羅林根，楊燕，魏慧，穰杰，唐瓊，胡勝標(biāo)，孫運(yùn)軍，余子全，丁學(xué)知，夏立秋湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南　長沙　410081

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須糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的核糖體工程改造對丁烯基多殺菌素合成的影響

羅林根，楊燕，魏慧，穰杰，唐瓊，胡勝標(biāo)，孫運(yùn)軍，余子全，丁學(xué)知，夏立秋
湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長沙410081

羅林根, 楊燕, 魏慧, 等. 須糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的核糖體工程改造對丁烯基多殺菌素合成的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(2): 259–263.

Luo LG, Yang Y, Wei H, et al. Effect of ribosome engineering on butenyl-spinosyns synthesis of Saccharopolyspora pogona. Chin J Biotech, 2016, 32(2): 259–263.

摘 要:核糖體工程是以微生物的各類抗生素抗性突變?yōu)楹Y選標(biāo)記，高效獲得次生代謝產(chǎn)物合成能力提高的突變株的一種育種新方法。通過核糖體工程技術(shù)，使用鏈霉素對須糖多孢菌Saccharopolyspora pogona進(jìn)行抗性選育，以獲得高產(chǎn)丁烯基多殺菌素突變菌株。對原始菌株和所獲得的突變菌株代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，相對于原始菌株，其中突變株S13的丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高幅度最大，相比原始菌株提高了1.79倍。經(jīng)質(zhì)譜測定表明，其代謝物中比原始菌株多了一種丁烯基多殺菌素組分Spinosyn α1。對抗性突變株S13的DNA序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在編碼核糖體S12蛋白的rpsL基因保守區(qū)域中出現(xiàn)點(diǎn)突變，第314位和第320位的胞嘧啶(C)分別突變?yōu)橄汆堰?A)和胸腺嘧啶(T)，對應(yīng)的氨基酸殘基分別由脯氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸。研究顯示，突變株S13遺傳穩(wěn)定性良好。

關(guān)鍵詞:核糖體工程，放線菌，丁烯基多殺菌素，鏈霉素，次級代謝

Received: April 12, 2015; Accepted: June 8, 2015

Supported by: Key Program for International S&T Cooperation Projects of China (No. 0102011DFA32610), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB111680), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. NC2010GA0091), Collaborative Innovation Center Project of Hunan Province (No. 20134486).

國家國際合作重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 0102011DFA32610)，國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB111680)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. NC2010GA0091)，湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目 (No. 20134486) 資助。

丁烯基多殺菌素是由須糖多孢菌Saccharopolyspora pogona產(chǎn)生的一類與多殺菌素結(jié)構(gòu)類似的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。到目前為止，丁烯基多殺菌素組分共檢測到31種，這類化合物具有很好的殺線蟲、昆蟲活性[1-2]。且丁烯基多殺菌素比多殺菌素具有更為廣泛的殺蟲譜，包括鱗翅目 (Lepidoptera)、纓翅目 (Thysanoptera)、膜翅目 (Hymenoptera)、雙翅目 (Diptera) 等多種害蟲，尤其對鱗翅目、纓翅目害蟲具有極強(qiáng)的選擇性殺蟲活性，對多殺菌素難于控制的世界性檢疫性害蟲蘋果蠹蛾和重要農(nóng)業(yè)害蟲煙青蟲具有良好的生物防治作用[3-4]。它們的殺蟲作用機(jī)制是通過與煙堿乙酰膽堿受體 (nAChRs)、γ-氨基丁酸受體 (GABARs) 結(jié)合使昆蟲神經(jīng)細(xì)胞去極化，引起中央神經(jīng)系統(tǒng)超活化，從而導(dǎo)致昆蟲非功能性肌肉收縮、震顫，最后衰竭、癱瘓。對靶標(biāo)昆蟲表現(xiàn)出快速觸殺和攝食毒性的雙重作用，具有低毒、低殘留、對害蟲的天敵安全、自然分解快等優(yōu)點(diǎn)，兼具生物農(nóng)藥的安全性與化學(xué)農(nóng)藥的高效性，是當(dāng)前國際上極具發(fā)展前景的環(huán)境友好型生物農(nóng)藥[5]。但是丁烯基多殺菌素的發(fā)酵產(chǎn)量較低，如何提高其發(fā)酵產(chǎn)量是亟待解決的一大難題。目前，核糖體工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用于菌種改良、提高無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)的蛋白合成效率、提高菌株化學(xué)脅迫耐受程度和改善菌種抗逆境能力等方面[6]。本研究通過核糖體工程技術(shù)對須糖多孢菌進(jìn)行選育，獲得了丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高的突變菌株。所采用的鏈霉素在其他菌株中的抗性篩選效果較好，正突變和增產(chǎn)率高，在核糖體工程育種中應(yīng)用最多，對應(yīng)的突變位點(diǎn)明確。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒與引物

