蘇鑫洪 葉玉勤 楊永祥 賀曉生

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

小鼠皮層神經(jīng)元機(jī)械損傷后miR-124的動(dòng)態(tài)變化及意義

蘇鑫洪 葉玉勤 楊永祥 賀曉生*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

目的觀察體外培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元機(jī)械損傷后微小核糖核酸-124 (miR-124)的表達(dá)變化，初步探討miR-124對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)軸突再生與修復(fù)可能的影響。方法孕15～18 d C57BL/6種孕鼠胚胎腦皮質(zhì)層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7 d，以10 μL移液器塑料滴頭在培養(yǎng)皿內(nèi)劃割，造成機(jī)械性損傷，傷后不同時(shí)間點(diǎn)(1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h, 144 h)分別采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈法(RT-PCR)檢測miR-124和蛋白質(zhì)印記法(Western Blot)檢測神經(jīng)纖毛蛋白(Nrp-1)、微管相關(guān)蛋白(Tau)、生長相關(guān)蛋白43(Gap-43)的表達(dá)水平。然后用miR-124模擬物和抑制劑分別對體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù)，觀察miR-124表達(dá)量的改變對實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果神經(jīng)元機(jī)械損傷后miR-124和Nrp-1、Tau、Gap-43的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，且存在一定的正相關(guān)性。用miR-124模擬物和抑制劑分別顯著升高和降低miR-124的表達(dá)后，Nrp-1、Tau、Gap-43表達(dá)顯著下降，其中抑制劑組下降較模擬物組明顯(P<0.05)。結(jié)論創(chuàng)傷區(qū)miR-124的適度高表達(dá)可能與軸突再生有密切聯(lián)系，這為本課題組今后嘗試梯度調(diào)控miR-124以調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突再生與修復(fù)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

機(jī)械損傷; 微小核糖核酸-124; 軸突再生修復(fù)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)后大量神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺失[1]，促進(jìn)損傷的神經(jīng)元再生和軸突致靶，恢復(fù)受損神經(jīng)功能是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。近年來，隨著一類非編碼小RNA的發(fā)現(xiàn)和研究，為促進(jìn)中樞神經(jīng)再生修復(fù)提供了新思路。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一些5'端帶磷酸基團(tuán)、3'端帶羥基，長度在20～25個(gè)核苷酸的單鏈核糖核酸分子。它本身不編碼蛋白質(zhì)表達(dá)，但可通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)。其中，微小核糖核酸124(microRNA-124, miR-124)是神經(jīng)系統(tǒng)特異性的microRNA，占哺乳動(dòng)物大腦皮質(zhì)總microRNA的25%～48%[2]。它可通過5'端的種子序列和3'端非編碼區(qū)發(fā)生完全或不完全的配對結(jié)合而發(fā)揮影響蛋白質(zhì)的功能和合成的作用，從而達(dá)到對各生理功能的調(diào)節(jié)和控制[3]。但TBI后腦內(nèi)的miR-124時(shí)空變化特征及其對神經(jīng)軸突再生與修復(fù)有何影響，至今尚無定論。并且，由于動(dòng)物個(gè)體差異和干擾因素較多，在體模型也有造模不穩(wěn)定的缺陷，體外模型則具有很好的重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)條件可控性強(qiáng)等顯著優(yōu)點(diǎn)。為此，本研究利用小鼠體外皮層神經(jīng)元機(jī)械損傷模型，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)和蛋白印記(Western Blot)等方法，檢測損傷后不同時(shí)間點(diǎn)miR-124和神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin-1, Nrp-1)、微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein tau, Tau)、生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein-43, Gap-43)的表達(dá)及變化特征，以期探討TBI后miR-124表達(dá)量的變化與軸突再生的關(guān)系，初步研究miR-124對軸突再生與修復(fù)的調(diào)控作用。

