吳星星，蔡擴(kuò)軍

（烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063）

新疆烏魯木齊市生鮮乳中金黃色葡萄球菌污染狀況及耐藥性分析

吳星星，蔡擴(kuò)軍

（烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063）

為了解新疆烏魯木齊市生鮮乳中金黃色葡萄球菌的污染及耐藥情況，采集該地區(qū)生產(chǎn)與銷售環(huán)節(jié)生鮮乳104份，利用Baird-Parker培養(yǎng)基平板和顯色培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)、純化細(xì)菌；采用革蘭氏染色、熒光PCR、全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：檢出金黃色葡萄球菌陽性乳35份，陽性率為33.7%；分離菌株對(duì)青霉素等15種抗生素存在不同水平的耐藥性。結(jié)果表明，烏魯木齊市生鮮乳中金黃色葡萄球菌污染與耐藥情況較嚴(yán)重。結(jié)果提示，要加強(qiáng)乳品安全生產(chǎn)管理，規(guī)范動(dòng)物飼料和獸藥生產(chǎn)，以及動(dòng)物飼養(yǎng)管理中抗生素的使用與添加，以保證乳品品質(zhì)安全，維護(hù)公共衛(wèi)生健康。

生鮮乳；金黃色葡萄球菌；分離鑒定；污染狀況；耐藥性

金黃色葡萄球菌廣泛存在于空氣、水、灰塵，以及人和動(dòng)物的皮膚、化膿性病灶、排泄物等處[1]，是引起奶牛乳房炎、造成牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要致病菌。該菌產(chǎn)生的腸毒素可耐受100 ℃ 30 min而不被破壞，并仍有致病性[2]。有研究報(bào)道，100 g食物中的腸毒素含量達(dá)18 μg時(shí)，即可引起食物中毒[3-4]。牛奶營養(yǎng)豐富，非常適合金黃色葡萄球菌生長與繁殖。人食用金黃色葡萄球菌污染的牛奶后，會(huì)表現(xiàn)嘔吐、發(fā)熱、脫水，甚至休克等癥狀，對(duì)食用者身體健康危害極大[5]。本實(shí)驗(yàn)采集烏魯木齊市生產(chǎn)與銷售環(huán)節(jié)生鮮乳樣104份，從中分離鑒定金黃色葡萄球菌，并對(duì)其耐藥性進(jìn)行分析。

1 材料

1.1 樣品

采集烏魯木齊市生產(chǎn)與銷售環(huán)節(jié)生鮮乳104份，包括牛乳82份、駝乳22份。另外，以6份巴氏及超高溫消毒牛乳作為對(duì)照。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

氯化鈉肉湯（7.5%）、革蘭氏染色液：北京陸橋生物技術(shù)有限公司；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基：法國科瑪嘉公司；金黃色葡萄球菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒：深圳澳東生物科技有限公司。

1.3 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供。

1.4 藥敏紙片

藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.5 主要儀器設(shè)備

熒光PCR儀（7500型）：美國ABI公司；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK-2-Compact型）：法國梅里埃公司；電子微生物顯微鏡：美國賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法

2.1 分離培養(yǎng)

試驗(yàn)中，均以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參考對(duì)照。具體操作如下：待樣品采回后，立即將其按照1:10的比例，加入到7.5%的氯化鈉肉湯中，充分混勻，37 ℃增菌培養(yǎng)18～24 h；接種增菌液至Baird-Parker平板，37 ℃培養(yǎng)2 d；挑取可疑菌落接種至科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；挑取粉色單菌落，再次劃線接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)菌純化，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；挑取粉色單菌落，進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)。

2.2 鑒定

2.2.1革蘭氏染色鏡檢 挑取純化的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察分離菌落的染色特征。

2.2.2熒光PCR鑒定 用接種環(huán)挑取純化單菌落至裝有100 μL生理鹽水的潔凈離心管中，分別加入10 μL蛋白酶K溶液、200 μL裂解液，充分混勻，12 000 r/min離心1 min；廢棄收集管內(nèi)液體，加入洗液500 μL，12 000 r/min離心1 min；棄去管中廢液，加入500 μL無水乙醇，12 000 r/min離心1 min；棄去管中廢液，繼續(xù)12 000 r/min離心3 min；棄去廢液，將提取柱放入另一干凈離心管中，放置3 min；在柱膜中央，加入50～100 μL洗脫液，放置1 min，12 000 r/min離心1 min，收集提取的DNA。反應(yīng)體系配置：在干凈滅菌的離心管內(nèi)，依次加入反應(yīng)液、熒光探針、酶，以及提取的DNA，混勻成25 μL反應(yīng)體系，置于熒光PCR反應(yīng)儀中作用90 min，然后讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判定：陽性對(duì)照Ct值小于30.0，陰性對(duì)照Ct值為none，被檢樣品呈現(xiàn)出明顯的S型曲線，且Ct值≤30.0時(shí)，判為陽性。

