劉燕，馮利興

（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2.華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200241）

肌肉鈣黏蛋白突變體構(gòu)建和細(xì)胞內(nèi)定位分析

劉燕1，馮利興2＊

（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2.華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200241）

為研究肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）三個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)肌肉鈣黏蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位的影響，以鼠肌肉鈣黏蛋白基因及其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變序列為模板，利用PCR技術(shù)將其擴(kuò)增后插入pEGFP-N1載體，使其與綠色熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，Western Blot檢測蛋白的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察肌肉鈣黏蛋白及不同鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變體在HEK293細(xì)胞中的定位。結(jié)果顯示，肌肉鈣黏蛋白三個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)分別突變之后，第二個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致肌肉鈣黏蛋白細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)生改變，使蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布發(fā)生改變。該研究為深入研究肌肉鈣黏蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了基礎(chǔ) 。

肌肉鈣黏蛋白；鈣離子結(jié)合位點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)定位

鈣黏蛋白是一類鈣離子依賴的介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的跨膜糖蛋白，介導(dǎo)鈣離子依賴的細(xì)胞間黏附。肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）主要表達(dá)于骨骼肌細(xì)胞中[1]，故而命名為肌肉鈣黏蛋白。它表達(dá)于發(fā)育中的骨骼肌、二次肌生成等[2-3]，此外，也發(fā)現(xiàn)在肌肉神經(jīng)接點(diǎn)、肌肉神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的兩個(gè)區(qū)域，即脊髓和小腦中也有表達(dá)[4-5]。從結(jié)構(gòu)上看，肌肉鈣黏蛋白與其他鈣黏蛋白一樣，主要由胞外、跨膜及胞內(nèi)肽段三部分組成。氮端的胞外結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)親同性結(jié)合，胞內(nèi)肽段即胞質(zhì)內(nèi)的尾巴部分與連環(huán)蛋白結(jié)合，繼而與肌動(dòng)蛋白連接于細(xì)胞骨架上，因此與胞外結(jié)構(gòu)域耦聯(lián)介導(dǎo)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞內(nèi)張力[6]。

細(xì)胞黏附蛋白影響細(xì)胞的形狀、極性、細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖、細(xì)胞存活、細(xì)胞分化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性及功能[7-8]。肌肉鈣黏蛋白作為一種黏附蛋白，可以與胞內(nèi)的連環(huán)蛋白形成兩種類型的復(fù)合物[9]：一種是鈣黏蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物與細(xì)胞骨架相連，特別是肌動(dòng)纖維系統(tǒng)[10]；另一種是肌肉鈣黏蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物與微管相互作用，這是一種成肌細(xì)胞特異性行為[11]。

因?yàn)殁}黏蛋白是依賴鈣離子發(fā)揮功能，所以研究者們普遍認(rèn)為在鈣黏蛋白的胞外段是存在鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的。研究發(fā)現(xiàn)，鈣黏素家族的蛋白都至少有一個(gè)或多個(gè)鈣黏素重復(fù)序列 。一個(gè)鈣黏素重復(fù)序列是一個(gè)獨(dú)立的折疊序列，這個(gè)序列約有110個(gè)氨基酸，在這110個(gè)氨基酸中具有保守序列的模序，這些保守序列分別是天冬氨酸-精氨酸-谷氨酸（DRE）、天冬氨酸-X-天冬酰胺-天冬氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-脯氨酸-X-苯丙氨酸（DXNDNAPXF，X代表任意氨基酸）和天冬氨酸-X-天冬氨酸（DXD）[12]，鈣黏蛋白通過這些模序來結(jié)合鈣離子。在肌肉鈣黏蛋白中也存在這樣的鈣離子結(jié)合模序，從其氨基酸序列推測，肌肉鈣黏蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域含有三個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。

目前，人們對(duì)肌肉鈣黏蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的了解并不深入。比對(duì)發(fā)現(xiàn)人和鼠的肌肉鈣黏蛋白的保守性達(dá)到86%，其中鈣離子結(jié)合模序完全保守。鑒于鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的重要性及保守性，在本文中，筆者構(gòu)建了鼠肌肉鈣黏蛋白及三個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)與綠色熒光蛋白融合表達(dá)的突變質(zhì)粒，通過觀察肌肉鈣黏蛋白在HEK293細(xì)胞內(nèi)的定位試圖找到對(duì)肌肉鈣黏蛋白細(xì)胞內(nèi)定位影響最大的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，為深入研究肌肉鈣黏蛋白的功能和結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

