朱建偉 朱惠云 蔣斐 安薇

纖調(diào)蛋白對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰腺星形細(xì)胞活化的影響

朱建偉 朱惠云 蔣斐 安薇

目的探討纖調(diào)蛋白(FMOD)在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰腺星形細(xì)胞(PSCs)活化中的作用。方法應(yīng)用靶向FMOD-shRNA(sh-FMOD)慢病毒感染PSCs，再用促氧化劑甲萘醌(MND)處理48 h(MND+sh-FMOD組)，以等容積DMSO處理的慢病毒感染的PSCs細(xì)胞為sh-FMOD組，親本細(xì)胞為對(duì)照組，MND處理的PSCs為MND組。采用RT-PCR法檢測(cè)PSCs活化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅲ型膠原蛋白α1(Col3α1)、Ⅰ型膠原蛋白α1(Col1α1)、金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)、整合素α1(α1-Integrin)mRNA表達(dá)。采用二丁基二氯化錫尾靜脈注射建立慢性胰腺炎(CP)大鼠模型。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠正常胰腺組織和CP胰腺組織中FMOD、α-SMA及抗氧化標(biāo)志物超氧化物歧化酶(SOD)、氧化標(biāo)志物丙二醛(MDA)蛋白表達(dá)。結(jié)果sh-FMOD組PSCs的FMOD mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降(0.16±0.03比1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明FMOD基因沉默成功。MND組PSCs的FMOD、α-SMA、Col3α1、Col1α1、TIMP1、α1-Integrin mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組顯著增加，而MND+sh-FMOD組PSCs的上述各基因表達(dá)量均較MND組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05或<0.01)。CP胰腺組織FMOD、α-SMA、SOD、MDA蛋白表達(dá)均較正常胰腺組織增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論氧化應(yīng)激通過(guò)誘導(dǎo)FMOD表達(dá)促進(jìn)PSCs活化。

胰腺炎，慢性； 胰腺星形細(xì)胞； 氧化性應(yīng)激； 纖調(diào)蛋白

慢性胰腺炎(CP)主要病理特征是胰腺纖維化。越來(lái)越多的研究表明胰腺星形細(xì)胞(pancreatic stellate cells, PSCs)的激活在胰腺纖維化中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。PSCs的激活受多種因素的調(diào)節(jié)，包括氧化應(yīng)激、酒精及代謝物、炎性因子及生長(zhǎng)因子等。其中氧化應(yīng)激是PSCs活化的重要調(diào)節(jié)因子之一。給予大劑量抗氧化劑可以減輕CP患者的氧化應(yīng)激及疼痛。纖調(diào)蛋白(fibromodulin，F(xiàn)MOD)是一種氧化應(yīng)激敏感的小分子蛋白，有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、黏附及細(xì)胞外基質(zhì)形成的作用。FMOD通過(guò)其富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域與膠原結(jié)合，并在體內(nèi)外調(diào)節(jié)膠原纖維的形成[1]。在肝纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MOD能激活肝星形細(xì)胞，使其過(guò)度表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及Ⅰ型膠原蛋白α1(Col1α1)，促進(jìn)肝星形細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。目前FMOD對(duì)PSCs的作用及其機(jī)制仍然不明確。 本研究旨在探討FMOD在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的PSCs活化中的作用。

材料和方法

一、FMOD shRNA慢病毒感染PSCs

PSCs為HPaSteC細(xì)胞系，購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司(貨號(hào)3830)，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，以MOI=50的比例將FMOD- shRNA(sh-FMOD)慢病毒感染細(xì)胞。sh-FMOD慢病毒購(gòu)自亞載生物公司，序列為5′-GGCGAGGTCATGAAGAAGA-3′。病毒感染按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

二、PSCs 總mRNA提取和實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增

慢病毒感染24 h后使用促氧化劑甲萘醌 (MND，A502486-0100，上海生物工程股份有限公司)處理的PSCs為MND+sh-FMOD組，等容積DMSO處理的慢病毒感染的PSCs為sh-FMOD組，親本細(xì)胞為對(duì)照組，MND處理的PSCs為MND組。48 h后收集細(xì)胞，用 Trizol(Invitrogen Life Technologies)抽提細(xì)胞總RNA，采用RT試劑盒(Fermentas公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)細(xì)胞FMOD mRNA及PSCs活化標(biāo)志物α-SMA、Ⅲ型膠原蛋白α1(Col3α1)、Col1α1、金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1)、整合素α1(α1-Integrin)mRNA的表達(dá)。引物由捷瑞公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。經(jīng)儀器自帶軟件獲取Ct 值，以對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)量為1，通過(guò)公式2-ΔΔCt計(jì)算各組細(xì)胞mRNA表達(dá)量。

