李天嬌, 黃 濤, 吳 華, 蘇 嶼, 符生苗, 符惠群, 王旭明, 龍文芳

(1 海南省人民醫(yī)院，海南 ?？?570311; 2 海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，海南 海口 570311)

·論著·

呼吸ICU耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌耐藥基因的攜帶情況及同源性

李天嬌1, 黃 濤1, 吳 華1, 蘇 嶼1, 符生苗1, 符惠群1, 王旭明1, 龍文芳2

(1 海南省人民醫(yī)院，海南 海口 570311; 2 海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，海南 海口 570311)

耐碳青霉烯酶; 鮑曼不動桿菌; 耐藥基因; 同源性分析

耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii, CRAB)已成為醫(yī)院感染中的重要病原菌之一，常引起嚴(yán)重的感染，特別是在免疫力低下的患者中，甚至可以引起致死性的感染[1]。碳青霉烯類抗生素是治療革蘭陰性桿菌的最后一道防線[2]，因此，碳青霉烯類抗生素在治療嚴(yán)重感染、復(fù)雜感染、多重耐藥菌感染有更好的療效，但隨著該類抗生素的廣泛應(yīng)用，目前CRAB菌株日益增多，給臨床治療帶來新的挑戰(zhàn)。近年來，多地報道了急診病房及重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)鮑曼不動桿菌的醫(yī)院感染暴發(fā)流行[3-4]。由于我院分離CRAB對臨床常用的抗菌藥物耐藥性比較嚴(yán)重，且多來源于呼吸ICU，因此，本研究收集呼吸ICU 3個月來臨床患者分離的CRAB 22株，分析其耐藥情況。碳青霉烯類抗生素耐藥的分子機制主要由于外源性獲得碳青霉烯酶，主要分為B類和D類酶，B類酶又稱為金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)，目前鮑曼不動桿菌中已被鑒別出獲得性的MBLs有IMP、VIM型酶等，D類酶為苯唑西林酶(OXA型酶)，在鮑曼不動桿菌中常見有bla-OXA23、bla-OXA24、bla-OXA51、bla-OXA58[5]；前幾年本地區(qū)的腸桿菌科細(xì)菌耐藥酶基因(NDM-1，KPC-2)調(diào)查[6]結(jié)果表明，NDM-1為主要攜帶酶型，未發(fā)現(xiàn)KPC-2酶型，所以本研究選取5種水解碳青霉烯類抗生素常見的耐藥酶基因(KPC-2、IMP、VIM、NDM-1、OXA-23)進(jìn)行檢測，了解我院呼吸ICU CRAB耐藥酶基因的攜帶情況，同時利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對分離的22株CRAB進(jìn)行同源性分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 收集2015 年10—12月呼吸ICU臨床患者送檢標(biāo)本分離的CRAB菌株22株(剔除同一患者檢出的重復(fù)菌株)，使用菌株保存管-70℃保存。

1.2 試劑和儀器 VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及配套的藥敏卡。PCR擴(kuò)增儀使用E-Cycle TM 96 PCR擴(kuò)增儀；瓊脂糖電泳儀為北京六一儀器廠公司電泳儀；瓊脂糖電泳成像儀使用JS-380自動凝膠成像系統(tǒng)；PCR擴(kuò)增試劑使用2×Power Taq PCR Master Mix(BioTeke，PR1700)試劑盒，瓊脂糖電泳Marker使用D2000 DNA Marker(TIANGEN，MD114)；PFGE電泳儀為Bio-rad，PFGE圖像錄入Bio Numerics軟件包進(jìn)行處理。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及藥敏試驗 臨床分離出的細(xì)菌先按目標(biāo)菌進(jìn)行分純，分純后的單個菌落使用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及配套的藥敏卡進(jìn)行菌種鑒定、藥敏試驗。測得的MIC值以2015年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI))的臨界值判定敏感性，藥敏結(jié)果顯示亞胺培南或美羅培南對目標(biāo)菌MIC值≥8 μg/mL，作為CRAB目標(biāo)菌株收集。

