劉蓓 王芳 陳琳 余州 宋雅娟 王彤 蘇映軍

[摘要]目的：研究CD100分子在正常皮膚組織、急性創(chuàng)面及慢性創(chuàng)面中的表達(dá)。方法：采用免疫組化法檢測(cè)外科手術(shù)切除的20例正常皮膚組織、30例急性創(chuàng)面及20例慢性創(chuàng)面邊緣全層皮膚組織CD100的表達(dá)水平。結(jié)果：正常皮膚CD100主要表達(dá)于表皮，其中胞膜高表達(dá)，真皮不表達(dá)；急性創(chuàng)面中表皮CD100膜表達(dá)水平顯著降低；慢性創(chuàng)面中CD100在表皮組織低表達(dá)而真皮表達(dá)顯著升高。各組間表皮胞膜、胞質(zhì)及真皮中CD100表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：在皮膚組織損傷早期，表皮組織膜型CD100的脫落可能對(duì)創(chuàng)面愈合早期發(fā)揮重要作用，慢性創(chuàng)面CD100表皮持續(xù)性低表達(dá)、真皮高表達(dá)的狀態(tài)可能和創(chuàng)面難愈有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]創(chuàng)面愈合；CD100；免疫組織化學(xué)法；急性創(chuàng)面；慢性創(chuàng)面

[中圖分類號(hào)]R64 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）10-0133-04

Abstract： Objective To investigate the expression of CD100 in normal skin tissue， acute wound and chronic wound tissues. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD100 in 20 cases of normal skin tissues， 30 cases of acute wound and 20 cases of chronic wound tissues. Results The expression of CD100 in normal skin tissues was mainly expressed in the epidermis， and was not expressed in dermis. The expression level of membrane CD100 of epidermis in acute wound was significantly reduced. In the chronic wound， the expression level of CD100 in the epidermis was low， but the expression level in the dermis was increased significantly. The expression levels of CD100 in membrane and cytoplasm of epidermal and in dermis had statistical difference in the three groups （P<0.05）. Conclusion In the early skin tissue damage， shedding of membrane CD100 in epidermis may play an important role in acute wound healing. In chronic wounds， the condition of low CD100 expression in epidermis and the high CD100 expression in epidermis may be related to the difficulty of chronic wound healing.

Key words： wound healing； CD100； immunohistochemical method； acute wound； chronic wound

慢性難愈性創(chuàng)面，簡(jiǎn)稱慢性創(chuàng)面，指臨床治療4～6周以上仍難以愈合或不愈合的創(chuàng)面。臨床上常由糖尿病、靜脈曲張、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等所引起。在我國(guó)，伴隨著人口逐步老齡化，糖尿病、下肢靜脈潰瘍、褥瘡等疾病的發(fā)病率逐年上升，慢性創(chuàng)面的發(fā)生率越來越高，是目前外科臨床工作中經(jīng)常遇到的一個(gè)難題[1-2]。皮膚創(chuàng)傷愈合的病理生理過程非常復(fù)雜有序，涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的參與，構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些創(chuàng)面愈合的調(diào)控因素一旦表達(dá)異常或功能受損，就會(huì)造成創(chuàng)面不能按時(shí)相規(guī)律有序地進(jìn)行組織學(xué)修復(fù)，從而引起創(chuàng)面經(jīng)久不愈。因此，進(jìn)一步闡明急、慢性創(chuàng)面愈合的分子機(jī)制對(duì)于慢性創(chuàng)面的治療具有重要的意義。CD100（Semaphorin4D）屬于腦信號(hào)蛋白（Semaphorin）家族中的一員，在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中高表達(dá)[3]。CD100發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括神經(jīng)細(xì)胞軸突導(dǎo)向、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管生成等[3-6]。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CD100能夠調(diào)節(jié)多種皮膚細(xì)胞功能，包括促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞骨架重排、上皮細(xì)胞上皮化，樹突狀細(xì)胞的成熟等，CD100-/-小鼠較野生型小鼠相比創(chuàng)面愈合時(shí)間顯著延遲。而截止目前，還未有CD100與人皮膚組織創(chuàng)面愈合關(guān)系的臨床研究。在人皮膚組織創(chuàng)面愈合過程CD100的表達(dá)情況如何，在急性創(chuàng)面與慢性創(chuàng)面中CD100的表達(dá)格局是否有所差異，這種差異表達(dá)是否與創(chuàng)面難愈有關(guān)？為了回答上述問題，本研究選取臨床急性創(chuàng)面、慢性創(chuàng)面及正常組織標(biāo)本，用免疫組化染色的方法分析CD100分子在上述不同類型皮膚組織中的表達(dá)差異，為闡明CD100參與創(chuàng)面愈合過程的作用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床組織標(biāo)本

1.1.1 臨床樣本來源及一般資料：本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均取自2015年7月-2017年7月就診于西京醫(yī)院整形外科門診及住院患者外科手術(shù)切取的廢棄組織。研究?jī)?nèi)容及研究方案獲得西京醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并取得了患者或其監(jiān)護(hù)人的知情同意書。

