張海毅

（威海職業(yè)（技術(shù)）學(xué)院，山東威海 264210）

洗滌條件對(duì)重組TATm-survivin(T34A)包涵體純度的影響

張海毅

（威海職業(yè)（技術(shù)）學(xué)院，山東威海 264210）

目的：確定重組TATm-survivin(T34A)包涵體的洗滌條件。方法：將補(bǔ)料分批發(fā)酵得到的重組大腸桿菌破碎，得到TATm-survivin(T34A)粗制包涵體，探索pH、化學(xué)物質(zhì)、尿素濃度、洗滌次數(shù)對(duì)包涵體洗滌的影響。結(jié)果：得到重組TATmsurvivin(T34A)包涵體的最佳洗滌條件為洗滌液成分為pH10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L），內(nèi)含100μmol/L巰基乙醇、0.5%Triton X-100、0.5mol/L尿素、1mol/L氯化鈉和2.5mmol/L EDTA；洗滌次數(shù)為4次。結(jié)論：利用優(yōu)化的洗滌條件進(jìn)行洗滌后，包涵體的純度達(dá)到85%左右，整體的回收率達(dá)到80%以上。

重組TATm-survivin(T34A)；包涵體；洗滌條件

重組抗癌藥物TATm-survivin(T34A)經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化后，能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，具有進(jìn)一步研發(fā)的價(jià)值和良好的產(chǎn)業(yè)化前景[1-2]。然而，在搖瓶到生物反應(yīng)器的放大過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，搖瓶?jī)?yōu)化的包涵體純化復(fù)性方法已經(jīng)不適用于發(fā)酵罐中得到的包涵體，按照原純化方法得到的重組蛋白純度明顯下降，大大影響了重組蛋白的質(zhì)量。

TATm-survivin(T34A)重組大腸桿菌發(fā)酵后，表達(dá)的TATm-survivin(T34A)以不溶物聚集物即包涵體的形式存在，需要在體外對(duì)TATm-survivin(T34A)包涵體進(jìn)行復(fù)性。包涵體的處理過(guò)程包括包涵體收集、純化和復(fù)性。為得到較為純化的包涵體蛋白，需要對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌。洗滌同時(shí)還可以去除大腸桿菌外膜蛋白OmpT（37kDa），后者在4～8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性，在包涵體的溶解和復(fù)性過(guò)程中可導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的降解[3]。研究表明，包涵體的純度越高，越有利于后續(xù)的純化和復(fù)性[4]，所以包涵體的洗滌非常重要，不可忽視。針對(duì)上述重組抗癌藥物TATm-survivin(T34A)放大過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)料分批培養(yǎng)得到的粗制包涵體，與比搖瓶中雜蛋白多，增加了包涵體洗滌的難度，因此有必要摸索包涵體洗滌的最佳條件，為后續(xù)包涵體的純化復(fù)性提供高純度的精制包涵體。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

TATm-survivin(T34A)重組大腸桿菌細(xì)胞：補(bǔ)料分批發(fā)酵后得到的菌體，具體發(fā)酵條件參考[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 包涵體的制備

將補(bǔ)料分批發(fā)酵后得到的細(xì)胞培養(yǎng)液于8 000r/min、4℃下離心10min收集菌體。稱取3g濕菌體懸浮于20mL細(xì)胞破碎液（20mmol/L Tris-HCl，pH=7.5）中，超聲破碎150次（400W，開3s，停3s），于8 000r/min、4℃下離心10min，得到的沉淀為粗包涵體。將粗包涵體重懸于不同包涵體洗滌液中洗滌，于8 000r/min、4℃下離心10min，重復(fù)此步收集沉淀為精制包涵體。

1.2.2 包涵體的洗滌

將粗包涵體重懸于不同包涵體洗滌液中洗滌，于8 000r/min、4℃下離心10min，重復(fù)此步收集沉淀為精制包涵體。

1.2.3 包涵體的溶解

將精制包涵體溶解于10mL 8mol/L尿素溶液（20mmol/L Tris-HCl，pH8.5，內(nèi)含 100μmol/L巰基乙醇）中，振蕩混合。于8 000r/min、4℃下離心15min，去掉少量不溶物，上清即為溶解的包涵體，于4℃保存。

