關(guān)玉雙 梁鳳鳴 王莉 王燕 黎紅梅 王瑩瑩 全穎

·實(shí)驗(yàn)研究·

杞黃顆粒對(duì)大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型組織中ICAM-1蛋白及mRNA表達(dá)水平的探討

關(guān)玉雙1梁鳳鳴1王莉1王燕2黎紅梅1王瑩瑩1全穎1

目的探討杞黃顆粒對(duì)激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管模型大鼠視網(wǎng)膜色素上皮層(RPE)一脈絡(luò)膜一鞏膜復(fù)合體ICAM-1蛋白含量及其mRNA表達(dá)水平的影響。方法選取BN大鼠81只,隨機(jī)選取13只為空白對(duì)照組,余68只大鼠右眼利用倍率532nm激光(功率300nw、曝光時(shí)間0.05s、光斑大小50um)光凝,建立CNV模型。光凝7天后,隨機(jī)選取3只大鼠,行FFA和OCT檢查,經(jīng)心臟灌注處死,分別做RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體鋪片檢測(cè)CNV的面積,驗(yàn)證大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型形成。余下65只造模大鼠隨機(jī)分為五組,即杞黃顆粒A組、杞黃顆粒B組、雷珠單抗組、杞黃顆粒+雷珠單抗組,模型組。造模成功后開(kāi)始給藥,用藥60天后總結(jié),杞黃顆粒B組用藥90天總結(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束采用心臟灌注處死,摘除右眼球,提取RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體,應(yīng)用Western blot技術(shù)分析ICAM-1蛋白含量,用Real-time PCR獲取ICAM-1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型組織形成過(guò)程中ICAM-1蛋白的表達(dá),5組ICAM-1/tublin差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.798,P<0.01);空白對(duì)照組ICAM-1/tublin均低于其他各組(P<0.01);模型組,杞黃顆粒組ICAM-1/tublin均高于杞黃顆粒+雷珠單抗組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);杞黃顆粒+雷珠單抗組、空白對(duì)照組、雷珠單抗組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);杞黃顆粒組和雷珠單抗組ICAM-1/tublin相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);60d杞黃顆粒組和90d杞黃顆粒組ICAM-1/tublin相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻讓?duì)照組ICAM-1mRNA表達(dá)均低于其他各組(P<0.01);模型組,杞黃顆粒組和雷珠單抗組ICAM-1mRNA表達(dá)均高于杞黃顆粒+雷珠單抗組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);杞黃顆粒組和雷珠單抗組ICAM-1基因表達(dá)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);90d杞黃顆粒組ICAM-1表達(dá)低于60d杞黃顆粒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論ICAM-1在CNV中存在高表達(dá)。雷珠單抗對(duì)ICAM-1的高表達(dá)有抑制作用,杞黃顆粒+雷珠單抗長(zhǎng)時(shí)間聯(lián)合使用的效果更好。

杞黃顆粒; 脈絡(luò)膜新生血管; ICAM-1

脈絡(luò)膜新生血管(Choroidal neovascularization,CNV)對(duì)視網(wǎng)膜破壞嚴(yán)重,常致視力不可逆下降或喪失,為多種眼底疾病的最終結(jié)局,主要發(fā)生CNV的眼底病如年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration,AMD)現(xiàn)已經(jīng)成為西方國(guó)家的首要致盲病因,我國(guó)發(fā)病率也逐年升高[1-2]。CNV的形成機(jī)制尚未完全闡明,已有研究發(fā)現(xiàn)主要有多種細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)參與CNV的形成過(guò)程,這些新生血管生長(zhǎng)因子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular en- dothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、色素上皮衍生因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和其他一些炎性細(xì)胞因子等[3-5]。近年發(fā)現(xiàn)VEGF受到上下游通路缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)等多因素調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CNV模型,觀察杞黃顆粒對(duì)RPE一脈絡(luò)膜一鞏膜復(fù)合體ICAM-1蛋白含量和基因表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物

健康雄性BN大鼠81只,體重200～250g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)前雙眼前節(jié)和眼底檢查均正常。每只大鼠隨機(jī)取右眼為實(shí)驗(yàn)眼,左眼為對(duì)照眼。