1.3.2 細(xì)菌DNA的提取 將培養(yǎng)16～18 h的新鮮培養(yǎng)物懸浮于100～200 μL無菌去離子水中，沸水浴10 min以上，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，-20℃保存。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測序 采用PCR 法進(jìn)行基因擴(kuò)增，各靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長度見表1。KPC-2基因引物設(shè)計參考Genbank中DQ 989640.1合成。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃30 s，共25個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增完產(chǎn)物經(jīng)120 V，40 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、拍照并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司進(jìn)行測序，結(jié)果與BLAST進(jìn)行同源性比對。由于沒有OXA-23基因和VIM基因的陽性對照，為了保證PCR體系的完整性，在檢測OXA-23基因PCR擴(kuò)增同批體系時同時增加一個KPC-2(893 bp)標(biāo)本作為陽性對照(KPC-2菌株由廣州呼吸疾病研究所卓超教授惠贈)；在VIM基因PCR體系中增加NDM-1(292 bp)作為陽性對照，標(biāo)本為本實驗室保留。

1.3.4 耐藥菌株同源性分析 22株CRAB采用PFGE法進(jìn)行同源性分析，實驗中所用內(nèi)切酶、實驗條件見表2。

表1CRAB耐藥基因PCR擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物長度

Table1Primer sequences and product length of PCR amplification of CRAB drug resistance genes

目的基因序列(5’-3’)產(chǎn)物長度(bp)NDM?1F：CAGCACACTTCCTATCTC292[7]R：CCGCAACCATCCCCTCTTIMPF：TTGACACTCCATTTACTG139[8]R：GATTGAGAATTAAGCCACTCTOXA?23F：GATGTGTCATAGTATTCGTCG1058[9]R：TCACAACAACTAAAAGCACTGVIMF：GATGGTGTTTGGTCGCATA390[10]R：CGAATGCGCAGCACCAGKPC?2F：ATGTCACTGTATCGCCGTCT893R：TTTTCAGAGCCTTACTGCCC

表222株CRAB PFGE實驗方法與條件

Table2Experimental methods and conditions of PFGE of 22 CRAB strains

名稱條件名稱條件RunTime119hRampinglinearInitialSwitchTime5s起始電流135maFinalSwitchTime20sMarkerH9812VoltageGradient6V/cmMarker內(nèi)切酶XbaIIncludedAngle120°被測菌內(nèi)切酶ApaI

1.3.5 PFGE分析方法 PFGE圖像錄入BioNumerics(Version7.1，Applied maths，Inc.)軟件包進(jìn)行處理，識別圖像條帶，經(jīng)統(tǒng)一的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)定條帶位置，必要時進(jìn)行手工校正。每兩個圖像之間的相似性系數(shù)用Dice系數(shù)(Dice coefficients，SD)表示，SD =2nxy/(nx+ny)，其中nx是菌株x的總條帶數(shù)，ny是菌株y的總條帶數(shù)，nxy是菌株x和菌株y共有的條帶數(shù)。SD值反映不同菌株P(guān)FGE圖像之間的相似性程度，范圍在0～1之間，0代表完全不一樣，1代表完全相同。出現(xiàn)不同條帶即判定為不同的型別，對每一個型別都進(jìn)行命名。根據(jù)每兩個圖像之間的相似性系數(shù)，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果

2.1 菌株標(biāo)本來源分布 2015年10—12月呼吸ICU共分離CRAB 22株，其中19株(86.36%)分離于痰，2株(9.09%)分離于尿，1株(4.55%)分離于血。

表3 22株CRAB的耐藥結(jié)果

2.3 PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果 對22株CRAB進(jìn)行PCR擴(kuò)增KPC-2、IMP、VIM、NDM-1、OXA-23基因，結(jié)果KPC-2、IMP、NDM-1無特異性條帶出現(xiàn)，均為陰性；OXA-23基因擴(kuò)增目的條帶在1 058處全部出現(xiàn)特異性條帶，陽性率為100%；VIM基因也全部出現(xiàn)特異性條帶，陽性率為100%。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測序，結(jié)果在GenBank進(jìn)行BLAST比對確認(rèn)為OXA-23基因和VIM基因。見圖1～2。