材料與方法

一、材料

兔抗小鼠Nrp-1單克隆抗體，兔抗小鼠Gap-43單克隆抗體和兔抗小鼠Tau單克隆抗體購自英國Abcam公司，抗β-actin兔多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購自中國萬類生物科技，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，Trizol和miR-124模擬物、miR-124抑制劑、miR-124陰性對照購自上海生工生物工程有限公司，microRNA定量組合試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，胎牛血清和杜爾貝科改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)購自美國GIBCO公司，脂質(zhì)體RNA轉(zhuǎn)染劑購自美國Invitrogen公司，15～18 d C57BL/6種孕鼠(由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

二、小鼠腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)

脫頸法處死孕鼠, 體表用75%乙醇消毒。無菌狀態(tài)下快速取出胎鼠置于冰盒上，解剖顯微鏡下剝離胎鼠大腦皮層，置于平衡鹽溶液中，仔細(xì)剝?nèi)ツX膜及血管組織，棄去液體后，用平衡鹽溶液再漂洗l次，用眼科剪將腦皮質(zhì)組織塊剪碎，然后用巴斯德管吹打成勻漿液。1000 r/min離心5 min，棄上清。加入胰酶消化液，于37 ℃，50 mL/L CO2孵箱中消化20 min。通過40 μm細(xì)胞濾膜去除未消化組織。1000 r/min離心5 min，棄上清。加入含200 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液, 室溫下終止消化10 min，DMEM培養(yǎng)液漂洗l次，用吸管在含200 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中將消化后的組織塊吹打成細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板。置于37 ℃ 、50 mL/L CO2孵箱，培養(yǎng)5～7 d，每隔2～3 d半量換液1次。

三、機(jī)械損傷模型建立

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)以10 μL移液器塑料滴頭于培養(yǎng)皿內(nèi)劃割培養(yǎng)的神經(jīng)元，橫豎各9道，造成神經(jīng)元機(jī)械損傷。

四、皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)染

在體外培養(yǎng)7 d后，皮層神經(jīng)元細(xì)胞可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染根據(jù)脂質(zhì)體RNA轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書進(jìn)行。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，miR-124模擬物和轉(zhuǎn)染劑的比例為5 ∶3。miR-124模擬物(2.5 μL)和轉(zhuǎn)染劑(1.5 μL)融入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(neurobasal-A)中使轉(zhuǎn)染液總體積為500 μL，室溫下孵育20 min。將轉(zhuǎn)染液分別加入相應(yīng)的分組神經(jīng)元的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染6 h。轉(zhuǎn)染6 h后，將轉(zhuǎn)染液更換為neurobasal-A，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后備用。miR-124抑制劑和陰性對照以相同方法進(jìn)行處理，備用。

五、實(shí)驗(yàn)分組

在體外培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞被隨機(jī)分為5組：對照組、機(jī)械損傷組、機(jī)械損傷+ miR-124抑制劑組(inh-124)、機(jī)械損傷+miR-124模擬物組(mimic-124)和機(jī)械損傷+miR-124陰性對照組(NC-124)。其中，TBI組分為六個(gè)亞組，分別為：1 h、6 h、 12 h、24 h、72 h和144 h (n=3)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分組在實(shí)驗(yàn)后的觀察結(jié)果，選取創(chuàng)傷后24 h這一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行inh-124、mimic-124和NC-124組的觀測。

六、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測各組miR-124表達(dá)量變化

按Trizol說明書提取皮層神經(jīng)元組織中的總RNA。按SYBR Green Master Mix Kit說明書操作，實(shí)時(shí)定量PCR儀擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參照，用2-△△ct方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組miR-124的表達(dá)差異。miR-124及U6引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，miR-124及U6引物序列為：miR-124上游：5'- TA AGGCACGCGGTGAATG-3'，下游:5'-GTGCAGGGTC CGAGGT-3'，U6上游：5'-TGGCCCCTGCGCAAGGATG-3'，下游：5'- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