表1 引物序列

三、慢性胰腺炎模型制備

將二丁基二氯化錫融入乙醇與甘油2∶3的混合液中。20只Wistar大鼠(清潔級(jí))購(gòu)于斯萊克公司。大鼠置于固定器中，消毒后將8 mg/kg體重的混合液注入鼠尾靜脈，術(shù)后禁食禁水8 h。以健康大鼠作為對(duì)照。

制模后4周處死大鼠，取胰腺組織置中性甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下讀片。CP組織診斷標(biāo)準(zhǔn)為胰腺結(jié)構(gòu)異常、腺泡萎縮、纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

四、免疫組織化學(xué)染色

取大鼠胰腺組織切片，常規(guī)行免疫組織化學(xué)染色觀察FMOD、α-SMA及抗氧化標(biāo)志物超氧化物歧化酶(SOD)、氧化標(biāo)志物丙二醛(MDA)蛋白表達(dá)。FMOD抗體(60108-1)購(gòu)于ProteinTech公司，1∶10稀釋；α-SMA(ab7817)、SOD(ab13498)、MDA抗體(ab6463)均購(gòu)于Abcam公司，分別以1∶200、1∶100、1∶50稀釋；Fibronectin 抗體(ab2413)購(gòu)于Abcam公司， 1∶250稀釋。二抗孵育1 h后PBS清洗3次，滴加DAB顯色，水洗終止染色后蘇木素襯染、水洗、75%鹽酸乙醇分化，流水沖洗、中性樹(shù)膠封固后恒溫箱烘烤過(guò)夜。以細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性染色。α-SMA、FMOD、SOD、MDA蛋白表達(dá)評(píng)分=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的值。染色強(qiáng)度：0分，無(wú)染色；1分，弱陽(yáng)性；2分，中度陽(yáng)性；3分，強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的值：1分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%，2分25%～50%，3分50%～75%，4分>75%。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組PSCs的FMOD及活化標(biāo)志物mRNA的表達(dá)

對(duì)照組、sh-FMOD組、MND組、MND+sh-FMOD組PSCs的FMOD、α-SMA、Col3α1、Col1α1、TIMP1、α1-Integrin mRNA表達(dá)量見(jiàn)表2。sh-FMOD組PSCs的FMOD mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降(t=21.53，P<0.01)，表明FMOD基因表達(dá)成功被抑制，而α-SMA、Col3α1、Col1α1、TIMP1、α1-Integrin mRNA表達(dá)量均無(wú)明顯改變。MND組PSCs的FMOD、α-SMA、Col3α1、Col1α1、TIMP1、α1-Integrin mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組顯著增加(t值分別為6.87、5.16、4.58、7.35、12.76、9.13)，而MND+sh-FMOD組PSCs的上述各基因表達(dá)量均較MND組下降(t值分別為4.23、3.43、3.06、3.85、3.01、7.14)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05或<0.01)。

二、造模后一般情況

3只大鼠在尾靜脈注射后8 h內(nèi)死亡，17只大鼠于4周后處死，15只大鼠胰腺均出現(xiàn)不同程度的結(jié)構(gòu)改變、纖維化、腺泡萎縮及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)，造模成功率為75%(15/20)，2只大鼠造模失敗。

圖1 對(duì)照組(1A)及CP組(1B)大鼠胰腺組織病理變化(HE ×200)

組別FMODα-SMACol3α1Col1α1TIMP1α1-Integrin對(duì)照組111111sh-FMOD組0.16±0.03a1.13±0.130.61±0.131.32±0.341.00±0.210.86±0.18MND組3.47±0.62a3.64±0.78a2.63±0.61a2.48±0.11a3.53±0.33a2.57±0.16aMND+sh-FMOD組1.65±0.41b2.07±0.11b1.39±0.33b1.59±0.38b2.11±0.74b1.55±0.19b

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與MND組比較，bP<0.05

三、對(duì)照組與CP組胰腺組織中FMOD、α-SMA、SOD、MDA蛋白表達(dá)

CP胰腺組織中FMOD、α-SMA、SOD、MDA蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組大鼠顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，圖2)。