Saccharopolyspora pogona NRRL 30141由本實(shí)驗(yàn)室從美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心購買。E. coli DH5α來源本室保藏。pMD18-T-rpsL為測序質(zhì)粒由本研究構(gòu)建。引物rpsL-F (5′-ATTCGGCACACAGAA AC-3′)、rpsL-R (5′-AGAGGAGAACCGTAGAC-3′)由上海生工生物有限公司合成?！?/p>

1.1.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

大腸桿菌培養(yǎng)采用LB液體或固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37 ℃；S. pogona種子活化采用SP-2培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接、突變株篩選采用TSB培養(yǎng)基，發(fā)酵采用SP-3培養(yǎng)基，在固體平板上的群體形態(tài)特征比較采用TSB培養(yǎng)基、GYM培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基以及SFM培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

1.2方法

1.2.1鏈霉素最低抑制濃度 (MIC) 的測定與抗性突變菌株的篩選

收集原始菌株孢子，將孢子懸浮液涂布于含不同濃度鏈霉素的TSB平板上，后續(xù)按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.2.2發(fā)酵產(chǎn)物的樣品制備及超高效液相色譜、質(zhì)譜分析

將活化好的種子液以10% (V/V) 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、280 r/min發(fā)酵11 d后，向發(fā)酵液中加入等體積的丙酮，靜置浸提過夜，離心取上清，0.22 μm微孔濾膜過濾。Agilent 1290 Infinity UHPLC測定發(fā)酵液中各組分的含量，檢測條件如下，色譜柱：Zorbax SB (C18)，5 μm，4.6 mm×150 mm，柱溫35 ℃；流動相A：10 mmol/L乙酸銨，流動相B：甲醇/乙腈(1∶1)，梯度洗脫，流速1 mL/min；二極管陣列檢測波長250 nm。發(fā)酵產(chǎn)物及菌體蛋白利用Thermo LTQ XL液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行鑒定，丁烯基多殺菌素組分檢測鑒定條件如下，色譜柱：BioBasic (C18)，5 μm，1.0 mm× 150 mm；流動相A：0.1%甲酸，流動相B：甲醇 (含0.1%甲酸)，流速300 μL/min，梯度洗脫 (表1)。

表1　液質(zhì)聯(lián)用色譜梯度洗脫程序Table 1 LC/MS chromatography gradient elution program

1.2.3菌體生長曲線的測定

活化的種子液轉(zhuǎn)接TSB培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h定期取樣，測定菌體光密度值OD600，作生長曲線。

1.2.4突變菌株與原始菌株生長形態(tài)特征比較

分別對培養(yǎng)48 h的種子液進(jìn)行取樣，利用顯微鏡觀察菌體形態(tài)，同時(shí)各取50 μL種子液分別涂布于MS、SFM、TSB和GYM固體培養(yǎng)基上，觀察不同平板上菌落生長情況。

1.2.5穩(wěn)定期菌體全蛋白的提取及分析

按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1鏈霉素的MIC測定及其抗性突變菌株的篩選

經(jīng)測定，鏈霉素對原始菌株30141的MIC為15 μg/mL。利用4×、10×MIC倍數(shù)的高濃度鏈霉素對原始菌株30141進(jìn)行抗性篩選，共分離到具有鏈霉素抗性且穩(wěn)定遺傳突變菌株28株。

2.2原始菌株30141及其突變菌株發(fā)酵產(chǎn)物的UHPLC、MS分析

表2　六株丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高的突變株Table 2 The high butenyl-spinosyns producing S. pogona strains of streptomycin-resistant mutants

圖1　原始菌株30141 (A) 和突變株S13 (B) 發(fā)酵產(chǎn)物的UHPLC圖Fig. 1 UHPLC chromatogram of fermentation broths of original strain (A) and mutant S13 (B).