2.2.3生化鑒定 挑取純化單菌落進(jìn)行細(xì)菌麥?zhǔn)蠞岫扰浔?；待菌液麥?zhǔn)蠞岫葴y(cè)定值達(dá)到1.2時(shí)，放入全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK-2-Compact中生化反應(yīng)1 h。結(jié)果判定：鑒定報(bào)告單英文顯示金黃色葡萄球菌全稱即“Staphylococcus”時(shí)，表示分離的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法[6]，對(duì)分離鑒定株進(jìn)行17種抗菌藥物的耐藥性檢測(cè)：將待檢菌落劃線接種至MH液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；次日，用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL；吸取100 μL菌液至MH瓊脂平板；用涂布器涂抹均勻，室溫放置5 min；在瓊脂平板上貼上藥敏紙片，室溫放置吸收5 min；37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h后，測(cè)量形成的抑菌圈直徑。

3 結(jié)果

3.1 革蘭氏染色鏡檢

顯微鏡下可觀察到呈紫紅色的，形態(tài)呈葡萄串狀、鏈狀，單個(gè)或成對(duì)存在的革蘭氏陽性菌（圖1）

3.2 熒光PCR鑒定

對(duì)分離純化的可疑菌落進(jìn)行熒光PCR鑒定。結(jié)果顯示，陰陽性對(duì)照成立，被檢樣品與陽性對(duì)照一致，陽性樣品呈現(xiàn)出明顯的S型檢測(cè)曲線，且檢測(cè)樣品Ct值小于30.0，說明符合試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)（圖2）。

圖1 分離純化細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果

圖2 分離純化菌熒光PCR鑒定結(jié)果

3.3 生化鑒定

利用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK-2-Compact，對(duì)分離純化菌進(jìn)行生化鑒定，發(fā)現(xiàn)報(bào)告單顯示英文“Staphylococcus”，即檢測(cè)細(xì)菌被鑒定為金黃色葡萄球菌。

3.4 藥敏試驗(yàn)

對(duì)分離的35株金黃色葡萄球菌進(jìn)行17種抗生素藥物的敏感實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離鑒定的金黃色葡萄球菌對(duì)15種抗生素存在一定程度的耐藥。其中，對(duì)青霉素、紅霉素、甲氧嘧啶、四環(huán)素4種抗生素敏感性較高，耐藥率分別為91.4%、40.0%、40.3%、40.0%、31.4%，對(duì)萬古霉素和利奈唑胺無耐藥性。具體耐藥情況見表1。

4 討論

食源性致病菌污染是導(dǎo)致出現(xiàn)食品安全問題的重要原因之一。本次共檢測(cè)104份乳樣，檢出金黃色葡萄球菌陽性樣品35份（陽性率為33.7%），均為生鮮散乳，包括34份生鮮散牛乳和1份駝乳，而市售6份企業(yè)巴士消毒奶和超高溫消毒奶檢測(cè)均無菌。這提示烏魯木齊市生鮮乳中存在金黃色葡萄球菌污染。分析原因可能為：（1）金黃色葡萄球菌是引發(fā)奶牛乳房炎的重要病原之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全球奶牛乳房炎發(fā)病率高達(dá)33%。我國是養(yǎng)殖奶牛乳房炎的高發(fā)國家，其中隱性乳房炎發(fā)生率占50%。隱性乳房炎病牛乳房組織和所產(chǎn)牛奶的肉眼變化不明顯，因此擠奶時(shí)多不易被發(fā)現(xiàn)。但由于擠出的牛奶中含有金黃色葡萄球菌，因此對(duì)食用者身體健康會(huì)造成一定威脅[7]。為此，建議在日常飼養(yǎng)管理中，養(yǎng)殖（場(chǎng)）戶應(yīng)加強(qiáng)衛(wèi)生消毒工作，堅(jiān)決不擠患病牛的奶；對(duì)于健康牛，擠奶前應(yīng)注意對(duì)乳區(qū)進(jìn)行徹底消毒，并對(duì)擠出的奶及時(shí)冷藏保存，以防止細(xì)菌大量繁殖并產(chǎn)生相應(yīng)毒素[8]。（2）在乳品生產(chǎn)與銷售環(huán)節(jié)，由于資金限制，散養(yǎng)戶、部分養(yǎng)殖場(chǎng)均采用傳統(tǒng)手工方式擠奶。當(dāng)日產(chǎn)的鮮奶多盛裝于塑料或鋁制桶中，然后送至奶吧、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、小區(qū)超市等居民區(qū)就近零售點(diǎn)，或交于乳品收購點(diǎn)，由其用一次性食品袋打包銷售給市民。乳品從產(chǎn)出到餐桌經(jīng)歷了手工擠奶、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏、銷售等多個(gè)環(huán)節(jié)，在銷售過程中，又反復(fù)打開奶桶，導(dǎo)致鮮奶與空氣多次直接接觸，因而增加了乳品污染的機(jī)會(huì)。相比之下，大型乳品企業(yè)資金充足，均采用機(jī)械方式擠奶；生產(chǎn)的鮮奶先經(jīng)巴氏或超高溫消毒，再經(jīng)抽檢合格獨(dú)立包裝后上市銷售，因而保證了乳品無菌，降低了食用乳品中毒的風(fēng)險(xiǎn)。