1.1.2儀器設(shè)備

532nm 倍頻Ng YAG激光器(法國(guó)Quantel Medical公司);熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)和吲哚菁綠血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)攝像機(jī)(德國(guó)Heidelberg公司);光學(xué)相干斷層掃描儀(OCT,德國(guó)Heidelberg公司),LV 100激光共焦顯微鏡(日本 Olympus公司);蔡司200眼科手術(shù)顯微鏡等。

1.1.3試劑

復(fù)方托吡卡胺滴眼液(卓比安,沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司),1%戊巴比妥鈉(上海泰瑞爾生物技術(shù)有限公司),若丹明標(biāo)記的蓖麻子凝集素(美國(guó)Vector公司),10%熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司),吲哚菁綠注射液(河南新華化工貿(mào)易公司),雷珠單抗注射液(Lucentis,Genentech公司),HFI-1一抗、VEGF一抗、ICAM-1一抗(Proteintech公司)等。

1.2 方法

1.2.1CNV動(dòng)物模型的建立及驗(yàn)證

選體重200～250g健康雄性BN大鼠81只,隨機(jī)選取13只為空白對(duì)照組,其余68只大鼠均利用倍率532nm激光(功率300nw、曝光時(shí)間0.05s、光斑大小50um)光凝方法,經(jīng)1%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉,復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后,通過(guò)裂隙燈和載玻片將倍頻532nm激光導(dǎo)入大鼠眼內(nèi)。避開(kāi)大血管,每眼距視盤(pán)1.5～2.0PD圍繞視盤(pán)在視網(wǎng)膜血管之間光凝10個(gè)點(diǎn),激光功率300mw,光凝斑直徑50um,光凝時(shí)間0.05S。以光凝后有氣泡產(chǎn)生為度,表示已擊破Bruch膜。造模后第7天,68只大鼠中隨機(jī)選取3只大鼠,均行OCT、FFA驗(yàn)證CNV形成。

1.2.2FFA和OCT檢測(cè)

分別于光凝后每組隨機(jī)抽取3只大鼠,散瞳及麻醉后,麻醉方法同前,腹腔內(nèi)注射10%熒光素鈉注射液1ml/kg,立即通過(guò)德國(guó)海德堡眼底血管造影儀連續(xù)觀察,觀察時(shí)間為30min,觀察時(shí)間點(diǎn)分別為2min,5min,15min,30min。OCT檢查采用視網(wǎng)膜顳側(cè)后極部和視盤(pán)中心連線的直線橫向線性掃描,長(zhǎng)度2.8mm,深度2mm,每只眼睛重復(fù)5次,以觀察CNV滲漏情況。

1.2.3病理鋪片制作及觀察

3只模型大鼠過(guò)量麻醉大鼠,經(jīng)心臟灌注400mL生理鹽水和400mL4%多聚甲醛,摘除右眼球,在4%多聚甲醛中后同定30min,然后置PBS中2h。顯微鏡下去除角膜、晶狀體和視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺(jué)層。在剩余的RPE一脈絡(luò)膜一鞏膜復(fù)合體做6～8個(gè)放射狀切口,使之展平。將鋪片置于1%Triton X-100中室溫放置24h。接著與若丹明標(biāo)記的蓖麻子凝集素(1:1000)在室溫下避光孵育24h。最后于TBS緩沖液中避光洗滌24h。將鋪片在載玻片上展平,水性封片劑封片后激光共焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4動(dòng)物分組及給藥

除驗(yàn)證CNV模型成立3只大鼠外,剩余65只模型BN大鼠隨機(jī)分為5組,即杞黃顆粒A組、杞黃顆粒B組、雷珠單抗組、杞黃顆粒+雷珠單抗組、模型組。每組均13只。造模后7天開(kāi)始給藥,用藥2個(gè)月后總結(jié)。杞黃顆粒B組用藥90天后總結(jié)?？瞻讓?duì)照組、模型組用生理鹽水灌胃,每日1次,每日用量不超過(guò)2ml,灌胃周期60天;杞黃顆粒組和杞黃顆粒+雷珠單抗組均行杞黃顆粒灌胃,每日1次,每次每只鼠杞黃顆粒藥量為1g,溶解于水中,灌胃量以1ml/100g體重,以每只鼠灌胃量不超過(guò)2ml為標(biāo)準(zhǔn);雷珠單抗組、杞黃顆粒+雷珠單抗組在造模后行玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗注射液,每月1次,注藥量3UL/眼,周期為60天,共計(jì)注藥3次。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)

