蘇濤 劉丕 柯華婧 楊曉娟 李驥

·短篇論著·

自噬在大鼠急性胰腺炎中的變化

蘇濤 劉丕 柯華婧 楊曉娟 李驥

急性胰腺炎(AP)是各種原因引起胰酶激活、以炎癥局部反應(yīng)為主要特征、伴或不伴有其他器官改變的疾病[1]。目前AP的發(fā)病機(jī)制仍不是很清楚，臨床治療上難度較大。研究顯示[2]，AP時(shí)腺泡細(xì)胞中有空泡的積累，且大多數(shù)空泡為自噬空泡，自噬可能與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的死亡關(guān)系密切[3-4]。本研究旨在探討自噬在牛膽酸鈉誘導(dǎo)的大鼠AP發(fā)病過(guò)程中的變化情況。

一、材料和方法

1．材料：健康清潔雌性SD大鼠54只，體重200～250 g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物部提供。其他材料包括LC3B兔多克隆抗體(Abcam公司)，p62鼠單克隆抗體(Abcam公司)，牛磺膽酸鈉(Sigma公司)，二步法兔二抗和鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

2．動(dòng)物分組：將54只大鼠按照隨機(jī)分配原則分為假手術(shù)組(SO)、急性水腫性胰腺炎(AEP)組、急性壞死性胰腺炎(ANP)組，每組18只。每組再隨機(jī)分成3、6、12 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每時(shí)間點(diǎn)6只。

3．大鼠胰腺炎模型的建立和標(biāo)本的獲取：AEP組采用胰膽管逆行注射1%?；悄懰徕c(0.1 ml/100 g體重)、ANP組注射5%?；悄懰徕c(0.1 ml/100 g體重)的方法建模，假手術(shù)組與模型組相同手術(shù)方式，但不注射藥物。每組大鼠分別于術(shù)后第3、6、12 h取標(biāo)本。

4．觀察的指標(biāo)與檢測(cè)：(1)血清淀粉酶：由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。(2)胰腺組織病理學(xué)：由病理醫(yī)師閱片，選取5個(gè)高倍視野，采用改良Schmidt評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰腺的損傷進(jìn)行評(píng)分。(3)超微結(jié)構(gòu)觀察：取各組3 h點(diǎn)的胰腺組織制作電鏡標(biāo)本，采用JEOL-1200EX透射電鏡觀察，MORADA-G2記錄。隨機(jī)選取10個(gè)不同的視野，記錄每個(gè)視野下自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量。(4)免疫組織化學(xué)染色：組織切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，隨機(jī)觀察5個(gè)不重復(fù)的高倍視野。免疫組化評(píng)分由陽(yáng)性染色深度評(píng)分乘以陽(yáng)性細(xì)胞比率評(píng)分得出。

二、結(jié)果

1．胰腺組織病理學(xué)改變：光鏡下觀察，SO組胰腺無(wú)明顯病理變化。AEP 3 h點(diǎn)可見局部葉間隙水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，6、12 h點(diǎn)可見彌漫性葉間隙水腫，小葉分離，腺泡間隙增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見少量出血。ANP組可見灶狀或大片狀壞死，腺泡結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。AEP組病理?yè)p傷評(píng)分較SO組顯著增加，ANP組評(píng)分又較AEP組顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AEP組6、12 h點(diǎn)評(píng)分較3 h點(diǎn)顯著增加(P<0.05)，但6、12 h點(diǎn)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ANP組損傷評(píng)分隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理評(píng)分

注：與SO組比較，aP<0.05；與AEP組比較，bP<0.05；與3 h AEP組比較，cP<0.05；與6 h ANP組比較，dP<0.05

2．血淀粉酶水平變化：AEP組、ANP組血清淀粉酶水平均較SO組明顯升高。

3．胰腺組織超微結(jié)構(gòu)改變：造模后3 h SO組細(xì)胞核核膜較完整，細(xì)胞器形態(tài)正常，偶見自噬溶酶體和自噬體；AEP組可見線粒體腫脹，并見較多自噬溶酶體和自噬體；ANP組見線粒體腫脹，內(nèi)膜損傷明顯，并可見較多自噬溶酶體和自噬體。每個(gè)電鏡視野AEP組自噬體與自噬溶酶體為(3.90±1.60)個(gè)，ANP組為(7.10±2.56)個(gè)，均較SO組中(1.40±1.17)個(gè)數(shù)量增加(P<0.05)，ANP組又較AEP組增加(P<0.05，圖1)。