急性創(chuàng)面患者均為急診外傷清創(chuàng)縫合的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：各種病因引起的慢性難愈性創(chuàng)面、嚴(yán)重感染創(chuàng)面、皮膚病及器質(zhì)性病變患者。共30例，男16例，女14例；平均年齡23（7～51）歲；患處分別為頭面部21例，肩部4例，下肢5例；致傷時(shí)間：1～9h，平均4h。

慢性創(chuàng)面患者：臨床已確診的全層皮膚組織缺失的慢性難愈性創(chuàng)面。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性外傷患者、創(chuàng)面使用過生長(zhǎng)因子藥物治療患者、皮膚病患者。共20例，男12例，女8例；平均年齡42（21～65）歲；分別為糖尿病足部潰瘍6例，胸腹部、下肢感染性創(chuàng)面6例，嚴(yán)重外傷等組織缺損創(chuàng)面8例。

正常對(duì)照取自整形外科手術(shù)中切取的廢棄皮膚組織，共20例，男11例，女9例；平均年齡23（1～55）歲；取樣部位為頭面部9例，四肢11例。

1.1.2 樣本的取材：所有臨床標(biāo)本的獲取均在無菌手術(shù)狀態(tài)下切取，創(chuàng)面標(biāo)本取材位置為創(chuàng)面邊緣全層皮膚組織，標(biāo)本大小為0.5cm×0.5cm×0.3cm，切取后的標(biāo)本立即浸泡于福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 材料：兔抗人CD100單克隆抗體，購自eptomics公司；二抗和DAB顯色液購自Dako公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色：對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行切片，將切片在60℃恒溫箱中烘烤5h后進(jìn)行脫蠟。二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ中浸泡各10min；在無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅲ中浸泡各10min，在95%乙醇、70%乙醇中浸泡各5min；自來水洗，磷酸鹽緩沖液PBS洗一次5min。新鮮配制枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液，用煮沸法進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)期間用溫度計(jì)控制溫度為95℃～98℃，修復(fù)時(shí)間為20min。待恢復(fù)到室溫后，2% H2O2/甲醇溶液中浸泡15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；5% BSA/PBST溶液室溫封閉1h；滴加1：200稀釋的一抗，同時(shí)每份標(biāo)本用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。4℃過夜；第2天取出切片，室溫條件下復(fù)溫20min，PBS洗10min；孵育二抗，室溫靜置1h；PBST洗3次，每次各10min；使用新鮮配置的DAB顯色試劑顯色；自來水洗1min；蘇木素復(fù)染1min，自來水洗1min，1%鹽酸乙醇分化30s，自來水洗反藍(lán)15min；脫水：95%乙醇5min，100%乙醇5min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min，吹干；樹膠封片，鏡檢觀察。

1.3.2 免疫組化結(jié)果的判讀：使用免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分法對(duì)CD100染色后的組織切片的免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行判讀。由病理醫(yī)生在不知曉病例臨床資料的前提下進(jìn)行讀片和評(píng)分，評(píng)分內(nèi)容包括兩部分：免疫組化陽性著色細(xì)胞數(shù)量和著色強(qiáng)度。其中陽性著色細(xì)胞數(shù)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0%～5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分；著色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無著色記0分，淡黃著色記1分，棕黃色著色記2分，棕褐色著色記3分。將兩組評(píng)分相乘即得到免疫強(qiáng)度評(píng)分。0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，行卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

根據(jù)上文所述的免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分方法，按照分四組的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每組的樣本量較少，為了便于統(tǒng)計(jì)，將CD100陰性及弱陽性表達(dá)的標(biāo)本合并為CD100低表達(dá)組，而將陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)的合并為CD100高表達(dá)組。免疫組化結(jié)果顯示，CD100分子在正常皮膚組織中主要表達(dá)于表皮，其中胞膜高表達(dá)90.0%（18/20），胞質(zhì)65.0%（13/20）高表達(dá)，而真皮組織中不表達(dá)。急性創(chuàng)面中表皮組織胞膜CD100表達(dá)水平較正常組織明顯降低，93.3%（28/30）低表達(dá)，胞質(zhì)63.3%（19/30）低表達(dá)，真皮組織CD100分子低表達(dá)86.7%（26/30）。慢性創(chuàng)面表皮組織CD100胞膜低表達(dá)90.0%（18/20），而真皮組織CD100表達(dá)顯著升高，65.0%（13/20）高表達(dá)。由表1可知，急、慢性創(chuàng)面組CD100在表皮細(xì)胞膜中的表達(dá)水平顯著低于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。三組間CD100在表皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013），其中慢性創(chuàng)面組較正常組織組表達(dá)顯著降低（P<0.05）。慢性創(chuàng)面組CD100在真皮中的表達(dá)較急性創(chuàng)面組和正常組織組顯著升高（P<0.001）。CD100在各類型組織中的染色結(jié)果見圖1～2。

