陳成，鐘雨雪，夏祥，邱成書，陳存，謝翼飛＊

（1.成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都611130；2.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都610041）

酵母型生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化

陳成1，鐘雨雪1，夏祥2，邱成書1，陳存1，謝翼飛2＊

（1.成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都611130；2.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都610041）

目的：獲得高效的酵母菌型絮凝劑。方法：以代表性的高嶺土懸濁液、養(yǎng)殖場廢水、土壤上清液、藻液、硫酸銅溶液、發(fā)酵廢水作為測試廢水，篩選具有絮凝活性的菌種。結(jié)果：篩選出3株具有絮凝活性的菌種，其中酵母1-4絮凝效果較好且適用范圍較廣；對(duì)酵母1-4菌培養(yǎng)基的碳源、氮源、碳氮比進(jìn)行優(yōu)化，確定最適碳源為甘露醇，最適氮源為氯化銨，碳氮比5∶1為最佳。結(jié)論：用醇降法提取優(yōu)化培養(yǎng)所得的絮凝劑，產(chǎn)率為5.0g/L，經(jīng)紫外吸收光譜和茚三酮反應(yīng)初步判斷絮凝劑的主要成分為蛋白質(zhì)。

酵母菌；生物絮凝劑；高嶺土懸濁液；培養(yǎng)基優(yōu)化

生物絮凝劑是一類天然高分子絮凝劑，是通過微生物發(fā)酵、分離提取而得到的一種高效、無毒且易降解的新型污水處理劑[1]。與傳統(tǒng)絮凝劑相比，具有安全性高、生物降解性良好、易于固液分離、無二次污染、用量少等優(yōu)點(diǎn)[2-5]，能快速絮凝各種顆粒物質(zhì)，廣泛用于去除水體中的懸浮物質(zhì)[6]、COD[7]、重金屬[8-9]、腐殖酸[10]等，在廢水脫色、高濃度有機(jī)物去除等方面效果顯著[11-13]，有著很大的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

我國對(duì)生物絮凝劑的研究起步相對(duì)較晚，目前多數(shù)處于菌種的篩選階段。雖然生物絮凝劑在水處理方面有著突出的優(yōu)越性，但從規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用角度來看，還存在著一系列亟待解決的問題，如高效絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選和培育、絮凝活性的提高、尋找廉價(jià)的培養(yǎng)基等。研究發(fā)現(xiàn)，能夠產(chǎn)生絮凝劑的微生物種類繁多，包括細(xì)菌、放線菌、真菌、霉菌、酵母菌和某些藻類等[14]，但現(xiàn)有的研究以細(xì)菌為主，對(duì)酵母型生物絮凝劑研究相對(duì)較少。不同菌種產(chǎn)生的絮凝成分差別較大，而不同的培養(yǎng)條件也會(huì)對(duì)絮凝效果和產(chǎn)量產(chǎn)生較大的影響。本文以酵母型絮凝劑產(chǎn)生菌為研究對(duì)象，在篩選生物絮凝劑產(chǎn)生菌株的基礎(chǔ)上，采用高嶺土懸濁液模擬待處理的廢水，對(duì)高活性菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，力求獲得高效高產(chǎn)量的酵母型產(chǎn)絮菌及培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水乙醇（AR，上海精細(xì)化工試劑有限公司）、酵母膏（BR，北京奧博星生物）、胰蛋白胨（BR，北京奧博星生物）、YPD培養(yǎng)基（BR，北京奧博星生物）、CuSO4（AR，天津美琳），其余試劑皆購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，純度為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)：蜀科TG-16；電子天平：梅特勒-托利多A1-104；六聯(lián)攪拌器：磁力數(shù)顯控溫?cái)嚢杵鱄J-6A；電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP-600；恒溫振蕩器：IS-R0V1；pH計(jì)：雷磁PHB-4；雙光束紫外可見分光光度計(jì)：普析TU-1901。

1.3 方法

1.3.1 高效酵母型生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選

YPD培養(yǎng)基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、瓊脂粉 20g、H2O 1 000mL，115℃滅菌 30min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g、蛋白胨0.5g、酵母膏 0.5g、(NH4)2SO40.2g、K2HPO45.0g、KH2PO42.0g、MgSO40.2g、NaCl0.1g、1 000mL，pH=8.0，115 ℃ 滅菌30min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g、酵母膏15.0g、氯化鈉4.0g、葡萄糖 10.0g、H2O 1 000mL、pH=7.0，115℃滅菌30min。

將實(shí)驗(yàn)室保存的酵母菌種接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基，28℃恒溫活化培養(yǎng)10h后接種到50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24h。向6個(gè)燒杯中分別加入高嶺土懸濁液、養(yǎng)殖場廢水、CuSO4溶液、發(fā)酵廢水、藻液、土壤上清液各20mL，再分別加入0.2mL發(fā)酵液，1mL1%CaCl2，快速攪拌1min，慢速攪拌4min，觀察絮凝效果。

1.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

（1）碳源優(yōu)化。分別以淀粉、甘露醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖作為碳源，將菌種接入種子培養(yǎng)基，28℃180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)10h。取菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，以20mL高嶺土懸濁液為測試液，加入1mLCaCl2混勻后靜置10min，測定上清液在550nm下的吸光度（OD550）。將菌液稀釋10倍后，測定其在600nm下的吸光度（OD600）。

（2）氮源優(yōu)化。分別以(NH4)2SO4、尿素、酵母膏、酵母膏尿素混合物、NH4Cl作為氮源，在碳源最優(yōu)條件下，其余操作同上。

（3）碳氮比優(yōu)化。調(diào)節(jié)C/N比分別為10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在碳源、氮源最優(yōu)條件下，其余操作同上。