七、Western Blot檢測Nrp-1、Tau、Gap-43表達(dá)量的變化

取相應(yīng)皮層神經(jīng)元組織，加入動(dòng)物細(xì)胞蛋白裂解液1 mL，冰上充分勻漿；12 000 r/min，離心20 min，收集上清液；BCA法蛋白定量；聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；麗春紅染膜后按蛋白分子量裁剪硝酸纖維素膜；20 mL含5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液(tris buffered saline tween, TBST)室溫封閉1 h；Nrp-1(1 ∶4000)、Tau(1 ∶10 000)、Gap-43(1 ∶15 000)與β-actin (1 ∶3000)抗體4 ℃ 孵育過夜；TBST洗10 min×3次后再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶15 000)室溫孵育1 h；TBST洗10 min×3次后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯色，暗室曝光、顯影和定影。用Image J圖像分析系統(tǒng)測定條帶的灰度值，選擇β-actin作為內(nèi)參照，以相應(yīng)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值的結(jié)果表示各蛋白表達(dá)水平。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、機(jī)械損傷后miR-124 表達(dá)水平變化

實(shí)驗(yàn)組損傷后各時(shí)間點(diǎn)的miR-124表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，創(chuàng)傷后1 h、6 h、12 h、24 h、72 h和144 h其相對表達(dá)水平分別為對照組的(1.53±0.22) 倍、(2.57±0.31) 倍、(4.19±0.29) 倍、(3.88±0.18) 倍、(2.98±0.17) 倍、(1.87±0.39) 倍，且于損傷后12 h表達(dá)量最高，之后呈下降趨勢，到144 h其表達(dá)水平仍高于對照組(P<0.05)，如圖1所示。

二、機(jī)械損傷后Nrp-1、Tau、Gap-43表達(dá)水平變化

實(shí)驗(yàn)組Nrp-1表達(dá)量于1 h開始上升，24 h達(dá)高峰后逐漸下降，總體表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組Tau在損傷后表達(dá)量持續(xù)上升，到72 h時(shí)表達(dá)量最高，之后下降，總體表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組Gap-43在創(chuàng)傷后6 h表達(dá)才開始升高，在6 h、12 h、24 h時(shí)高表達(dá)(P<0.05)，之后表達(dá)下降，在144 h時(shí)表達(dá)量與對照組無顯著差異(P>0.05)，如圖2所示。

圖1 實(shí)時(shí)PCR法檢測在不同時(shí)間點(diǎn)miR-124的相對表達(dá)量與正常對照組比較

Fig 1 The relative expression of miR-124 at different time points comparing to the sham group detected by RT-PCR

aP<0.05,vssham group.

圖2 Western Blot法檢測在不同時(shí)間點(diǎn)Nrp-1、Tau、Gap-43的相對表達(dá)量與正常對照組比較

Fig 2 The relative expressions of Nrp-1, Tau and Gap-43 at different time points comparing to the sham group detected by Western Blot

A: Western Blot for Nrp-1，Tau，Gap-43; B: Statistical representation for the expression of Nrp-1; C: Statistical representation for the expression of Tau; D: Statistical representation for the expression of Gap-43.

aP<0.05,vssham group;bP>0.05,vssham group.

三、轉(zhuǎn)染后miR-124的表達(dá)對Nrp-1、Tau、Gap-43的影響

我們選取創(chuàng)傷后24 h這一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行對比，因?yàn)樵谏鲜鰧?shí)驗(yàn)中，此時(shí)的miR-124、Nrp-1、Tau和Gap-43的相對表達(dá)量改變均較顯著。轉(zhuǎn)染miR-124 mimic和inhibitor后， miR-124的相對表達(dá)量與對照組有顯著差異，分別為6.88±0.78和0.35±0.06(P<0.05)。而miR-124 negative control組與對照組無顯著差異(P>0.05)，如圖3所示。在相同時(shí)間點(diǎn)，Nrp-1、Tau和Gap-43的相對表達(dá)量均顯著降低，且miR-124 inhibitor組降低較miR-124 mimic顯著(P<0.05)，如圖4所示。

圖3 RT-PCR法檢測機(jī)械損傷后24 h時(shí)各組miR-124的相對表達(dá)量

Fig 3 The relative expressions of miR-124 of all groups at 24 h after mechanical injury detected by RT-PCR

aP<0.05,vssham group;bP>0.05,vssham group.

