成 磊，李 泉，葛保勝，于道永

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院 生物工程與技術(shù)中心，山東 青島 266580)

固定化脂肪酶催化花生油轉(zhuǎn)酯化特性研究

成 磊，李 泉，葛保勝，于道永*

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院 生物工程與技術(shù)中心，山東 青島 266580)

利用固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶催化花生油與甲醇進行酯交換反應(yīng)，考察了反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、酶用量、醇油比、含水量等因素對轉(zhuǎn)酯化率的影響，研究了花生油中主要脂肪酸的酶催化轉(zhuǎn)酯化特性。通過正交實驗確定最優(yōu)轉(zhuǎn)酯化條件為：花生油用量3 g、反應(yīng)時間48 h、反應(yīng)溫度35 ℃、酶用量450 mg、醇油比3∶1、含水量8%，在此條件下，花生油轉(zhuǎn)酯化率達到90.58%?；ㄉ椭兄饕舅徂D(zhuǎn)酯化的影響因素顯著性以及轉(zhuǎn)酯化的最優(yōu)反應(yīng)條件并不相同，表明花生油中不同脂肪酸的固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化特性有所不同。

固定化脂肪酶；轉(zhuǎn)酯化；花生油；甲醇

隨著化石資源的日益枯竭以及生態(tài)意識的不斷增強，人們正不斷開發(fā)可再生能源，如太陽能、水能、風(fēng)能、重力能和生物質(zhì)能等[1]。生物柴油已成為全球新能源領(lǐng)域的研究熱點[2]。生物柴油是以植物油脂、動物油脂、廢棄油脂等為原料，與醇經(jīng)過酯交換反應(yīng)和酯化反應(yīng)生成的脂肪酸烷基酯，以脂肪酸甲酯(FAME)為主。生物柴油的制備工藝條件因原料不同而有所差異[3]；對于工藝條件的優(yōu)化，多采用正交法[4]和響應(yīng)面法[5]。生物柴油制備技術(shù)主要有混合法、微乳液法、熱解法、酯交換法等[6-7]，其中酸堿催化劑催化的酯交換法存在工藝復(fù)雜、環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)品不易回收等缺點，所以研究人員將目光轉(zhuǎn)移到生物催化劑——生物酶上。用于制備生物柴油的生物酶大多是真菌類脂肪酶，通過吸附、交聯(lián)、包埋等方法對酶進行固定化，可方便酶從反應(yīng)體系中分離和重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本[8]。固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶催化效率相對較高，是目前在生物柴油制備中應(yīng)用最廣泛的脂肪酶之一[9]，對甲醇具有很好的抗性[10]，可以一次性加入反應(yīng)所需的甲醇。Shah等[11]利用洋蔥假單胞菌脂肪酶催化麻風(fēng)樹油，轉(zhuǎn)化率達到了98%。

基于Kaieda等[10]、Noureddini等[12]、Li等[13]的單因素實驗結(jié)果，作者以精制花生油為原料在固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶的催化下與甲醇進行酯交換反應(yīng)，采用正交實驗優(yōu)化轉(zhuǎn)酯化條件；并通過比較轉(zhuǎn)酯化條件對花生油中不同脂肪酸轉(zhuǎn)酯化率的影響，探究了花生油中主要脂肪酸的酶催化轉(zhuǎn)酯化特性，以期為花生油中各脂肪酸組分的高效利用提供幫助。

1 實驗

1.1 材料與試劑

花生油(魯花5S壓榨一級)；固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶(lipase immobilized on Immobead 150 fromPseudomonascepacia54327-10G)、十七烷酸甲酯(≥99%)，Sigma公司；脂肪酸甲酯標(biāo)樣(FAME Mix C8～C24),Supelco公司。

正己烷、無水甲醇等均為分析純國藥試劑。

1.2 轉(zhuǎn)酯化條件優(yōu)化

在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，參照文獻[8,12-13]，以反應(yīng)時間(12 h 、24 h、36 h、48 h、60 h)、反應(yīng)溫度(30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃)、酶用量(90 mg、180 mg、270 mg、360 mg、450 mg)、醇油比(3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1)、含水量(相對于油的質(zhì)量百分比，4%、6%、8%、10%、12%)為考察因素，通過5因素5水平正交實驗優(yōu)化轉(zhuǎn)酯化條件。

