王小連，郄麗萍，馬 婕，代明偉，鄧佩佩

(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

紫外-ARTP復合誘變選育達巴萬星前體高產(chǎn)菌株

王小連，郄麗萍，馬 婕，代明偉，鄧佩佩*

(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

采用紫外-常壓室溫等離子體(ARTP)技術(shù)對達巴萬星前體產(chǎn)生菌野野村放線菌屬(Nonomuriaspp.)菌株DW-3-19進行復合誘變，并進行鏈霉素抗性突變選育，獲得了具有穩(wěn)定遺傳性的高產(chǎn)菌株，該菌株發(fā)酵單位比出發(fā)菌株提高了68.7%。表明，ARTP技術(shù)可有效應用于放線菌的誘變選育，紫外-ARTP復合誘變可提高達巴萬星前體發(fā)酵單位，降低生產(chǎn)成本，為短時間內(nèi)獲得穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)菌株提供了可行的方法。

達巴萬星前體；紫外誘變；ARTP誘變；致死率；正突變率

達巴萬星(dalbavancin)是一種新型半合成糖肽抗生素，由Durata公司開發(fā)，于2014年5月23日獲FDA批準上市。達巴萬星是由5種緊密相關(guān)的活性同系物A0、A1、B0、B1 和B2組成的混合物，其中B0是主要組分。這5種化合物均以天然抗生素A-40926為前體合成[1]。A-40926B0由野野村放線菌屬(Nonomuriaspp.)發(fā)酵產(chǎn)生，與替考拉寧有著相似的構(gòu)型與活性[2]，對革蘭氏陽性菌導致的急性細菌性皮膚感染及軟組織感染有很好療效，對減少耐藥性細菌的產(chǎn)生和維持其它抗菌藥物的有效性也有顯著效果[3-5]。

常壓室溫等離子體(ARTP)中的有效粒子作用于微生物，能夠使其細胞壁或細胞膜的結(jié)構(gòu)和通透性改變，并引起基因突變，進而導致微生物性狀和代謝變化。ARTP誘變育種具有操作簡單、突變率高、安全性高、易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株等優(yōu)點，已成功運用到真菌、細菌等微生物的菌種選育，成為微生物快速突變的有效手段[6-8]。

作者在此采用紫外-ARTP技術(shù)對達巴萬星前體產(chǎn)生菌野野村放線菌屬菌株DW-3-19進行復合誘變，并進行鏈霉素抗性突變選育，以期獲得具有遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)菌株。

1 實驗

1.1 菌株、試劑與儀器

放線菌DW-3-19，自行保藏。

A-40926B0標準品，美國Sigma公司；酵母膏，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；玉米漿，華北制藥康欣有限公司；工業(yè)蛋白胨，英國OXOID公司；工業(yè)酵母粉(工業(yè)級)。

常壓室溫等離子體誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；LA-2010A型高效液相色譜儀，日本島津公司；紫外誘變箱，自制。

1.2 培養(yǎng)基

斜面及普通分離平板培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨5，酵母粉3，瓊脂20，消前pH值7，121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：淀粉20，工業(yè)蛋白胨12，工業(yè)酵母粉20，碳酸鈣8，pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：淀粉32，工業(yè)蛋白胨5，玉米漿12，棉籽餅粉5，L-纈氨酸1，碳酸鈣2，pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 單孢子懸液的制備

用10 mL無菌生理鹽水洗下斜面孢子，在裝有十幾塊玻璃渣的錐形瓶中振蕩打散，過濾，制成濃度為107個·mL-1的單孢子懸液。

1.3.2 紫外誘變

取5 mL出發(fā)菌株DW-3-19單孢子懸液于9 cm玻璃平皿中，進行紫外誘變后，涂布分離平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間，挑選存活突變株進行搖瓶初篩和復篩，得到突變株DW-4-127。

紫外誘變條件：功率15 W，波長254 nm，誘變距離36 cm，誘變時間0～90 s。

搖瓶培養(yǎng)方法：用接種鏟將斜面菌種接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、220 r·min-1搖瓶培養(yǎng)48 h，然后以10%接種量接種到裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)7 d。