HEK293由本實(shí)驗(yàn)室提供；pEGFP-N1載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；KOD plus DNA聚合酶購自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶包括NheI、KpnI，T4 DNA Ligase均購自NEB公司；鼠抗M-cadherin 單抗購自美國Millipore公司；兔抗GFP單抗購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（二抗）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、1kb plus DNA ladder均購自天根生化科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室制備，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovineserum,FBS）均購自美國Gibco公司；細(xì)胞裂解液（20mM HEPES，pH7.6，0.5mM EDTA，pH8.0，20%甘油，100mM KCl，0.5% Tween20）；免疫印跡顯色試劑盒購自美國的Thermo fisher scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒為模板，第一個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)為55、56、110、112、143、145、146位氨基酸，第二個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)為第162、163、218、220、251、253、254位氨基酸，第三個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)為第270、328、330、367、369、370位氨基酸，突變鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的兩到三處氨基酸序列。設(shè)計(jì)1對(duì)引物擴(kuò)增目的基因。上游F：5'-CGGCTAGCCTAGC GAATTCCCTCTATGGGTTC-3'，下 游 R：5'-GGGGT ACCGACTGATGTCCATACATGTCCGCC-3'；反 應(yīng) 條件：94℃ 30s，58℃ 30s，68℃ 3min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。使用DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將回收的PCR產(chǎn)物與pEGFP-N1載體用Nhe I和Kpn I進(jìn)行雙酶切。回收載體和插入片段后進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，將測序正確的擴(kuò)大培養(yǎng)，提取DNA質(zhì)粒待用。

1.2.3 HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將預(yù)先培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞接種于六孔板，待長至密度為70%左右，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每個(gè)孔取4μg質(zhì)粒，加入96μL水；取 100μL 2×CaCl2混勻，200μL 2× HBS逐滴加入到混合液體中，總體積為400μL。室溫靜置30min后，加入含1.5mL 10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液的六孔板中，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.2.4 Western Blot

收集轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1 空載體和pEGFPN1-M-cadherin、pEGFP-N1-M-cadherin-mut1、pEGFP-N1-M-cadherin-mut2、pEGFP-N1-M-cadherin-mut3重組質(zhì)粒以及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取蛋白，加入5×SDS上樣緩沖液沸水煮10min。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔20μL蛋白裂解液，120V恒壓電泳2h，90V恒壓轉(zhuǎn)膜2h，用TBST配制的5%脫脂牛奶封閉膜1h，分別加入M-cadherin抗體（1∶1 000）、GFP抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次10min。加入1∶10 000稀釋二抗，室溫孵育1h，TBST洗3次，每次10min。LAS4000冷光/生物發(fā)光影像分析儀顯色。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

接種HEK293細(xì)胞至六孔板，細(xì)胞爬片生長24h后，細(xì)胞密度約為60%，將pEGFP-N1空載體和 pEGFP-N1-M-cadherin、pEGFP-N1-M-cadherinmut1、pEGFP-N1-M-cadherin-mut2、pEGFP-N1-M-cadherin-mut3重組質(zhì)粒分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭繛?μg。48h后，4%多聚甲醛固定，4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。DAPI用PBS按1∶1 000稀釋，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5 min，PBS洗3次，每次5 min。封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）下觀察。

2 結(jié)果

2.1 肌肉鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域劃分以及質(zhì)粒構(gòu)建策略

肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）是一個(gè)跨膜糖蛋白，分為4個(gè)部分：信號(hào)肽、胞外段（EC）、跨膜區(qū)域（TM）以及胞內(nèi)段（CP）。其中，胞外段又可分為 5個(gè)區(qū)域，即EC1、EC2、EC3、EC4、EC5（見圖1a）。將M-cadherin及其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變體克隆到載體pEGFP-N1中，構(gòu)建策略見圖1b。M-cadherin有三個(gè)鈣離子結(jié)合模序，分別把三個(gè)鈣離子結(jié)合模序天冬氨酸-精氨酸-谷氨酸（DRE）模序、天冬氨酸-X-天冬酰胺-天冬氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-脯氨酸-X-苯丙氨酸（DXNDNAPXF，X代表任意氨基酸）模序和天冬氨酸-X-天冬氨酸（DXD，X代表任意氨基酸）模序突變?yōu)榻z氨酸-丙氨酸-蘇氨酸（SAT）模序，突變序列以及突變位置見圖1c。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建策略