1.3 內(nèi)標(biāo)液的配制

取100 mg十七烷酸甲酯于100 mL容量瓶中，加入正己烷溶解，定容，得到1 mg·mL-1的十七烷酸甲酯溶液。

1.4 氣相色譜條件

采用Agilent 7890B 型氣相色譜儀進行氣相色譜分析。FID檢測器；HP-5毛細管色譜柱；進樣口溫度280 ℃；檢測器溫度300 ℃；升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持2 min，10 ℃·min-1升溫至280 ℃，保持10 min；氮載氣流速2.3 mL·min-1；分流比30∶1；進樣量1 μL。

1.5 轉(zhuǎn)酯化率的測定

將所得樣品多次水洗、離心，取上清液10 mg于2 mL離心管中，加入1 mL內(nèi)標(biāo)液，混合均勻，進行氣相色譜分析。依據(jù)脂肪酸甲酯標(biāo)樣中各組分的相對保留時間定性，選擇樣品中不含的十七烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，以峰面積法定量。按下式計算脂肪酸轉(zhuǎn)酯化率：

十七烷酸甲酯的質(zhì)量上清液的質(zhì)量

1.6 花生油中脂肪酸的酶催化轉(zhuǎn)酯化特性分析

花生油中的脂肪酸主要有棕櫚酸(C16：0)、油酸(C18：1)、亞油酸(C18：2)，少量的硬脂酸(C18：0)、花生酸(C20：0)、山崳酸(C22：0)[14]及微量的亞麻酸(C18∶3)[15]。采用脂肪酸甲酯標(biāo)樣相對保留時間對各色譜峰所代表的脂肪酸進行定性、相對峰面積定量，分析花生油中脂肪酸的酶催化轉(zhuǎn)酯化特性。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實驗結(jié)果與分析

以脂肪酸轉(zhuǎn)酯化率為評價指標(biāo)，設(shè)計5因素5水平正交實驗優(yōu)化轉(zhuǎn)酯化條件，結(jié)果與分析見表1，方差分析見表2。

從表1、2可知，轉(zhuǎn)酯化率隨酶用量的增加而升高；醇油比不能太大，即醇用量不能過多，因為過量的甲醇對脂肪酶有一定的毒害作用[1]。各因素對脂肪酸轉(zhuǎn)酯化率的影響大小依次為：含水量>酶用量>反應(yīng)溫度>醇油比>反應(yīng)時間。固定化脂肪酶催化花生油轉(zhuǎn)酯化的最優(yōu)條件為：反應(yīng)時間48 h、反應(yīng)溫度35 ℃、酶用量450 mg、醇油比3∶1、含水量8%，在此條件下，花生油轉(zhuǎn)酯化率可達90.58%。

2.2 花生油中脂肪酸的酶催化轉(zhuǎn)酯化特性

在醇油比為6∶1、反應(yīng)時間為3 h、反應(yīng)溫度為60 ℃、KOH用量為1%的條件下進行堿催化反應(yīng)，并通過氣相色譜分析內(nèi)標(biāo)法定量確認轉(zhuǎn)酯化率達到了100%，獲得的花生油中主要脂肪酸組成及含量如下：棕櫚酸 11.33%、亞油酸 30.26%、油酸 46.00%、硬脂酸 3.81%，與Carrín等[16]和鄭暢等[17]所報道的一致。

花生油中主要脂肪酸在不同反應(yīng)條件(表1所列25組實驗條件)下的轉(zhuǎn)酯化率如圖1所示。

從圖1可以看出，棕櫚酸在第9組實驗條件下的轉(zhuǎn)酯化率最高，為91.85%；亞油酸、油酸、硬脂酸均在第12組實驗條件下的轉(zhuǎn)酯化率最高，分別為80.31%、85.30%、82.76%。在最優(yōu)轉(zhuǎn)酯化條件(反應(yīng)時間48 h、反應(yīng)溫度35 ℃、酶用量450 mg、醇油比3∶1、含水量8%)下，亞油酸、油酸、硬脂酸的轉(zhuǎn)酯化率均有所提升，分別為89.33%、89.13%、88.69%；而棕櫚酸的轉(zhuǎn)酯化率變化不大，為91.71%。表明，低碳數(shù)的棕櫚酸在固定化脂肪酶催化下更易于轉(zhuǎn)酯化。