具體步驟如下:(1)配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠(下層分離膠,單面),混勻后,迅速灌膠至玻璃板總高度的約2/3位置,而后在凝膠上方加入水飽和正丁醇1 mL以保證凝膠上層的平整,靜置待膠凝固。(2)配制SDS變性5%聚丙烯酰胺凝膠(上層積層膠,單面),混勻后,迅速灌膠至填滿玻璃板,插入梳子,靜置待膠凝固。電泳前拔去梳子,將凝膠置于1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液中,并用注射器針頭吹凈上樣孔。(3)將蛋白樣品與5×上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)混合后,煮沸變性5 min,冰浴5 min。取合適量的蛋白樣品上樣,進(jìn)行SDS變性10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),直至目的蛋白有效分離后停止電泳。(4)電轉(zhuǎn)膜:電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上(Millipore,USA),100mA,90min。(5)封閉:將硝酸纖維素膜做標(biāo)記以區(qū)分正反面及左右側(cè),浸入Blotto 封閉液中,室溫?fù)u床上輕輕搖動(dòng)2小時(shí)。(6)與一抗的結(jié)合:將膜置于含對(duì)應(yīng)一抗的Blotto中在搖床上4℃輕輕搖動(dòng)過(guò)夜。(7)在1×TBST中搖動(dòng)浸洗3次×5分鐘,洗去非特異結(jié)合的一抗。(8)與二抗的結(jié)合:將膜浸入含相應(yīng)HRP-羊抗兔IgG的Blotto中,室溫輕輕搖動(dòng)2h。(9)在1×TBST中搖動(dòng)浸洗3次×5分鐘,洗去非特異結(jié)合的二抗。(10)最后用Western Lightning○R-ECL,Enhanced Chemiluminescence Substrate(Perkin Elmer,NEL100001EA)檢測(cè),顯影。(11)立即將膜置于曝光盒中,并在暗室中對(duì)感光膠片進(jìn)行曝光1 min,而后進(jìn)行顯影、定影處理。(12)膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像,分析各條帶的亮度值并繪制柱狀圖。

1.2.6RT-PCR分析ICAM-1的mRNA表達(dá)水平

杞黃顆粒B組造模90天,余各組干預(yù)60天,處死方法同前,以同樣方法獲取RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體。用紫外分光光度法測(cè)定RNA純度及濃度,mRNA的A260/A280的值均在1.8～2.0范圍內(nèi)。取1μg樣品,進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。80V,10～15分鐘。取2ug RNA運(yùn)用Promega MMLV返轉(zhuǎn)錄酶(Cat No: 9PIM170)及相關(guān)試劑進(jìn)行返轉(zhuǎn)錄反應(yīng),將總RNA反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的DNA。

運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ICAM-1、β-actin的部分CDS區(qū)。ICAM-1-S:5'-CTGCCTCAGGGATCCGTAAAG-3',ICAM-1-AS:5'-CCTCTGCCTCAGGAATGACAT-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為299bp。β-actin-S:5'-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3',β-actin -AS:5'-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為78bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間均值差異性采用軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。計(jì)量資料進(jìn)行F檢驗(yàn),用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FFA和OCT的觀察

腹腔注入熒光素鈉約2min后開(kāi)始顯影,正常BN大鼠視網(wǎng)膜血管充盈呈放射狀,光凝后2周,FFA顯示光凝斑中CNV陽(yáng)性部分為動(dòng)脈早期呈現(xiàn)血管性強(qiáng)熒光,且造影后期熒光素持續(xù)增強(qiáng)擴(kuò)散的高熒光區(qū)。OCT可見(jiàn)團(tuán)塊或不規(guī)則高反射灶。見(jiàn)圖1,圖2。

圖1 FFA檢查示光斑處CNV滲漏情況

圖2 OCT檢查眼底所見(jiàn)