原始菌株和突變菌株的UHPLC圖譜對比分析發(fā)現(xiàn)，6株突變菌株丁烯基多殺菌素產(chǎn)量相對提高(表2)，3株突變株丁烯基多殺菌素產(chǎn)量相對降低，其中突變株S13產(chǎn)量最高 (圖1)，相比原始菌株提高1.79倍，對其色譜指紋圖譜進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)在2.679 min處，比原始菌株多了一個(gè)最大吸收波長為250 nm的色譜峰，而且從色譜圖中可以看出，突變株S13的色譜峰增多，可能激活了新代謝產(chǎn)物的合成。

通過質(zhì)譜檢測確定了5.3、6.5 min處的色譜峰分別為丁烯基多殺菌素組分Spinosyn βc和Spinosyn αc/Spinosyn 6-methy 1β，它們的分子量分別為650、634[M+H]+(m/z)，二級質(zhì)譜中含有分子量為189的鼠李糖配基離子碎片，與文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)吻合[1]。在突變株S13 UHPLC圖中新增的2.679 min處的峰，峰分子量為758[M+H]+(m/z) (圖2)，根據(jù)一級質(zhì)譜及色譜二極管陣列檢測對比，確定其為丁烯基多殺菌素組分Spinosyn α1。

2.3突變位點(diǎn)的鑒定

根據(jù)現(xiàn)有的相關(guān)研究報(bào)道，抗生素抗性突變的產(chǎn)生往往伴隨著編碼核糖體蛋白基因的堿基突變，鏈霉素等抗生素的抗性突變由編碼核糖體S12蛋白的rpsL基因發(fā)生點(diǎn)突變引起[9]。分別以原始菌株和突變株S13的基因組為模板成功擴(kuò)增出糖多孢菌屬核糖體30S小亞基中S12蛋白的編碼序列，其開放閱讀框由375個(gè)堿基組成。對突變株S13的DNA序列分析發(fā)現(xiàn)，突變株rpsL基因第314位的C突變?yōu)锳，第320位的C突變?yōu)門；對應(yīng)的氨基酸殘基分別由脯氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚杀彼嵬蛔優(yōu)槔i氨酸。核糖體結(jié)構(gòu)的改變，會影響微生物次級代謝產(chǎn)物的調(diào)控途徑，進(jìn)而激發(fā)微生物的生物合成潛能，提高其次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量甚至從中獲得新的生物活性物質(zhì)，獲得代謝產(chǎn)物合成能力提高的突變菌株。

2.4原始菌株30141與突變株S13差異表達(dá)蛋白分析

通過SDS-PAGE對比分析了原始菌株與突變株S13穩(wěn)定期蛋白表達(dá)水平，選取了突變株中表達(dá)明顯上調(diào)的蛋白條帶，切膠并進(jìn)行膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定 (圖3)，其中Crp/Fnr家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與環(huán)腺苷酸相互作用影響細(xì)胞的形態(tài)與生長發(fā)育，并作為正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子促進(jìn)多殺菌素類化合物的合成，3-磷酸甘油醛脫氫酶能為丁烯基多殺菌素的合成提供更充足的前體物，翻譯起始因子IF-3可能提高了穩(wěn)定期蛋白質(zhì)的翻譯活性從而促進(jìn)丁烯基多殺菌素合成[10-11]。

2.5原始菌株30141與突變株S13表型特征比較

圖2　丁烯基多殺菌素組分質(zhì)譜鑒定Fig. 2 MS identification of butenyl-spinosyns. (A) Original strain fermentation. (B) Mutant S13 strain fermentation.

原始菌株30141與突變株S13生長曲線如圖4所示，原始菌株在培養(yǎng)48 h左右生長趨于平穩(wěn)，隨后進(jìn)入二次生長周期，至60 h左右達(dá)到穩(wěn)定。從生長曲線中可以看出，在生長期初始階段，原始菌株與突變株S13生長速率無明顯差異，當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，突變株S13比原始菌生長速率明顯減緩，這與天藍(lán)色鏈霉菌核糖體突變后的現(xiàn)象類似[12]，且突變株中的二次生長現(xiàn)象消失。顯微鏡觀察菌株的菌體形態(tài)，結(jié)果 (圖5) 顯示原始菌株菌絲細(xì)長且分枝較少，而突變株S13菌絲粗壯而分枝多。