表1 正交實驗結(jié)果與分析

表2 方差分析

由于花生油中主要脂肪酸的轉(zhuǎn)酯化率在不同實驗條件下有所差異，因此,采用正交實驗分析花生油中主要脂肪酸轉(zhuǎn)酯化影響因素的顯著性以及最優(yōu)轉(zhuǎn)酯化條件，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，花生油中各主要脂肪酸轉(zhuǎn)酯化影響因素的顯著性并不相同；硬脂酸的影響因素顯著性與正交實驗得到的花生油脂肪酸轉(zhuǎn)酯化影響因素顯著性相同；C18總脂肪酸(硬脂酸、亞油酸、油酸、亞麻酸)含量占花生油的80%，其最優(yōu)轉(zhuǎn)酯化條件與花生油脂肪酸最優(yōu)轉(zhuǎn)酯化條件相同，但影響因素顯著性有所差異。表明，花生油中不同脂肪酸的固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化特性有所不同。

3 結(jié)論

以催化效率較高且無污染的固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶替代環(huán)境破壞性較大的酸堿催化劑催化花生油與甲醇的酯交換反應(yīng)，在確保較高轉(zhuǎn)酯化率、較少能耗的情況下，通過正交實驗得到最優(yōu)轉(zhuǎn)酯化條件：反應(yīng)時間48 h、反應(yīng)溫度35 ℃、酶用量450 mg、醇油比3∶1、含水量8%，在此條件下，花生油轉(zhuǎn)酯化率為90.58%。花生油中各主要脂肪酸的轉(zhuǎn)酯化率與實驗條件密切相關(guān)，影響因素的顯著性并不相同，最優(yōu)轉(zhuǎn)酯化條件也有所差異。表明，花生油中不同脂肪酸的固定化洋蔥假單胞菌脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化特性有所不同，低碳數(shù)的棕櫚酸在固定化脂肪酶催化下更易于轉(zhuǎn)酯化。該研究為生物法制備生物柴油工藝參數(shù)的優(yōu)化以及花生油中脂肪酸組分的經(jīng)濟、高效利用提供了幫助。

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圖1 花生油中主要脂肪酸在不同反應(yīng)條件下的轉(zhuǎn)酯化率Fig.1 Transesterification rates of major fatty acids in peanut oil under different reaction conditions

表3花生油中主要脂肪酸轉(zhuǎn)酯化的影響因素顯著性及最優(yōu)條件

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TransesterificationofPeanutOilCatalyzedbyImmobilizedLipase

CHENG Lei,LI Quan,GE Bao-sheng,YU Dao-yong*

(CenterforBioengineeringandBiotechnology,CollegeofChemicalEngineering,ChinaUniversityofPetroleum(EastChina),Qingdao266580,China)

We studied transesterification of peanut oil with methanol catalyzed by immobilizedPseudomonascepacialipase,investigated the effects of reaction time,reaction temperature,enzyme dosage,methanol-oil ratio,and water content on transesterification rate,and discussed transesterification characteristics of major fatty acids in peanut oil.The optimal transesterification conditions were obtained by an orthogonal experiment as follows:peanut oil dosage of 3 g,reaction time of 48 h,reaction temperature of 35 ℃,enzyme dosage of 450 mg,methanol-oil ratio of 3∶1,and water content of 8%.Under above conditions,the transesterification rate of peanut oil reached 90.58%.The significance of influencing factors and the optimal reaction conditions for transesterification of major fatty acids in peanut oil were not identical,which indicated that different fatty acids in peanut oil had different transesterification characteristics catalyzed by immobilizedPseudomonascepacialipase.

immobilized lipase;transesterification;peanut oil;methanol

國家重點研發(fā)計劃國際科技創(chuàng)新合作重點專項(2016YFE0106700)，山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2014BM013)，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(17CX05013)

2017-08-12

成磊(1993-)，男，山東臨朐人，碩士研究生，研究方向：生物能源，E-mail：chenglei4372@163.com；通訊作者：于道永，博士，副教授，E-mail：daoyong@upc.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.12.003

成磊，李泉，葛保勝,等.固定化脂肪酶催化花生油轉(zhuǎn)酯化特性研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(12)：10-13.

TQ646 Q556

A

1672-5425(2017)12-0010-04