1.3.3 ARTP誘變及鏈霉素抗性突變株選育

取10 μL突變菌株DW-4-127菌懸液均勻涂布在不銹鋼載片上，按預定程序進行ARTP誘變；將不銹鋼載片投入裝有1 mL無菌生理鹽水的離心管中，振蕩1 min，回收菌體；用生理鹽水稀釋誘變過的菌懸液，涂布于鏈霉素抗性培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)7～9 d，挑選存活突變株按1.3.2搖瓶培養(yǎng)方法進行初篩和復篩，得到突變菌株DW-5-52。

ARTP誘變條件：高純氦氣，功率120 W，工作氣流量10 L·min-1，誘變距離2 mm，誘變時間為0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s。

1.3.4 效價測定

用6 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至10.5左右，搖勻，靜置1 h；取3 mL用相同體積乙醇浸提，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用有機濾膜過濾，采用HPLC法測定A-40926B0組分的含量[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變選育

2.1.1 紫外誘變時間的選擇

紫外誘變是實驗室最常用而且有效的誘變育種方法，它能引起微生物的DNA結(jié)構(gòu)改變。放線菌DW-3-19紫外誘變0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s后的致死率和正突變率如圖1所示。

圖1 紫外誘變時間對致死率、正突變率的影響Fig.1 Effect of UV mutagenic time on death rate and positive mutation rate

由圖1可以看出，放線菌DW-3-19紫外誘變45 s時的正突變率最高，為14.5%。放線菌DW-3-19對紫外照射較敏感，較高的致死率有利于篩選優(yōu)良菌株，但如果紫外照射時間過長，一些活性高的菌株也可能致死；考慮到紫外誘變后仍有其它誘變處理，致死率也不宜過高。因此，選擇45 s作為紫外誘變時間。

2.1.2 紫外誘變突變株的選育

將紫外誘變后的菌懸液稀釋一定倍數(shù)后涂布到分離平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7～9 d后挑取975株形態(tài)良好的單菌落，經(jīng)搖瓶初篩、復篩后得到突變菌株DW-4-127，其發(fā)酵單位比出發(fā)菌株DW-3-19提高了33.5%。

2.2 ARTP 誘變及鏈霉素抗性突變株的選育

2.2.1 菌懸液溶劑對ARTP誘變的影響

無菌生理鹽水制備的菌懸液在ARTP誘變過程中容易干燥，誘變時間越長干燥越明顯，菌體致死率越高。因此，有必要對ARTP誘變過程中的菌懸液溶劑進行篩選。表1為3種菌懸液溶劑對ARTP誘變致死率的影響。

表1 菌懸液溶劑對ARTP誘變致死率的影響

由表1可知，無菌生理鹽水菌懸液在ARTP誘變過程中水分揮發(fā)加速，導致胞外高鹽環(huán)境，增大了誘變損傷，ARTP誘變40 s致死率就達到100%；10%甘油菌懸液的致死率隨ARTP誘變時間的延長逐漸升高，在誘變40 s內(nèi)均能保持菌懸液液體狀態(tài)，有效降低了ARTP誘變對菌體造成的干燥損傷；30%甘油具有脫水作用，導致菌體脫水死亡，ARTP誘變50 s時致死率就達到100%。因此，選擇10%甘油制備菌懸液進行ARTP誘變。

2.2.2 ARTP誘變時間的選擇

用10%甘油制備DW-4-127菌懸液，ARTP誘變0 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s后的致死率和正突變率見表2。

由表2可知，隨著ARTP誘變時間的延長，致死率逐漸升高，正突變率則先升高后降低，在30 s時達到最高，此時致死率也在合適的范圍。因此，選擇30 s作為ARTP誘變時間。

表2 ARTP誘變時間對致死率、正突變率的影響

2.2.3 鏈霉素最低抑制濃度的確定

制備鏈霉素濃度為0.2～1.0 mg·L-1的抗性培養(yǎng)基平板，涂布ARTP誘變菌懸液，28 ℃培養(yǎng)7～9 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鏈霉素濃度的增大，抗性培養(yǎng)基平板上生長的菌落逐漸減少，當鏈霉素濃度增大到0.6 mg·L-1時，抗性培養(yǎng)基平板上已無菌生長，可見鏈霉素對菌株DW-4-127的最低抑制濃度為0.6 mg·L-1。