2.2 檢測(cè)ICAM-1的蛋白表達(dá):見(jiàn)表1,表2,圖3,圖4

2.2.160天各組ICAM-1的蛋白表達(dá)采用單因素方差分析,5組ICAM-1/tublin差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.798,P<0.01)。模型組,杞黃組,雷珠單抗組ICAM-1/tublin均高于空白對(duì)照組(P<0.01),模型組,杞黃組ICAM-1/tublin均高于杞黃顆粒+雷珠單抗組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),杞黃顆粒+雷珠單抗組跟空白對(duì)照組和雷珠單抗組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

2.2.260天與90天杞黃顆粒組ICAM-1的蛋白表達(dá)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),60d杞黃和90d杞黃ICAM-1/tublin相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 60天各組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體ICAM-1蛋白含量比較

注：與空白對(duì)照組比較,☆P<0.01;與杞黃顆粒+雷珠單抗組比較,△P<0.01

表2 60天與90天杞黃顆粒組ICAM-1蛋白含量比較

2.2.360天各組兩兩比較ICAM-1的蛋白表達(dá)

空白對(duì)照組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01);空白對(duì)照組與杞黃顆粒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01);空白對(duì)照組與雷珠單抗組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002<0.01);空白對(duì)照組與杞黃顆粒+雷珠單抗組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.148>0.05);杞黃+雷抗組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01);杞黃+雷抗組與杞黃顆粒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.06>0.05);杞黃+雷抗組與雷抗組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.070>0.05);杞黃顆粒組和雷珠單抗組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.307>0.05)。

2.3 檢測(cè)ICAM-1的mRNA表達(dá)水平：見(jiàn)表3,表4,圖5,圖6。

2.3.160天各組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體mRNA表達(dá)采用單因素方差分析,5組ICAM-1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.396,P<0.01)。模型組,杞黃顆粒組,雷珠單抗組和杞黃顆粒+雷珠單抗組ICAM-1表達(dá)均高于空白對(duì)照組(P<0.01),模型組,杞黃顆粒組和雷珠單抗組ICAM-1表達(dá)均高于杞黃顆粒+雷珠單抗組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖3 60天各組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體中ICAM-1的蛋白表達(dá)

圖4 60天與90天杞黃顆粒組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體中ICAM-1蛋白的表達(dá)

表3 60天各組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體mRNA表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較,☆P<0.01;與杞黃顆粒+雷珠單抗組比較,△P<0.01

2.3.260天與90天杞黃顆粒組RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體mRNA表達(dá)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),90d杞黃ICAM-1表達(dá)低于60d杞黃,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表4 60天與90天杞黃顆粒組mRNA表達(dá)比較

2.3.360天各組兩兩比較RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體mRNA表達(dá)

空白對(duì)照組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01);空白對(duì)照組與杞黃顆粒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01);空白對(duì)照組與雷珠單抗組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01);空白對(duì)照組與杞黃顆粒+雷珠單抗組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010<0.05);杞黃+雷抗組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01);杞黃+雷抗組與杞黃顆粒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01);杞黃+雷抗組與雷抗組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013<0.05);杞黃顆粒組和雷珠單抗組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01)。

圖5 60天各組ICAM-1的表達(dá)

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)VEGF下游調(diào)控因子有ICAM-1和骨髓來(lái)源細(xì)胞(BMCs),其中ICAM-1為主要的下游調(diào)控因子。ICAM-1是一種具有廣泛生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)因子[6]。在VEGF調(diào)控下,ICAM-1介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的粘附,釋放各種酶和自由基,增加血管通透性并損傷內(nèi)皮細(xì)胞,最終導(dǎo)致CNV形成。VEGF是一種促炎細(xì)胞因子,在增加血管滲透性及新生血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。玻璃體腔注射VEGF可以誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜組織白細(xì)胞聚集,內(nèi)皮細(xì)胞黏附增強(qiáng),血管通透性增加,毛細(xì)血管無(wú)灌注,同時(shí)引起視網(wǎng)膜組織中ICAM-1水平升高,VEGF一方面可能通過(guò)增加視網(wǎng)膜ICAM-1的表達(dá),使白細(xì)胞黏附于視網(wǎng)膜血管,從而引起血管破壞;另一方面可能通過(guò)加強(qiáng)主動(dòng)運(yùn)輸誘血管滲透性增加[7]。