圖4 Western Blot法檢測創(chuàng)傷后24 h時(shí)各組的Nrp-1、Tau、Gap-43的表達(dá)量變化

Fig 4 The relative expressions of Nrp-1, Tau and Gap-43 of all groups at 24 h after mechanical injury detected by Western Blot

A: Western Blot for Nrp-1, Tau and Gap-43 of all groups at 24 h after mechanical injury; B: Statistical representation for the expression of Nrp-1; C: Statistical representation for the expression of Tau; D: Statistical representation for the expression of Gap-43.

aP<0.05,vssham group;bP>0.05,vssham group;cP<0.05,vsinh-124 group.

討 論

TBI致死率和致殘率極高，是神經(jīng)外科最常見的嚴(yán)重疾患，其診斷、治療和預(yù)后判斷都是難點(diǎn)。雖然在中樞神經(jīng)損傷后，由于多重附加因素針對再生的阻礙作用和環(huán)境對于固有再生能力的對抗作用，導(dǎo)致軸突再生困難，但目前研究[4]已肯定小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的可塑性。在生理和病理刺激情況下，“休眠”狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞激活，進(jìn)入增殖分化階段，并遷入特定區(qū)域，替代并修復(fù)受損的神經(jīng)元，在一定程度改善神經(jīng)功能缺損[5]。然而只有再生軸突的定向生長及其與靶組織的正確連接才是神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵。目前我們認(rèn)為，只有促進(jìn)更多的神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生足夠多的軸突，才更有利于研究如何對其進(jìn)行正確引導(dǎo)而致靶。

近年來，microRNA對神經(jīng)元的再生和軸突修復(fù)的機(jī)制研究是熱點(diǎn)。Cheng等[6]發(fā)現(xiàn)敲除內(nèi)源性miR-124可以使室管膜下區(qū)(subventricular zone, SVZ)的神經(jīng)干細(xì)胞一直處于分裂前體狀態(tài)，而過表達(dá)miR-124則導(dǎo)致SVZ神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[7-8]。此項(xiàng)研究雖然成功通過上調(diào)miR-124促進(jìn)了神經(jīng)元的分化，但在軸突的功能恢復(fù)上未見報(bào)道。另有研究表明[9]，在神經(jīng)發(fā)育過程中，如果miR-124基因缺失，會(huì)使小鼠大腦體積變小、軸突生長缺陷、甚至神經(jīng)細(xì)胞死亡等重大發(fā)育表型變化。本研究選擇了三種蛋白通過Western Blot法檢測其相對表達(dá)量的變化：Nrp-1(Neuropilion-1)是軸突生長受體蛋白，可以決定軸突的命運(yùn)，研究證實(shí)[10-11]，Sema3A(Semaphorin的家族成員)是一種抑制性軸突導(dǎo)向因子。在中樞損傷部位及周圍組織中，Sema3A和Nrp-1過表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致軸突生長錐坍塌和軸突過早停止生長，阻礙著新的軸突網(wǎng)絡(luò)建立。Tau蛋白是含量最高的微管相關(guān)蛋白，它集中表達(dá)于神經(jīng)元軸突。正常腦中Tau蛋白的細(xì)胞功能是與微管蛋白結(jié)合促進(jìn)其聚合形成微管；與形成的微管結(jié)合，維持微管穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離，并誘導(dǎo)微管成束[12]，可以作為神經(jīng)元軸突生長的標(biāo)記蛋白。GAP-43是一種軸突膜蛋白，為神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)細(xì)胞分化和突觸發(fā)育形成[13]。它能調(diào)解軸突延伸，改變細(xì)胞形態(tài)，作為細(xì)胞內(nèi)信號，可大大增強(qiáng)與G蛋白偶聯(lián)的受體轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