M：marker；P：KPC-2(893 bp)陽性對照；1～22：待測菌株

M：marker；P：NDM-1(292 bp)陽性對照；1～22：待測菌株

2.4 PFGE電泳結(jié)果與分析 22株CRAB進(jìn)行PFGE分型、酶切后部分PFGE電泳圖見圖3。PFGE圖像錄入BioNumerics軟件包進(jìn)行處理，根據(jù)相似度100%的為同一PFGE型別的原則，22株菌分為13種不同帶型。每種帶型包含菌株數(shù)為1～5株不等[其中9種帶型(69.23%)分別只包含1株菌，其他4種(30.77%)帶型包含菌株數(shù)為2～5株]。其中A5、A7和A8 為同一型，A9、A11、A14、A19和A22 為同一型， A4、A10和A12為同一型，A16和A18為同一型。聚類樹圖結(jié)果見圖4。

圖3 22株CRAB的PFGE電泳圖

圖4 22株CRAB的PFGE聚類樹圖

3 討論

CRAB已成為我國醫(yī)院感染最重要的病原菌，吸痰器、呼吸機、空調(diào)、輸液系統(tǒng)均可被污染而將病原菌傳播給患者，鮑曼不動桿菌以下呼吸道感染最為常見[11]。我院呼吸ICU分離的CRAB也主要來源于下呼吸道，對臨床常用的抗菌藥物耐藥性比較嚴(yán)重，除了對多粘菌素B均為敏感和對米諾環(huán)素的耐藥率為9.09%外，對大多抗菌藥物的耐藥率均>80%，特別是對β-內(nèi)酰胺類的藥物均耐藥，因此，治療CRAB感染的抗菌藥物選擇非常有限。

近年來，鮑曼不動桿菌成為繼銅綠假單胞菌之后的分離最多的非發(fā)酵菌，是引起醫(yī)院感染的重要條件病原菌。而CRAB對抗菌藥物耐藥的機制具有多樣性和繁復(fù)性，據(jù)文獻(xiàn)[12]報道，耐藥機制主要是抗菌藥物誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的水解酶，能夠水解亞胺培南或美羅培南中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使酰胺鍵斷裂而失去抗菌活性，出現(xiàn)了耐碳青霉烯類的多重耐藥菌。為了進(jìn)一步了解我院CRAB的耐藥機制，本實驗選取KPC-2、IMP、VIM、NDM-1、OXA-23共5種耐藥及介導(dǎo)耐藥基因進(jìn)行檢測，結(jié)果未檢測到KPC-2、IMP、NDM-1基因，OXA-23基因和VIM基因陽性均為100%。OXA-23型酶和VIM型酶能水解頭孢菌素類及碳青酶烯類抗生素，據(jù)研究[13]報道OXA-23型酶是引起鮑曼不動桿菌多重耐藥的主要原因之一，全國12所三級甲等醫(yī)院2007年7月—2008年6月CRAB的OXA-23陽性率為80.4 %；四川省某醫(yī)院對48株CRAB進(jìn)行耐藥基因檢測，其中OXA-23占比70.8%，VIM攜帶率為31.3%[14]；天津市第三中心醫(yī)院的一次院內(nèi)調(diào)查結(jié)果也表明CRAB的耐藥基因OXA-23為80.3%[15]。本次實驗22株CRAB攜帶的OXA-23基因和VIM基因總檢出率是100%，比上述國內(nèi)其他地區(qū)報道的攜帶的OXA-23、VIM耐藥基因陽性率均高，特別是VIM耐藥基因陽性率也達(dá)100%，遠(yuǎn)高于四川某醫(yī)院報道的31.3%，可能為地域之間的差異或是菌株數(shù)較少而造成統(tǒng)計上的局限性，但提示OXA-23和VIM型酶仍是我院CRAB的主要流行酶型。