1.3.3 絮凝劑成分的分析

向150mL預(yù)冷的無水乙醇中加入50mL發(fā)酵液，于-4℃條件下靜置8h，6 000r/min離心20min，棄去上清液，將沉淀放于烘箱中用40℃烘干至恒重。所得絮凝劑用紫外可見分光光度計(jì)掃描其吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效酵母型絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選

實(shí)驗(yàn)分離純化出酵母型菌株20株，以高嶺土懸濁液、養(yǎng)殖場廢水、CuSO4溶液、發(fā)酵廢水、藻液、土壤上清液6種代表性廢水做篩選，選出的菌種絮凝效果實(shí)用性與適用性比單一廢水篩選更強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。酵母1-4、酵母1-7、酵母1-8有明顯的絮凝活性，三者絮凝情況對(duì)比如圖1所示?？梢钥闯觯湍?-4菌對(duì)土壤上清液、藻液、高嶺土懸濁液等都有明顯的效果，適用范圍較廣，且絮凝效果優(yōu)于酵母1-7與酵母1-8。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

以絮凝效果最好的酵母1-4菌為菌種優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方。碳源優(yōu)化結(jié)果見表2，OD550越小上清液越澄清，發(fā)酵液絮凝效果越好，OD600數(shù)值越高表明發(fā)酵液中菌種生長狀況越好。以甘露醇作為碳源，OD550數(shù)值最低，絮凝效果最好，其OD600數(shù)值僅次于葡萄糖，菌種生長狀況較好。因而，兼顧絮凝效果與菌種生長情況，確定甘露醇為最適碳源。

表1 菌株絮凝效果

圖1 三株酵母菌的絮凝效果

表2 碳源優(yōu)化結(jié)果

以甘露醇作為碳源，(NH4)2SO4、尿素、酵母膏、酵母膏尿素混合物、NH4Cl作為氮源，絮凝效果和菌種生長情況見表3。以NH4Cl作為培養(yǎng)基氮源，測得OD550最低，絮凝效果最好，OD600數(shù)值最高，菌種生長狀況最好。因而確定NH4Cl作為最佳氮源。

表3 氮源優(yōu)化結(jié)果

在碳源為甘露醇，氮源為NH4Cl的條件下，優(yōu)化培養(yǎng)基的碳氮比，測得OD550、OD600值見表4。比較可得當(dāng)碳氮比為5∶1時(shí)，OD550最低，OD600最高，絮凝效果最好且菌種生長狀況最好。故優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為甘露醇，氮源為NH4Cl，碳氮比為5∶1。

表4 碳氮比優(yōu)化結(jié)果

2.3 絮凝劑成分的初步鑒定

采用醇降法分離提取優(yōu)化培養(yǎng)24h的酵母1-4菌所產(chǎn)出的絮凝劑，測得產(chǎn)量為每50mL發(fā)酵液0.25g。利用紫外可見分光光度計(jì)測得絮凝劑于260nm處有吸收峰，茚三酮反應(yīng)呈紫色，可初步確定酵母1-4菌株產(chǎn)生的絮凝劑主要成分為蛋白質(zhì)。

3 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)室保藏菌種中分離純化出的20株酵母菌，并篩選出3株具有較好絮凝效果的酵母菌，即酵母1-4、酵母1-7、酵母1-8，其中酵母1-4絮凝效果最優(yōu)且適用范圍更廣。以酵母1-4菌為菌種優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，考慮絮凝效果與菌種生長情況下，優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為甘露醇，氮源為NH4Cl，碳氮比為5∶1。采用醇降法分離提取酵母1-4產(chǎn)出的絮凝劑，產(chǎn)量為每50mL發(fā)酵液0.25g。利用紫外可見分光光度計(jì)測得絮凝劑于260nm處有吸收峰，且茚三酮反應(yīng)呈紫色，證明絮凝劑主要成分為蛋白質(zhì)。

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Screening and Medium Optimization of High-efficiency Flocculant-producing Yeast

Chen Cheng1,Zhong Yu-xue1,Xia Xiang2,Qiu Cheng-shu1,Chen Cun1,Xie Yi-fei2*
(1.School of Chemistry and Life Science,Chengdu Normal University，Sichuan Chengdu 611130;2.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Sichuan Chengdu 610041)

Objective:To obtain an efficient yeast flocculant.Methods:the flocculation activity test for kaolin suspension,farm wastewater,soil supernatant,algae solution,copper sulfate solution and fermentation wastewater.Results:Three flocculant-producing yeasts were screened,in whichYeast1-4 has the highest flocculation efficiency and could be applicable to for more kinds of wastewater.The medium constituents of Yeast1-4 was optimized and the results showed that,the optimum carbon source was mannitol,the optimum nitrogen source was ammonium chloride and the optimum C/N ratio was 5∶1.Conclusion:Under this conditions,the flocculantyield of Yeast1-4 is 5.0g/L.The main ingredient of flocculant is identified to be protein by UV spectroscopy andninhydrin reaction.

Yeast;Bioflocculant;Kaolin suspension;Medium optimization

X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

2096-0387（2017）06-009-04

四川省教育廳科研項(xiàng)目（17ZB0072）；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（107260127）。

陳成（1984—），女，四川南充人，博士在讀，講師，研究方向：水處理技術(shù)。

謝翼飛（1977—），男，江蘇武進(jìn)人，博士，副研究員，研究方向：環(huán)境微生物。