本研究在C57BL/6小鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)機(jī)械損傷模型[14]的基礎(chǔ)上，觀察到傷后1 h，miR-124表達(dá)開始增多，12 h即達(dá)最高峰，24 h、72 h、144 h逐漸減少，但仍高于對照組。通過Western Blot法檢測我們觀察到在創(chuàng)傷后Nrp-1、Tau和Gap-43的表達(dá)較對照組均顯著升高(P<0.05)，miR-124的變化與之呈正相關(guān)。證明了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元損傷后的軸突再生和修復(fù)可能與miR-124存在密切的關(guān)系。我們選取miR-124和Nrp-1、Tau、Gap-43均顯著表達(dá)的創(chuàng)傷后24 h作為觀察的時(shí)間點(diǎn)，將實(shí)驗(yàn)組分為mimic-124 mimic、inh-124和NC-124三個(gè)亞組，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)對此時(shí)間點(diǎn)的miR-124表達(dá)進(jìn)行干預(yù)。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測，過表達(dá)或抑制miR-124表達(dá)，都不利于軸突的再生修復(fù)。其中，相比于過表達(dá)miR-124，在抑制miR-124表達(dá)后，軸突的修復(fù)受到的阻礙更明顯。所以，只有適量的miR-124高表達(dá)，才更有利于損傷后的軸突修復(fù)。而這個(gè)濃度梯度目前還不清楚，有待研究的進(jìn)一步深入探討?；贜rp-1和Tau在軸突的再生修復(fù)過程中的重要作用和GAP-43在神經(jīng)再生[15]和軸突修復(fù)中扮演著十分重要的角色，結(jié)合本研究我們可以初步推測：在神經(jīng)元機(jī)械損傷后的病理狀態(tài)下，大量miR-124被表達(dá)并可能參與神經(jīng)元分化[6,16]和軸突的再生與修復(fù)。適度的miR-124高表達(dá)對軸突的生長尤為重要。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在體外神經(jīng)元損傷模型中證實(shí)了適當(dāng)?shù)膍iR-124高表達(dá)可能與軸突再生有密切聯(lián)系。但是，就目前小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)自發(fā)進(jìn)行的軸突修復(fù)，能否正確的發(fā)出生長錐并與靶細(xì)胞產(chǎn)生有功能的連接，還有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。正確引導(dǎo)軸突生長和致靶才是恢復(fù)機(jī)體功能的關(guān)鍵，這是今后研究的一個(gè)目標(biāo)?？傊琺iR-124的這種時(shí)間和空間特異性表達(dá)，為我們深入研究TBI后神經(jīng)元軸突再生的機(jī)制提供了新思路。

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DynamicchangeandsignificanceofmiR-124invitroaftermechanicaldamageofcorticalneuronsinmice

SUXinhong,YEYuqin,YANGYongxiang,HEXiaosheng

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe changes of microRNA-124 (miR-124) in vitro after mechanical damage of cortical neurons, and the influence of miR-124 on axon regeneration and repair after traumatic brain injury in mice were explored.MethodsPrimary cortical neurons were obtained from fetal C57BL/6 mice and cultivated for 7 d. Petri dishes were manually scratched with a 10 μL plastic stylet needle following a 9×9 square grim. Cells were collected at 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h and 144 h after injury for experiments. The real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot were used to test the relative expressions of miR-124 and Neuropilin-1 (Nrp-1), microtubule-associated protein tau (Tau), growth associated protein 43 (Gap-43), respectively. Then miR-124 mimic and inhibitor were used to intervene the cortex neuron in vitro to observe how the change of miR-124 expression quantity affected the experiment.ResultsMiR-124, Nrp-1, Tau and Gap-43 were significantly increased after mechanical damage of cortical neurons (P<0.05) and there was a positive correlation between them. The miR-124 mimic and inhibitor were significantly increased and decreased the expression of miR-124 respectively and then caused a significant reduction in the expressions of Nrp-1, Tau, Gap-43 and the decrease in inhibitor group was more significant than that of mimic group (P<0.05).ConclusionModerate high expression of miR-124 may be closely related to the axon regeneration. The result provides the experimental basis for regulating the expression of miR-124 gradually to regulate neural axon regeneration and restoration.

Mechanical damage; MiR-124; Axon regeneration and repair

1671-2897(2017)16-229-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81471264)

蘇鑫洪，碩士研究生，E-mail: xhsu1987@sina.com

*通訊作者： 賀曉生，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail: hexiaos@fmmu.edu.cn

R 651

A

2016-09-18；

2017-01-07)