中醫(yī)認(rèn)為,CNV形成主要與肝火旺,腎精虧,以致氣虛無(wú)以攝血,陰虧血熱妄行所致[8]。然而CNV屬于“血證”“久病入絡(luò)”、“敗絡(luò)叢生”,為惡證,預(yù)后不良。杞黃顆粒方藥主要成分是枸杞子,楮實(shí)子,茺蔚子,丹參等。梁鳳鳴教授認(rèn)為方中枸杞子補(bǔ)肝益腎兼以明目,楮實(shí)子,茺蔚子以清肝明目,丹參等藥等活血化瘀理念貫穿始終,從而達(dá)到標(biāo)本兼治的目的[9]。應(yīng)用杞黃顆粒能使眼脈通暢,敗絡(luò)消退,則脈絡(luò)膜新生血管有望得到良好防治。

本實(shí)驗(yàn)中90d杞黃顆粒組ICAM-1表達(dá)低于60d杞黃顆粒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.928,P<0.01),提示使用杞黃顆粒90天對(duì)于改善CNV有一定的作用。杞黃顆粒組,雷珠單抗組和杞黃顆粒+雷珠單抗組ICAM-1表達(dá)均高于空白對(duì)照組(P<0.01),杞黃顆粒組和雷珠單抗組ICAM-1表達(dá)均高于杞黃顆粒+雷珠單抗組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示雷珠單抗對(duì)ICAM-1的表達(dá)有抑制作用,杞黃顆粒聯(lián)合雷珠單抗長(zhǎng)時(shí)間使用的效果更強(qiáng)。杞黃顆粒通過(guò)改善組織缺氧狀態(tài),通過(guò)下調(diào)下游通路ICAM-1表達(dá),使中性粒細(xì)胞的粘附作用減弱,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕,血管通透性下降,CNV形成減少。中醫(yī)藥治療AMD具有悠久的歷史和獨(dú)特優(yōu)勢(shì),雖然目前中醫(yī)藥治療仍然難以清除脈絡(luò)膜新生血管,但在血管新生關(guān)鍵因子的調(diào)節(jié)方面能夠起到積極作用,尤其在防止黃斑反復(fù)出血和提高視覺(jué)質(zhì)量方面有效,因此通過(guò)研究開(kāi)發(fā)中藥來(lái)尋找治療AMD的有效藥物不失為一種好的方向和思路[10-12]。

[1] 吉祥,胡竹林.年齡相關(guān)性黃斑變性的治療研究進(jìn)展[J].國(guó)際眼科雜志,2011,11(2)：279-281.

[2] 王小琴,謝青.年齡相關(guān)性黃斑變性的治療進(jìn)[J].海南醫(yī)學(xué),2012,23(10):127-130.

[3] 艾明搖,楊芳搖,李岱.脈絡(luò)膜新生血管形成機(jī)制的研究進(jìn)展[J].臨床眼科雜志,2011,19(4):372-374.

[4] 麻南,賀翔鴿.Bevaeizumab與Ranibizumab治療新生血管性眼病的療效及安全性的Meta分析[J].中華眼科雜志,2010,46(3):263-267.

[5] 張喜梅,李棟.色素上皮衍生因子抑制脈絡(luò)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究[J].山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,21(4):1-3.

[6] 李霞,高曉唯,郭繼華,任兵,李慧,趙勇.高危角膜移植免疫排斥反應(yīng)中ICAM-1的作用[J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué),2007,(02):84-88.

[7] Zhang XL,Wen L,Chen YJ,etal.Vascular endothelial growth factor up-regulates the expression of intracellular adhesion mole cule-l in retinal endothelial cells via reactive oxygen species,but not nitric oxide[J].Chin Med J,2009,122(3):338-343.

[8] 孟梁,梁鳳鳴.中醫(yī)藥治療脈絡(luò)膜新生血管相關(guān)疾病的現(xiàn)狀[J].遼寧中醫(yī)雜志,2016,(12):2670-2672.

[9] 張欣桐,梁鳳鳴,王莉,等.杞黃顆粒對(duì)肝腎陰虛型年齡相關(guān)性黃斑變性臨床證候的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2017,(03):187-190.