與原始菌株相比，突變株S13在SFM、TSB和GYM平板上氣生菌絲顯著增厚，而在產(chǎn)孢子培養(yǎng)基MS上，突變株S13產(chǎn)孢速率與孢子豐滿度明顯提高 (圖6)。放線菌次級代謝的開始通常都伴隨著菌體形態(tài)的分化，并且研究發(fā)現(xiàn)孢子的形成與次級代謝物產(chǎn)量密切相關(guān)，由此可以看出，核糖體工程選育不僅能改變突變株的次級代謝能力，同時(shí)其生長形態(tài)也會發(fā)生一定的改變。

圖3　原始菌株30141和突變株S13全蛋白SDS-PAGE檢測Fig. 3 Total cellular proteins analysis of original strain and mutant S13 by SDS-PAGE. M: protein marker; 1: original strain; 2: mutant S13. A: protein RecA; B: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; C: Crp/Fnr family transcriptional regulator; D: translation initiation factor IF-3.

圖4　原始菌株30141與突變株S13的生長曲線Fig. 4 Growth curve of original strain and mutant S13.

圖6　原始菌株30141和突變株S13在固體培養(yǎng)基上群體形態(tài)特征比較Fig. 6 Original strain and mutant S13 colony morphologies.

3　結(jié)論

本研究以S. pogona NRRL 30141菌株為出發(fā)材料，通過核糖體工程技術(shù)，得到了丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高的鏈霉素抗性突變株S13，并測定了它的突變位點(diǎn) (P105Q、A107V)，與能普遍提高鏈霉菌屬中次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的核糖體蛋白S12的K88E 及P91S等突變類型不同，也與紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338各鏈霉素抗性突變位點(diǎn)不同，但與鄔洋等[13]使用與鏈霉素同為氨基糖苷類的巴龍霉素篩選獲得突變位點(diǎn)一致，同類抗生素在不同微生物篩選中的突變位點(diǎn)是否具有特異性有待進(jìn)一步研究。并且在4倍MIC的條件下篩選效率更高，獲得的突變株S13菌絲體粗壯、分支增多，生長后期生長速率減緩更明顯，從而更有利于丁烯基多殺菌素的積累，S13中不僅促進(jìn)了丁烯基多殺菌素組分的合成，還激活了新的丁烯基多殺菌素組分，這可能與穩(wěn)定期差異的蛋白表達(dá)有關(guān)，影響了丁烯基多殺菌素次級代謝調(diào)控。后期也希望通過多重抗生素的疊加篩選，獲得丁烯基多殺菌素產(chǎn)量更高的突變菌株，從而為丁烯基多殺菌素高產(chǎn)菌株的選育開辟有效途徑，也為今后核糖體工程技術(shù)在其他種屬微生物中的應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Effect of ribosome engineering on butenyl-spinosyns synthesis of Saccharopolyspora pogona

Lin’gen Luo, Yan Yang, Hui Wei, Jie Rang, Qiong Tang, Shengbiao Hu, Yunjun Sun, Ziquan Yu, Xuezhi Ding, and Liqiu Xia
College of Life Science, Hunan Normal University, State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology, Changsha 410081, Hunan, China

Abstract:Through introducing mutations into ribosomes by obtaining spontaneous drug resistance of microorganisms, ribosome engineering technology is an effective approach to develop mutant strains that overproduce secondary metabolites. In this study, ribosome engineering was used to improve the yield of butenyl-spinosyns produced by Saccharopolyspora pogona by screening streptomycin resistant mutants. The yields of butenyl-spinosyns were then analyzed and compared with the parent strain. Among the mutants, S13 displayed the greatest increase in the yield of butenyl-spinosyns, which was 1.79 fold higher thanthat in the parent strain. Further analysis of the metabolite profile of S13 by mass spectrometry lead to the discovery of Spinosyn α1, which was absent from the parent strain. DNA sequencing showed that there existed two point mutations in the conserved regions of rpsL gene which encodes ribosomal protein S12 in S13. The mutations occurred a C to A and a C to T transversion mutations occurred at nucleotide pair 314 and 320 respectively, which resulted in the mutations of Proline (105) to Glutamine and Alanine (107) to Valine. It also demonstrated that S13 exhibited genetic stability even after five passages.

Keywords:ribosome engineering, actinomycetes, butenyl-spinosyns, streptomycin, secondary metabolism

Corresponding author:Liqiu Xia. Tel: +86-731-88872298; E-mail: xialq@hunnu.edu.cn