3 討論

慢性創(chuàng)面的病因非常復(fù)雜，涉及諸多內(nèi)外因素。從宏觀上，組織絕對(duì)量不足、局部血液循環(huán)差及糖尿病等自身環(huán)境是造成創(chuàng)面難愈的病因[2，7]。從分子水平，某些刺激創(chuàng)面修復(fù)的蛋白、細(xì)胞因子表達(dá)異?；蚬δ苋毕菘赡苁且饎?chuàng)面難愈的分子機(jī)制[8]。CD100是腦信號(hào)蛋白中的一員，最初發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞軸突導(dǎo)向及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要作用。諸多研究表明，CD100能夠作用于皮膚組織的多種細(xì)胞類型，影響其生物學(xué)功能。上皮細(xì)胞表達(dá)CD100的高親和力受體神經(jīng)叢蛋白B1（PlexinB1），CD100結(jié)合PlexinB1后激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，加速上皮化進(jìn)程[9]；內(nèi)皮細(xì)胞也高表達(dá)PlexinB1，CD100能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的骨架重塑、遷移及微血管腔和分支結(jié)構(gòu)的形成[10-13]。血小板同時(shí)表達(dá)CD100及其受體CD72和Plexin-B1[14]，創(chuàng)傷引起的血管損傷后，血小板活化經(jīng)金屬蛋白酶ADAM17水解膜型CD100釋放可溶型CD100（sCD100）。sCD100結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[15]。Witherden等報(bào)道，在動(dòng)物創(chuàng)傷愈合模型中，小鼠樹突狀上皮γδ-T表面的CD100分子對(duì)于促進(jìn)創(chuàng)面愈合過程起關(guān)鍵作用。皮膚局部樹突狀上皮γδT細(xì)胞（dendritic epidermal γδT cells， DETCs）表達(dá)的CD100，結(jié)合受損上皮細(xì)胞表達(dá)的 Plexin-B2后，通過Erk和cofilin信號(hào)途徑使DETCs失去突起而變圓，并分泌角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF），誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移，恢復(fù)上皮層的完整性，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。CD100-/-小鼠中，創(chuàng)面愈合時(shí)間較野生型小鼠相比顯著延遲[16-17]。綜上所述，CD100在創(chuàng)面愈合的過程中發(fā)揮重要的作用。

本研究采用免疫組化法研究CD100在臨床急性創(chuàng)面、慢性創(chuàng)面及正常皮膚組織標(biāo)本的表達(dá)。結(jié)果顯示，在正常皮膚組織、急性創(chuàng)面以及慢性創(chuàng)面邊緣皮膚中，CD100呈現(xiàn)不同的表達(dá)格局：正常皮膚組織中CD100主要表達(dá)于表皮細(xì)胞膜，真皮不表達(dá)；急性創(chuàng)面中表皮CD100膜表達(dá)水平與正常組織相比顯著降低。有研究證實(shí)CD100分子胞外存在蛋白水解位點(diǎn)，金屬蛋白酶ADAM17、MT1-MMP均可以水解CD100分子從細(xì)胞膜上釋放出來[18-19]。細(xì)胞活化時(shí)膜型CD100易于脫落釋放，形成sCD100。因此推測(cè)急性創(chuàng)面膜型CD100表達(dá)降低可能由于皮膚組織受損時(shí)表皮細(xì)胞活化，膜型CD100分子被蛋白酶切割而從膜表面脫落，形成sCD100，這個(gè)過程可能對(duì)創(chuàng)面愈合的起始發(fā)揮重要作用。而慢性創(chuàng)面的CD100表達(dá)特征是表皮組織低表達(dá)而真皮表達(dá)顯著升高。慢性創(chuàng)面的病因復(fù)雜，影響因素眾多，大都存在創(chuàng)面感染、局部血供不良、營(yíng)養(yǎng)不良等共性因素；在分子水平，多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子水平發(fā)生改變，引起創(chuàng)面修復(fù)停留在炎癥期。推測(cè)慢性創(chuàng)面表皮CD100表達(dá)降低的原因可能同樣是由于膜型分子的脫落釋放。而CD100廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞，并且在淋巴細(xì)胞活化后表達(dá)顯著上調(diào)[20]，真皮CD100表達(dá)顯著升高的原因是由于慢性創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，炎性細(xì)胞表面高表達(dá)CD100，因此真皮組織CD100表達(dá)增高。本研究組利用糖尿病小鼠建立創(chuàng)面模型，給創(chuàng)面局部給予重組表達(dá)的sCD100蛋白，能夠通過促進(jìn)血管生成和減輕炎癥反應(yīng)來促進(jìn)創(chuàng)面愈合[21]。因此推測(cè)，慢性創(chuàng)面表皮持續(xù)性低表達(dá)CD100，不能刺激釋放sCD100致創(chuàng)面局部，而真皮免疫細(xì)胞高表達(dá)CD100的慢性炎癥狀態(tài)可能和創(chuàng)面難愈有關(guān)。

本研究的局限性在于沒有區(qū)分CD100表達(dá)的具體的細(xì)胞類型，且臨床標(biāo)本的數(shù)量較少，無法進(jìn)行相關(guān)性分析，后續(xù)仍需收集更多臨床標(biāo)本，對(duì)CD100調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

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[收稿日期]2018-06-12 [修回日期]2018-07-13

編輯/朱婉蓉