討 論

CP的主要病理特征為胰腺纖維化， PSCs的發(fā)現(xiàn)及分離培養(yǎng)方法的建立[2]很大程度上推動(dòng)了胰腺纖維化的研究進(jìn)展。而越來(lái)越多的研究證據(jù)也表明PSCs的激活在胰腺纖維化中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[3]，因此，深入研究PSCs活化過(guò)程中的分子機(jī)制及信號(hào)通路為探討CP發(fā)病機(jī)制提供了新的視角[4]。阻斷PSCs活化的關(guān)鍵性信號(hào)通路是治療胰腺纖維化的關(guān)鍵所在。氧化應(yīng)激是PSCs活化的重要調(diào)節(jié)因子之一，其在不同病因所致的胰腺纖維化中均扮演了重要的角色[5-6]。氧化應(yīng)激可引起機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，導(dǎo)致過(guò)多活性氧在體內(nèi)聚集，從而激活PSCs介導(dǎo)胰腺纖維化的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，采用促氧化劑甲萘醌刺激PSCs可引起PSCs的活化標(biāo)志物表達(dá)量增高，而CP胰腺組織中氧化標(biāo)志物表達(dá)增加進(jìn)一步闡明了氧化應(yīng)激在PSCs的活化中的作用。

組別FMODα-SMASODMDA對(duì)照組1111CP組6.0±0.82.8±0.33.0±0.69.3±0.8t值6.1273.466.25P值0.00090.00040.01300.0033

圖2 正常大鼠(2A～2D ×100)及CP大鼠(2E～2H ×200)胰腺組織FMOD、α-SMA、SOD、MDA表達(dá)(免疫組化)

FMOD是維持正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的調(diào)節(jié)分子[7]，有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、黏附及細(xì)胞外基質(zhì)形成的作用，參與了原纖維生成、血管形成、組織損傷修復(fù)等過(guò)程，重組FMOD可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖、侵襲及遷移[8]。本研究結(jié)果顯示，CP胰腺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA表達(dá)增高，同時(shí)FMOD相應(yīng)表達(dá)增高，說(shuō)明氧化應(yīng)激可能通過(guò)誘導(dǎo)FMOD的表達(dá)引起PSCs活化。應(yīng)用shRNA干擾FMOD表達(dá)后，促氧化劑甲萘醌誘導(dǎo)PSCs活化的能力下降，說(shuō)明氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的PSCs活化依賴于FMOD的表達(dá)，提示抑制FMOD的表達(dá)或其生物學(xué)活性可阻斷氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的PSCs活化，進(jìn)而可改善胰腺纖維化。

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Effectsofoxidativestressontheactivationofpancreaticstellatecellsthroughtheup-regulationoffibromodulin

ZhuJianwei,ZhuHuiyun,JiangFei,AnWei.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai, 200433China

AnWei,Email:anweisusan@163.com

ObjectiveTo investigate the role of fibromodulin (FMOD) in the xidative stress induced activation of pancreatic stellate cells (PSCs).MethodsLentivirus containing ShRNA targeting FMOD (sh-FMOD) was transfected into PSCs, and then the prooxidant menadione (MND) was used to treat PSCs for 24 h (MND+sh-FMOD group). Lentivirus transfected PSCs cells treated by a equal volume of DMSO served as sh-FMOD group, parent cells as control group and PSCs treated by MND as MND group. RT-PCR were used to detect the mRNA expression of the markers of activated PSCs including α-SMA, Col3α1, Col1α1, TIMP1 and α1-integrin. Chronic pancreatitis (CP) rat model was induced by DBTC infusion into the tail vein. Immunohistochemical (IHC) staining was used to detect the protein expression of FMOD, FN, α-SMA, SOD and MDA in normal pancreatic tissue and CP tissue.ResultsFMOD mRNA expression of the PSCs in FMOD group was obviously lowerer than that in control group (0.16±0.03vs1), and the difference was statistically significant (P<0.01), indicating that FMOD was successfully silenced. The mRNA expression of FMOD, α-SMA, Col3α1, Col1α1, TIMP1 and α1-Integrin of PSCs in MND group was obviously higher than those in control group, which in MND+sh-FMOD group was lower than those in MND group, and the difference was statistically significant (P<0.05 or <0.01). Compared with those in normal pancreatic tissue, the protein expression of FMOD, α-SMA, SOD and MDA in CP tissue was up-regulated, and the difference was statistically significant (allP<0.05).ConclusionsOxidative stress can facilitate the activation of PSCs through the induction of fibromodulin expression.

Pancreatitis, chronic; Pancreatic stellate cells; Oxidative stress; Fibromodulin

FundprogramNational Natural Science Foundation of China(81400669)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.004

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

安薇，Email：anweisusan@163.com

國(guó)家自然基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81400669)

2017-02-10)

冀凱宏)