[10] 安利娜,魏偉.年齡相關(guān)性黃斑變性的中醫(yī)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)眼科雜志,2009,19(6):365-367.

[11] 劉紅宇.中醫(yī)藥治療年齡相關(guān)性黃斑變性的研究概況[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2011,7(2):162-163.

[12] 盧輝.年齡相關(guān)性黃斑變性中醫(yī)藥治療進(jìn)展[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,(4):291-293.

StudyontheexpressionlevelsofICAM-1proteinandmRNAofratmodelofchoroidalneovascularizationtissuesaffectedbyQiHuanggranule

GUANYu-shuang,LIANGFeng-ming,WANGLi,WANGYan,LIHong-mei,WANGYing-ying,QUANYing

(1.FirstTeachingHospitalofTianjinUniversityofTCM,Tianjin,China,300000;2.GuangdongProvinceTraditionalChineseMedicalHospital,Guangdong,China,510000)

ObjectiveAims:To study the effect on ICAM-1 protein and mRNA of Retinal pigment epithelium(RPE)-choroid-sclera complex of Laser-induced Choroidal neovascularization rat model affected by Qi Huang granule.MethodsWe selected 81 BN rats in which 13 rats were selected to be blank control group randomly and other 68 rats whose right eyes were photocoagulated by laser of 532nm magnification(300nw power,0.05s exposure time,the beam size of 50um)to establish CNV model.After 7 days photocoagulation,3 rats were selected to be examined by FFA and OCT and undergo cardiac perfusion to death and then RPE-choroid- sclera complex surface preparation were made respectively detecting the CNV area to verify that the formation of Choroidal neovascularization model in rats.The other 65 rats were randomly divided into five groups,which were Qi Huang granule A group,Qi Huang granule B group,Lei Zhu monoclonal antibody group,Qi Huang granule plus Lei Zhu monoclonal antibody group and model group.Drugs were given after successful model and summed up after 60 days,while Qi Huang granule B group was summed up after 90 days.At the end of the experiment cardiac perfusion of death was used,right eyeballs were removed and RPE-choroid- sclera complex was retracted,and,we used Western Blot to analyze ICAM-1 protein levels and Real-time PCR to attain ICAM-1 mRNA expression level.Resultslaser induced the expression of ICAM-1 protein of CNV model of rats during the process of tissue formation.The difference of ICAM-1/tublin in five groups was statistically significant(F=22.798,P<0.01).ICAM-1/tublin in the blank control group was lower than that in all of the other groups(P<0.01).ICAM-1/tublin in the model Group and Qi Huang granule group were both higher than that in the Qi Huang granule+ Ranibizumab group and the difference was statistically significant(P<0.01).There was no significant difference among Qi Huang granule+ Ranibizumab group,blank control group and Ranibizumab group(P>0.05).The difference of ICAM-1/tublin between Qi Huang granule group and Ranibizumab group was not statistically significant(P>0.05).The difference of ICAM-1/tublin between 60d and 90d Qi Huang granule group was not statistically significant(P>0.05).The expression of ICAM-1mRNA in blank control group was lower than that in all of the other groups(P<0.01).The expression of ICAM-1mRNA in model Group,Qi Huang granule group and Ranibizumab group were higher than that in Qi Huang granule+ Ranibizumab group and the difference was statistically significant(P<0.05).The difference of the expression of gene between Qi Huang granule and Ranibizumab group was statistically significant(P<0.01).The expression of ICAM-1 in 90d Qi Huang granule group was lower than that in 60d Qi Huang granule group and the difference was statistically significant(P<0.01).ConclusionThere is high expression of ICAM-1 existing in CNV.Ranibizumab could suppress the high expression of ICAM-1.Qi Huang granule+ Ranibizumab long used in conjunction is more effective.

Qihuang granule; Choroidal neovascularization; ICAM-1

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目:基于VEGF上下游調(diào)控通路探討杞黃顆粒對(duì)脈絡(luò)膜新生血管形成的干預(yù)機(jī)制(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào):81373694)

1.300000,中國(guó)天津,天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院;2.510000,中國(guó)廣東,廣東省中醫(yī)院

梁鳳鳴,E-mail:liangfm66@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.001

R77