2.2.4 鏈霉素抗性突變株的選育

突變菌株DW-4-127經(jīng)ARTP誘變后涂布于鏈霉素濃度為0.6 mg·L-1的抗性培養(yǎng)基平板上，挑選400株進行搖瓶初篩和復篩獲得一株高產(chǎn)菌株DW-5-52，其發(fā)酵單位比突變菌株DW-4-127提高了23.9%，比出發(fā)菌株DW-3-19提高了68.7%。

2.3 高產(chǎn)菌株DW-5-52的遺傳穩(wěn)定性

采用斜面?zhèn)鞔姆椒ǎ猿霭l(fā)菌株DW-3-19為對照(發(fā)酵單位以100計)，考察DW-4-127和DW-5-52的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見圖2。

圖2 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of high-yield strain

由圖2可以看出，紫外誘變得到的突變菌株DW-4-127的遺傳穩(wěn)定性不太好，發(fā)酵單位在斜面?zhèn)鞔?代后就明顯下降，高產(chǎn)特性基本消失；而紫外-ARTP復合誘變得到的高產(chǎn)菌株DW-5-52斜面?zhèn)鞔?次的發(fā)酵單位仍然很高，遺傳穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

以放線菌DW-3-19為出發(fā)菌株，采用紫外-ARTP技術(shù)對其進行復合誘變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫外誘變得到的突變菌株DW-4-127的發(fā)酵單位比出發(fā)菌株提高了33.5%，但傳代到第4代出現(xiàn)菌種衰退現(xiàn)象；突變菌株DW-4-127經(jīng)ARTP誘變復合0.6 mg·L-1鏈霉素抗性選育獲得的高產(chǎn)菌株DW-5-52的發(fā)酵單位比突變菌株DW-4-127提高了23.9%，比出發(fā)菌株DW-3-19提高了68.7%，且遺傳穩(wěn)定性很好。表明，采用紫外-ARTP復合誘變，再結(jié)合鏈霉素抗性選育可有效避免單一誘變劑產(chǎn)生的誘變飽和效應、大幅降低后期篩選量、大幅提高正突變率，為短時間內(nèi)獲得穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)菌株提供了可行的方法。

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BreedingofDalbavancinPrecursorHigh-YieldStrainbyUV-ARTPCompositeMutagenesis

WANG Xiao-lian,QIE Li-ping,MA Jie,DAI Ming-wei,DENG Pei-pei*

(NewDrugResearch&DevelopmentCompanyofNCPC,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,Shijiazhuang050015,China)

Dalbavancin precursor-producing strainNonomuriaspp.DW-3-19 was breeded by UV-atmospheric and room temperature plasma(ARTP) composite mutagenesis and streptomycin-resistant mutant screening.The results showed that a high-yield strain possessing stable genetic performance could be obtained using the composite mutagenesis，and the transformation efficiency was increased by 68.7% over the starting strain.The results also show that ARTP mutagenesis can be effectively used for the mutagenic breeding ofActinomycetes.UV-ARTP composite mutagenesis can improve the fermentation unit of dalbavancin precursor,reduce production cost,and obtain the high-yield strain with stable genetic performance in a short time.

dalbavancin precursor;UV mutagenesis;ARTP mutagenesis;death rate;positive mutation rate

河北省科技條件建設(shè)項目(中央引導地方科技創(chuàng)新專項)(169676404G)

2017-08-11

王小連(1983-)，女，河北石家莊人，工程師，從事生物制藥研究，E-mail:wangtongxi2002@163.com；通訊作者：鄧佩佩，工程師，E-mail:401693740@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.12.014

王小連，郄麗萍，馬婕，等.紫外-ARTP復合誘變選育達巴萬星前體高產(chǎn)菌株[J].化學與生物工程，2017，34(12)：59-62.

TQ465.92 TQ920.1

A

1672-5425(2017)12-0059-04