1.2.4 包涵體純度的測(cè)定

SDS-PAGE的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，以考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白條帶，進(jìn)行掃描定量。

1.2.5 蛋白濃度的測(cè)定

蛋白濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford）[6]，BSA為標(biāo)準(zhǔn)品。

2 結(jié)果與討論

本研究以1mol/L氯化鈉和2.5mmol/L EDTA溶液作為基礎(chǔ)洗滌液。選擇這兩種物質(zhì)作為基礎(chǔ)成分，一方面這兩種物質(zhì)在洗滌過(guò)程中不會(huì)溶解目標(biāo)蛋白，另一方面高鹽洗滌可以去掉雜蛋白污染物，同時(shí)又提高了溶液的離子強(qiáng)度，增加了去垢能力，EDTA則可以用來(lái)抑制金屬蛋白酶。在此基礎(chǔ)上對(duì)包涵體洗滌液pH、化學(xué)物質(zhì)、尿素濃度及洗滌次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1 洗滌緩沖液pH值對(duì)包涵體洗滌效果的影響

配制不同pH的緩沖液，即磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（20mmol/L，pH=7.0）、Tris-HCl緩沖液（20mmol/L，pH=8.0）、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L，pH=9.0，pH10.0）。洗滌緩沖液pH值對(duì)包涵體洗滌效果的影響結(jié)果見圖1和圖2。從圖中可以很明顯地看出，隨著洗滌液pH的升高，更多的雜蛋白被去除，包涵體的純度增加，上清液中也有少許目標(biāo)蛋白損失。當(dāng)洗滌液pH值為10.0時(shí)，包涵體的純度最高（59.6%），目標(biāo)蛋白有87%被保留?？梢?，極端pH可以起到增溶雜蛋白的作用，有利于包涵體的洗滌。

圖1 pH對(duì)包涵體洗滌的影響

圖2 pH對(duì)包涵體洗滌收率和純度的影響

2.2 化學(xué)物質(zhì)對(duì)包涵體洗滌效果的影響

配制pH=10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L），分別添加100μmol/L巰基乙醇、0.5%Triton X-100、0.001% SDS進(jìn)行洗滌，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，與對(duì)照相比，這3種物質(zhì)對(duì)包涵體的洗滌效果均有促進(jìn)作用。其中，添加巰基乙醇洗滌后，包涵體純度達(dá)到65.8%，添加Triton X-100和SDS后，包涵體純度分別為62.8和63.2%。巰基乙醇作為一種還原劑，常常用來(lái)打開包涵體中含有的一些鏈間二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵；非離子型去垢劑Triton X-100用來(lái)去除不溶的膜碎片和膜蛋白；陰離子去污劑SDS可以破壞蛋白的疏水鍵，去除通過(guò)疏水作用與包涵體結(jié)合的雜質(zhì)。殘留的SDS在隨后的分離純化中不易徹底去除，而且在洗滌效果上與Triton X-100相當(dāng)，因此在洗滌液中不添加SDS，只添加巰基乙醇和Triton X-100。

圖3 化學(xué)物質(zhì)對(duì)包涵體洗滌收率和純度的影響

2.3 尿素濃度對(duì)包涵體洗滌效果的影響

低濃度的變性劑（如尿素）常常被用于包涵體的洗滌。為了進(jìn)一步提高包涵體的純度，不同濃度的尿素被添加到洗滌液中。配制pH=10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L），內(nèi)含100μmol/L巰基乙醇和 0.5%Triton X-100，分別添加 0.5、1、1.5、2mol/L尿素進(jìn)行洗滌，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，隨著尿素濃度的增加，包涵體的純度沒有明顯提高，當(dāng)尿素濃度從1.5mol/L增加到2mol/L時(shí)，目標(biāo)蛋白收率由98%降到89%，表明包涵體中部分目標(biāo)蛋白被溶解。因此，選擇添加尿素濃度為0.5mol/L。經(jīng)過(guò)一系列的優(yōu)化后，最終的包涵體洗滌液組分為pH=10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L），內(nèi)含100μmol/L巰基乙醇、0.5%Triton X-100、0.5mol/L尿素、1mol/L氯化鈉和2.5mmol/L EDTA。