2.2 pEGFP-N1-M-cadherin及其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變體質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建pEGFP-N1-M-cadherin及其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變質(zhì)粒pEGFP-N1-M-cadherin-mut1、pEGFP-N1-M-cadherin-mut2、pEGFP-N1-M-cadherin-mut3，經(jīng)雙酶切，1%瓊脂糖電泳初步鑒定，證明肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）及其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變序列成功裝入載體，見圖2。重組質(zhì)粒經(jīng)測序分析，證實(shí)肌肉鈣黏蛋白序列及3個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)序列均正確，插入方向和堿基序列均正確。

圖2 酶切鑒定重組質(zhì)粒結(jié)果

2.3 肌肉鈣黏蛋白及其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變質(zhì)粒的過表達(dá)

肌肉鈣黏蛋白的表達(dá)具有組織特異性，HEK293細(xì)胞本身不表達(dá)肌肉鈣黏蛋白。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中，使肌肉鈣黏蛋白與綠色熒光蛋白融合表達(dá)，通過綠色熒光蛋白的表達(dá)可檢測肌肉鈣黏蛋白的表達(dá)。收集細(xì)胞，抽提蛋白，Western Blot檢測肌肉鈣黏蛋白過表達(dá)情況，同時(shí)以空載體pEGFP-N1為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，肌肉鈣黏蛋白抗體檢測到的蛋白大小與綠色熒光蛋白抗體檢測到的大小一致，均為150kD（如圖3），表明構(gòu)建的質(zhì)粒在HEK293中成功融合表達(dá)了肌肉鈣黏蛋白與綠色熒光蛋白及鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變蛋白與綠色熒光蛋白。

圖3 Western Blot檢測肌肉鈣黏蛋白及鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變蛋白在HEK293中的表達(dá)

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察肌肉鈣黏蛋白及鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變體蛋白的表達(dá)與定位

將制作好的樣本在顯微鏡下觀察，可以明顯觀察到肌肉鈣黏蛋白主要集中于細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)，但主要集中于靠近細(xì)胞膜的一點(diǎn)，呈現(xiàn)極性。第一個(gè)和第三個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變的蛋白與未突變的肌肉鈣黏細(xì)胞內(nèi)定位極為相似；第二個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變的蛋白也定位于細(xì)胞膜上，但胞質(zhì)內(nèi)的定位呈散在分布，失去極性，而pEGFP-N1是全細(xì)胞表達(dá)，見圖4。

圖4 肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）及其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變蛋白細(xì)胞內(nèi)定位

3 結(jié)論

本文成功構(gòu)建了肌肉鈣黏蛋白及其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)突變重組質(zhì)粒，利用其與綠色熒光（GFP）融合表達(dá)，在本身不表達(dá)該蛋白的HEK293細(xì)胞中過表達(dá)該蛋白及其突變體蛋白，直觀地觀察到肌肉鈣黏蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位情況。發(fā)現(xiàn)它們均能定位在細(xì)胞膜上，但除了在細(xì)胞膜上定位之外，有一部分蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈簇聚集，這可能與該蛋白在不同發(fā)育時(shí)期，不同細(xì)胞內(nèi)定位相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）的第二個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的突變對(duì)其定位產(chǎn)生了影響，主要表現(xiàn)在蛋白不呈簇聚集。第一個(gè)和第三個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的突變對(duì)肌肉鈣黏蛋白的定位均無影響。這證明了第二個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)可能是維持肌肉鈣黏蛋白剛性的一個(gè)極其重要的位點(diǎn)。，為深入研究肌肉鈣黏蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)和提供了可能。

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Construction of M-cadherin and its Calcium Binding Sites Mutations and Analysis of Their Intracellular Localization

Liu Yan1,Feng Li-xing2*
(1.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433;2.School of Chemistry and Molecular Engineering,ECNU,Shanghai 200241)

In order to study effect of the three calcium binding sites of M-cadherin on intracellular localization,M-cadherin and its mutations was used as template,the M-cadherin and its mutations coding sequence were amplified by PCR and respectively inserted into the vector pEGFP-N1,they fusion expressed with EGFP.The expression in HEK293 was detected by western blot and localization of EGFP fusion expression was observed by laser scanning confocal microscopy.The results showed that three different calcium binding sites were mutated separately,the second one can cause M-cadherin intracellular localization changed,then changed the intracellular pattern of the protein.This study provides the foundation for further study the function and structure of M-cadherin.

M-cadherin;Calcium binding sites;Intracellular localization

Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

2096-0387（2017）06-0024-05

國家自然科學(xué)基金（81373964）；上海市科委科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃（15140904800）。

劉燕（1987—），女，四川廣元人，碩士在讀，研究方向：成體肌肉干細(xì)胞的命運(yùn)決定。

馮利興（1983—），男，河北邯鄲人，碩士，助理研究員，研究方向：藥理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。