鮑曼不動桿菌具有在體外長期存活的能力，易引起克隆播撒，由于CRAB 對包括碳青霉烯類的大多數(shù)抗菌藥物耐藥，同一克隆株在同一病區(qū)內(nèi)及不同病區(qū)間的播散是其容易暴發(fā)流行的主要原因[16]。為明確我院呼吸ICU多重耐藥鮑曼不動桿菌是否有暴發(fā)流行的趨勢，本研究重點收集呼吸ICU的22株CRAB進(jìn)行同源性分析，22株菌分為13種不同帶型。每種帶型包含菌株數(shù)為1～5株不等，其中9種帶型(69.23%)分別只包含1株菌，其他4種(30.77%)帶型包含菌株數(shù)為2～5株不等。其中A5、A7和A8 為同一型，A9、A11、A14、A19和A22 為同一型， A4、A10和A12為同一型，A16和A18為同一型。總體來看，所有菌株的相似度較高，相似度均大于80%，可能是菌株大多來源于痰的原因。對于100%相似的菌株，可以考慮為同一克隆株，說明呼吸ICU有CRAB小范圍的暴發(fā)流行。由于CRAB常常通過醫(yī)護(hù)人員的手、污染的醫(yī)療器械和空氣等途徑引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，病死率高，所造成的經(jīng)濟(jì)損失大，后果嚴(yán)重，應(yīng)引起醫(yī)院感染管理部門、臨床微生物室及其他醫(yī)院相關(guān)管理部門的高度重視[17]，加強醫(yī)院感染管理，合理應(yīng)用抗菌藥物，醫(yī)護(hù)人員嚴(yán)格無菌操作、加強消毒隔離措施，預(yù)防耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)大范圍的暴發(fā)流行。

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Carriageofdrugresistancegenesandhomologyofcarbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiisolatedfromrespiratoryintensivecareunit

LITian-jiao1,HUANGTao1,WUHua1,SUYu1,FUSheng-miao1,FUHui-qun1,WANGXu-ming1,LONGWen-fang2

(1HainanGeneralHospital,Haikou570311,China; 2SchoolofPublicHealth,HainanMedicalUniversity,Hainan570311,China)

ObjectiveTo investigate drug resistance genes and epidemic characteristics of β-lactamase carried by carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii(CRAB) in the respiratory intensive care unit(RICU) in a hospital.MethodsClinically isolated CRAB from RICU patients in October-December 2015 were collected. Five drug resistance genes (KPC-2,IMP,VIM,NDM-1,OXA-23) were specifically amplified by polymerase chain reaction (PCR), amplified products were performed agarose gel electrophoresis and sequencing analysis, the homology was analyzed with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).ResultsA total of 22 CRAB strains were isolated in October-December 2015, 19 (86.36%) of which were isolated from sputum. The resistance rate of 22 CRAB strains to compound sulfamethoxazole was 59.09%, resistance rate to minocycline was 9.09%, all were sensitive to polymyxin B, resistance rates to other antimicrobial agents were more than 80%. Three kinds of resistance genesKPC-2,IMPandNDM-1 were not found by PCR amplification, positive rates ofVIMandOXA-23 were both 100%. PFGE homology analysis revealed that 22 strains were divided into 13 different types, each type contained 1-5 strains, 9 types(69.23%) contained only 1 strain respectively, the other 4 types (30.77%) contained 2-5 strains. A5, A7, and A8; A9, A11, A14, A19 and A22; A4, A10 and A12; A16 and A18 were of the same type respectively.ConclusionThe main types of β-lactamase-resistant genes of CRAB in RICU areVIMandOXA-23. Homology analysis shows a small parts are of the same clone strains, which reveals epidemic of a small scale.

carbapenemase-resistant;Acinetobacterbaumannii; drug resistance gene; homology analysis

[Chin J Infect Control，2018，17(1)：16-20]

2017-02-22

海南省自然科學(xué)基金(814307)

李天嬌(1975-)，女(漢族)，海南省?？谑腥?，主任技師，主要從事細(xì)菌耐藥機制研究。

龍文芳 E-mail:hnsea2013@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2018.01.004

R378

A

1671-9638(2018)01-0016-05

陳玉華)