圖4 尿素濃度對(duì)包涵體洗滌收率和純度的影響

2.4 洗滌次數(shù)對(duì)包涵體洗滌效果的影響

采用上述優(yōu)化后的洗滌液配方洗滌包涵體，并考察了洗滌次數(shù)對(duì)包涵體純度和收率的影響，結(jié)果如圖5、圖6所示。從圖中可以看出，當(dāng)洗滌次數(shù)從1次增加到3次時(shí)，包涵體的純度并沒有明顯增加，繼續(xù)增加洗滌次數(shù)，包涵體的純度有了明顯的提高；洗滌4次和洗滌5次相比，包涵體純度變化不大（從83.9%增加到85.6%），而目標(biāo)蛋白的損失增加（94%降低到83%）。由此確定最佳洗滌次數(shù)為4次。

圖5 洗滌次數(shù)對(duì)包涵體洗滌的影響

圖6 洗滌次數(shù)對(duì)包涵體洗滌收率和純度的影響

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)優(yōu)化的洗滌液配方4次洗滌后，包涵體的純度達(dá)到85%左右，整體的回收率達(dá)到80%以上。將洗滌后的精制包涵體溶解于8mol/L尿素中，溶解后的最大蛋白濃度約為4mg/mL，目標(biāo)蛋白的回收率大于95%。

[1]鄭文云,馬興元,魏東芝,等.重組HIV-TATm-Survivin(T34A)蛋白制備及其促癌細(xì)胞凋亡活性研究[J].生物工程學(xué)報(bào),2006,22(2):285-292.

[2]Ma X,Zheng W,Wei DZ,et al.Construction,expression,and purification of HIV-TAT-survivin (T34A) mutant:a pro-apoptosis protein in Escherichia coli[J].Protein Expr Purif,2006,47(1):36-44.

[3]方敏,黃華樑.包涵體蛋白體外復(fù)性的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),2001,17(6):608-612.

[4]王增,馬會(huì)勤,張文,等.包涵體蛋白的分離和色譜法體外復(fù)性純化研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2009,29(7):102-107.

[5]Haiyi Zhang,Yu Zheng,Qinghai Liu,et al.Development of a fed-batch process for the production of anticancer drug TATm-survivin(T34A)in Escherichia coli[J].Biochemical Engineering Journal,2009,43(2):163-168.

[6]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

Effect of washing conditions on the purity of recombinant TATm-survivin(T34A)inclusion bodies

Zhang Hai-yi
(Weihai Vocational College，Shandong Weihai 264210)

objective:To determine the washing condition of recombinant TATm-survivin(T34A) inclusion bodies(Ibs).Methods:RecombinantEscherichia colicells obtained from the fed-batch fermentation were disrupted.The crude inclusion bodies were harvested.Different washing conditions were tested to explore the effect on Ibs wash,which included pH,chemical substances,urea concentrations and washing times.Results:The optimal washing condition was determined.The Ibs purgation buffer (20mmol/L glycine-sodium hydroxide buffer of pH 10.0) contained 100μmol/L mercaptoethanol,0.5%Triton X-100,0.5mol/L urea,1mol/L sodium chloride and 2.5mmol/L EDTA.The washing time was optimized to be four.Conclusions:After Ibs wash with the optimal condition,the Ibs purity is calculated to about 85% with a yield of above 80%.

Recombinant TATm-survivin(T34A);Inclusion bodies;Washing conditions

Q81 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

2096-0387（2017）06-0018-04

張海毅（1980—），女，山東威海人，博士，講師，研究方向：蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化。