圖1 SO組(1A)、AEP組(1B)、ANP組(1C)自噬體與自噬溶酶體電鏡圖(×15000)

4．胰腺組織LC3B、p62蛋白表達(dá)量變化：LC3B蛋白主要表達(dá)在腺泡細(xì)胞胞質(zhì)和胰島細(xì)胞胞質(zhì)中，p62蛋白表達(dá)在腺泡細(xì)胞、胰島細(xì)胞胞質(zhì)。SO組各時(shí)間點(diǎn)可見LC3B及p62少量表達(dá)，且各時(shí)間點(diǎn)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AEP組、ANP組LC3B及p62表達(dá)均較SO組顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。AEP組6、12 h點(diǎn)LC3B表達(dá)較3 h點(diǎn)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而6、12 h點(diǎn)LC3B表達(dá)及各時(shí)間點(diǎn)p62表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ANP組LC3B表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，各時(shí)間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2，圖2)，而各時(shí)間點(diǎn)p62表達(dá)無(wú)明顯變化。

討論自噬是細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器以及其他結(jié)構(gòu)的減員和自然更新的途徑，但其功能損傷時(shí)可引起一系列的病理反應(yīng)[5]。自噬過(guò)程被ATG基因所調(diào)控。LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母ATG8基因的同源物，LC3分為Ⅰ(A)型和Ⅱ(B)型。自噬發(fā)生時(shí)LC3-Ⅰ經(jīng)過(guò)與自噬膜結(jié)合合成LC3-Ⅱ。因?yàn)長(zhǎng)C3-Ⅱ始終結(jié)合在自噬體的膜上,所以其含量的多少與自噬體數(shù)量的多少呈正比[6-7]。p62(又名SQSTM1)是一種泛素結(jié)合蛋白，可與LC3-Ⅱ形成復(fù)合物，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入自噬溶酶體中，然后被降解。p62水平與自噬的活性呈反比，是檢測(cè)自噬活性的一個(gè)標(biāo)志蛋白[8]。通過(guò)對(duì)LC3檢測(cè)可以評(píng)價(jià)自噬體的數(shù)量，對(duì)p62檢測(cè)可以評(píng)估自噬的活性。

表2 各組LC3B、p62評(píng)分

注：與SO組比較，aP<0.05；與AEP組比較，bP<0.05；與3 h AEP組比較，cP<0.05；與6 h ANP組比較，dP<0.05

圖2 SO組(2A)，AEP組3、6、12 h(2B、2C、2D)，ANP組3、6、12 h(2E、2F、2G)LC3B(上)和p62(下)表達(dá)(×200)

本研究結(jié)果顯示，AEP組、ANP組與SO組比較，LC3B表達(dá)明顯增加，且隨病理?yè)p傷的加重而增加，ANP組與AEP比較，LC3B的表達(dá)量也明顯增加。此外在電鏡下也發(fā)現(xiàn)AEP和ANP組中自噬體和自噬溶酶體數(shù)目明顯增多。說(shuō)明自噬在AP中表達(dá)是增強(qiáng)的。

本結(jié)果顯示，p62蛋白在SO組未見積累，在AEP組和ANP組p62開始積累，但AEP組和ANP組中各時(shí)間點(diǎn)的積累無(wú)明顯變化。電鏡下觀察到AEP組和ANP組線粒體腫脹，其中ANP中可見線粒體損傷明顯。既然在AP中自噬是增加的，那么底物蛋白p62也應(yīng)該不斷的被降解，但結(jié)果恰好相反，可以解釋為自噬的降解水平降低了，表明自噬的功能受損。另外Mareninova等[2]同樣發(fā)現(xiàn)與饑餓時(shí)相比，胰腺炎中自噬的效率減低，使降解受抑制。

本研究的缺陷在于僅僅發(fā)現(xiàn)AP中自噬損傷的現(xiàn)象，但自噬損傷的機(jī)制并不明確，需要進(jìn)一步對(duì)自噬通路以及自噬與胰酶激活關(guān)系進(jìn)行研究。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.011

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(81560112)

518172 廣東深圳，深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院消化科(蘇濤)；南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院(蘇濤、劉丕、柯華婧、楊曉娟、李驥)

劉丕，Email:liupi1974@sina.com

2016-08-15)

冀凱宏)