李旭，許榮譽

(福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院，福建泉州 362000)

食管癌組織中Cystatin C表達變化及意義

李旭，許榮譽

(福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院，福建泉州 362000)

目的觀察食管癌組織中半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C)的表達變化，并探討其意義。方法食管癌組織及癌旁正常組織各120例份，分別采用免疫組化法、實時熒光定量PCR法檢測其Cystatin C，分析Cystatin C表達與食管癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后(按照Cystatin C表達水平分為高表達組91例、低表達組29例)的關(guān)系。結(jié)果食管癌、癌旁組織Cystatin C蛋白陽性表達率分別為75.83%(91/120)、24.17%(29/120)，兩組比較，P<0.05；食管癌、癌旁組織Cystatin C mRNA相對表達量分別為1.68±0.24、1.12±0.31，兩組比較，P<0.05。Cystatin C表達與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度無關(guān)(P均>0.05)。高表達組、低表達組術(shù)后5年總生存率分別為8.79%(8/91)、34.48%(10/29)，術(shù)后生存時間分別為(29.19±2.07)、(45.58±2.96)個月，兩組比較，P均<0.05。結(jié)論食管癌組織中Cystatin C表達升高，其表達與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者預(yù)后相關(guān)；Cystatin C可以作為食管癌患者診斷、預(yù)后預(yù)測的指標以及治療的潛在靶點。

食管癌；食管腫瘤；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，居全球六大致死性腫瘤之列[1]。我國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率和病死率均居世界之首[2]。近年來，以手術(shù)為主的多學科綜合治療方案取得了巨大進展，但并未顯著延長食管癌患者術(shù)后生存時間，其5年總體生存率為15%～25%[3,4]。大多數(shù)食管癌患者術(shù)后死于原位復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[5]，尋找能夠預(yù)測或逆轉(zhuǎn)食管癌侵襲遷移的生物標記物是臨床上亟需解決的問題。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑之一，廣泛分布于機體組織的有核細胞和體液中，無組織學特異性。組織蛋白酶是一種存在于細胞溶酶體中的半胱氨酸蛋白酶超家族，Cystatin C能夠抑制組織蛋白酶的酶活性，阻止其對細胞間質(zhì)組織和基底膜的破壞作用，從而削弱腫瘤細胞的浸潤和遷移能力[6]，Cystatin與組織蛋白酶之間的表達失衡是導(dǎo)致腫瘤向外浸潤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素，與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[7]。目前，有關(guān)Cystatin C參與食管癌的惡性生物學行為的報道十分有限。Yan等[8]發(fā)現(xiàn)，在食管癌細胞系EC9706中增加Cystatin C表達后，細胞的侵襲能力被顯著抑制。本研究觀察了Cystatin C的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年6月～2012年6月福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院收治的食管癌患者120例，男74例，女46例；年齡26～79(57.47±13.62)歲，其中<60歲56例，≥60歲64例；腫瘤直徑>5 cm 80例，≤5 cm 40例；分化程度：低分化43例，中高分化77例；浸潤深度：黏膜下層、黏膜層44例，肌層37例，漿膜層39例；有淋巴轉(zhuǎn)移39例，無淋巴轉(zhuǎn)移81例；有遠處轉(zhuǎn)移64例，無遠處轉(zhuǎn)移56例；臨床分期：Ⅰ期75例，Ⅱ～Ⅳ期45例。納入標準：術(shù)后組織標本均經(jīng)HE染色明確，病理診斷為食管癌；具有完整的病歷資料；均簽署知情同意書。排除標準：術(shù)前進行放化療的患者，其他惡性腫瘤患者。手術(shù)留取食管癌組織標本及距離癌組織5 cm的癌旁正常組織各120例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 組織中Cystatin C蛋白檢測方法 采用免疫組化SP法檢測，所有組織樣本均經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片；經(jīng)二甲苯脫蠟，在100%、95%、85%的酒精浸泡水化，在98 ℃的枸櫞酸鈉溶液(pH 6.0)中浸泡15 min進行抗原修復(fù)，為降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育10～15 min，滴加正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，分別滴加Cystatin C一抗工作液(ab109508，美國Abcam公司，稀釋比1∶150)，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌3×5 min，滴加生物素二抗(上海合星生物科技有限公司，稀釋比1∶200)，室溫孵育30 min，PBS洗滌3×5 min，DAB顯色(武漢博士德生物工程有限公司)，充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。以PBS替代一抗作陰性對照。隨機選取10個含有陽性細胞的10倍視野進行觀察。陽性細胞所占比例：無陽性細胞為0分，≤25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；染色程度：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分；按陽性細胞所占比例和染色程度綜合判定，二者之和>3分為陽性表達，≤3分為陰性表達。

1.3 組織中Cystatin C mRNA檢測方法 采用實時熒光定量PCR法(qRT-PCR法)。TRIzol法提取組織總RNA(美國Invitrogen公司)，按照RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)的說明書操作。紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR引物序列(南京金斯瑞生物科技公司)如下，Cystatin C正向引物：5′-TCCAGTCCCGGCAAGCCGCCGC-3′，反向引物5′-CTAGGCGTCCTGACAGGTGGATTTC-3′；GAPDH正向引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反向引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。定量PCR擴增儀(ABI 7500，美國ABI公司)檢測Cystatin C。qRT-PCR擴增體系為10 μL，反應(yīng)條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，進行35個循環(huán)。用2-ΔΔCt方法表示Cystatin C mRNA相對表達量。