表1 35株金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

本次藥敏試驗(yàn)顯示，分離鑒定的35株金黃色葡萄球菌對(duì)17種抗生素存在一定的耐藥性。其中，對(duì)青霉素耐藥水平最高，達(dá)91.4%；其次是紅霉素、甲氧嘧啶和四環(huán)素，耐藥率分別為40.0%、40.0%、31.4%；耐藥水平最低的為利福平和替考拉寧，耐藥率均為2.9%；剩余的9種抗生素耐藥范圍為8.6%～22.9%。青霉素耐藥率最高，表明日常奶牛疾病治療當(dāng)中，存在養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）不合理使用青霉素現(xiàn)象。青霉素的不合理使用促使耐藥菌株大量繁殖，使其產(chǎn)生B-內(nèi)酰胺酶。B-內(nèi)酰胺酶可水解青霉素的B-內(nèi)酰胺酶環(huán)，形成青霉素噻唑酸，從而使其失去抗菌活性[9]。為規(guī)范抗生素的合理使用，保證乳品安全及動(dòng)物疫病的科學(xué)防治，首先建議相關(guān)部門要加大抗生素生產(chǎn)及使用的管理力度，規(guī)范動(dòng)物飼料、獸藥的生產(chǎn)銷售，杜絕隨意添加和使用抗生素。其次，養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）在日常飼養(yǎng)管理用藥中，應(yīng)減少對(duì)抗生素的濫用和依賴，尤其是青霉素；在疾病治療中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際藥敏檢測(cè)結(jié)果，科學(xué)選擇抗生素，并根據(jù)藥物使用說明書，嚴(yán)格遵守用藥與休藥時(shí)間；在進(jìn)行動(dòng)物疾病監(jiān)測(cè)的同時(shí)，應(yīng)開展病原菌藥物敏感性動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)追蹤病原菌耐藥情況，因地制宜，優(yōu)化藥物使用方案，在提高疫病防治的同時(shí)，避免同種抗生素的多次使用，以防耐藥菌株的產(chǎn)生和增加[10]。

另外，研究顯示，一些中藥對(duì)細(xì)菌有較好的抑制作用，且不易產(chǎn)生耐藥性[11]，因此利用中藥治療耐藥細(xì)菌性疾病也是今后選擇和研究的一個(gè)方向。

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Contamination Status and Resistance Analysis of Staphylococcus aureus in Fresh Milk in Urumqi City of Xinjiang

Wu Xingxing，Cai Kuojun

（Urumqi Animal Disease Control and Diagnosis Center，Urumqi，Xinjiang 830063，China）

In order to investigate the contamination status and drug resistance of Staphylococcus aureus of fresh milk in Urumqi City of Xinjiang，a total number of 104 fresh milk samples were collected in production and sale process.The bacteria were isolated，cultured and purified by Baird-Parker agar and chromogenic medium. The suspected colonies were identified by Gram staining，fluorescence PCR and automatic microorganism identification system. The results showed that 35 positive samples of Staphylococcus aureus were detected，and the positive rate was 33.7%. The isolated strains were resistant to 15 kinds of antibiotics including Penicillin. The results indicated that the infection and drug resistance conditions of Staphylococcus aureus in fresh milk of Urumqi City were severe. It was suggested that the management of dairy production in this area should be strengthened，and the usage and addition of antibiotics in animal feed，veterinary drug production and animal raising management should be regulated，so as to ensure the quality and safety of dairy products and to maintain the public health.

fresh milk；Staphylococcus aureus；isolation and identification；contamination status；drug resistance

烏魯木齊市科技局應(yīng)用開發(fā)研究計(jì)劃渝烏科技合作項(xiàng)目（Y161220001）

蔡擴(kuò)軍

S852.61

A

1005-944X（2018）01-0017-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.005

朱迪國）