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生復(fù)雜的影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有高度差異。例如，睡眠剝奪降低了嗎啡的鎮(zhèn)痛效果，引起人們擔(dān)心睡眠不足會(huì)刺激病人提高嗎啡的用量。因?yàn)樗弑旧砜梢跃徑馑邉儕Z導(dǎo)致的痛敏，同時(shí)增加睡眠不足者（志愿者）的睡眠同樣可以減輕痛敏癥狀，所以改善睡眠不足病人的睡眠狀況，可能是緩解睡眠剝奪導(dǎo)致的疼痛和疼痛癥狀又影響睡眠的惡性循環(huán)，以及維持鎮(zhèn)痛藥最大療效的一種有效的治療策略。

(Alexandre C, Latremoliere A, Ferreira A,et al.Decreased alertness due to sleep loss increases pain sensitivity in mice. Nat Med, 2017, 23(6):768 ～ 774.徐州醫(yī)科大學(xué)，張奉明 王 兵 譯 劉興君 校 )