1.4 患者預(yù)后隨訪 采用電話或者門診的方式進行隨訪，隨訪時間為手術(shù)后1～60個月，直至患者死亡或者隨訪時間截止。

2 結(jié)果

2.1 食管癌、癌旁組織Cystatin C表達比較 免疫組化檢測顯示，食管癌、癌旁組織Cystatin C蛋白陽性表達率分別為75.83%(91/120)、24.17%(29/120)，兩組比較，P<0.05；食管癌、癌旁組織Cystatin C mRNA相對表達量分別為1.68±0.24、1.12±0.31，兩組比較，P<0.05。

2.2 Cystatin C表達與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表1。由表1可知，Cystatin C表達與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度無關(guān)(P均>0.05)。

表1 Cystatin C表達與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 Cystatin C表達與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系 將120例食管癌患者按照Cystatin C表達水平分為高表達組(癌組織中Cystatin C蛋白染色強度大于對應(yīng)的癌旁正常組織，91例)、低表達組(癌組織中Cystatin C蛋白染色強度小于對應(yīng)的癌旁正常組織，29例)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果顯示高表達組、低表達組術(shù)后5年總生存率分別為8.79%(8/91)、34.48%(10/29)，術(shù)后生存時間分別為(29.19±2.07)、(45.58±2.96)個月，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

食管癌是一種致死率極高的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約48萬[2]。食管癌早期患者的術(shù)后5年總生存率高達70%[9]，然而大多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，對周圍組織的浸潤侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致食管癌患者預(yù)后不良的主要原因[10]。食管癌具有明顯家族聚集性和地域性，提示食管癌的發(fā)生發(fā)展與環(huán)境因素、遺傳因素密切相關(guān)，然而其確切的發(fā)生發(fā)展機制并未完全闡明。

Cystatin C由CST3基因編碼，分子量約13 kD，是一種非糖化的堿性蛋白質(zhì)，臨床上被廣泛用于評價腎小球濾過功能[11]。Cystatin C在人體各種生理和病理過程發(fā)揮重要作用，當基因突變發(fā)生后，會引發(fā)遺傳性Cystatin C淀粉樣血管病，進而導(dǎo)致腦出血等疾病，這是近年來臨床發(fā)現(xiàn)的與Cystatin C直接相關(guān)的疾病，Cystatin C在心血管系統(tǒng)疾病的研究已取得了巨大成果[12]。Cystatin C與腫瘤之間的關(guān)系已成為近年研究的熱點，近年研究[13]顯示，Cystatin C作為組織蛋白酶抑制劑，與組織蛋白酶相互作用，共同參與腫瘤的發(fā)生和惡性進展過程。Gursoy等[14]發(fā)現(xiàn)，卵巢腫瘤組織中Cystatin C水平明顯高于良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織。Zhang等[15]也發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患者血清中，Cystatin C處于高表達狀態(tài)。李靜等[16]發(fā)現(xiàn)，Cystatin C處理乳腺癌MCF-7細胞，導(dǎo)致細胞增殖能力下降。然而，Wegiel等[17]則發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中Cystatin C表達水平低于前列腺良性腫瘤組織。

本研究顯示，食管癌組織Cystatin C蛋白、mRNA表達均高于癌旁正常組織，此結(jié)果與Zeng等[18]的檢測結(jié)果一致，提示Cystatin C與食管癌發(fā)生機制密切相關(guān)，可以作為診斷食管癌的有效指標之一。本研究發(fā)現(xiàn)，Cystatin C表達與食管癌淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，且Cystatin C表達水平越高，預(yù)示著可能已經(jīng)發(fā)生了淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及處于腫瘤中晚期，提示Cystatin C參與并且促進了食管癌惡性進展，此結(jié)果與Kume等[19]在食管癌中的研究結(jié)果一致，Cystatin C可以作為食管癌患者不良預(yù)后的指標。而何琳莉等[20]發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中Cystatin C表達陽性率低于癌旁正常組織，并且Cystatin C表達水平并不影響食管癌患者的5年生存率，與患者預(yù)后無關(guān)。本研究認為，惡性腫瘤組織中Cystatin C表達升高，可能是由于機體反饋調(diào)節(jié)機制的作用，隨著腫瘤的惡性進展，腫瘤組織中組織蛋白酶表達增加，活性增強，反饋性地引起Cystatin C表達的增加。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Cystatin C表達水平對食管癌患者術(shù)后生存時間的影響，Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，Cystatin C高表達食管癌患者的術(shù)后5年總生存率僅為8.79%，且Cystatin C高表達食管癌患者的術(shù)后生存時間顯著低于Cystatin C低表達的食管癌患者，上述結(jié)果提示Cystatin C高表達與食管癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)。而Cystatin C通過哪些途徑導(dǎo)致食管癌惡性進展以及不良預(yù)后，仍有待于進一步的探索研究。再者，由于本研究的實驗樣本數(shù)有限，為了得到更可靠的結(jié)論，仍然需要擴大樣本量進行深入驗證。

總之，Cystatin C在食管癌組織中發(fā)揮促癌基因的功能，促進食管癌的發(fā)生和惡性發(fā)展，且Cystatin C表達越高，患者預(yù)后越差。Cystatin C有可能作為食管癌患者預(yù)后預(yù)測及治療的潛在靶點。

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2017-07-18)