夏會麗，陳思思，陳雄，黃亞男，謝婷，李愛玲，王志*

1(發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢，430068)2(河南省南街村(集團(tuán))有限公司，河南 臨潁，462600)3(天方藥業(yè)股份有限公司，河南 駐馬店，463000)

NADH氧化途徑遷移促進(jìn)丁酸梭狀芽孢桿菌的生長

夏會麗1，陳思思1，陳雄1，黃亞男2，謝婷3，李愛玲3，王志1*

1(發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢，430068)2(河南省南街村(集團(tuán))有限公司，河南 臨潁，462600)3(天方藥業(yè)股份有限公司，河南 駐馬店，463000)

為提高丁酸梭菌的發(fā)酵生物量，首先在厭氧瓶水平確定了0 h添加0.2 mmol/L乙醛可以有效提高細(xì)胞數(shù)，后在10 L發(fā)酵罐規(guī)模研究了葡萄糖和乙醛共補(bǔ)料策略對丁酸梭菌發(fā)酵性能的影響。結(jié)果表明：采用葡萄糖和乙醛共補(bǔ)料能獲得較高的生物量(11.37×108CFU/mL)，相對于葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵(9.93×108CFU/mL)和批發(fā)酵(9.39×108CFU/mL)分別提高了14.5%和21.1%。發(fā)酵8 h時，丁酸和乙酸的比生成速率相對于葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵分別降低18.9%和17.3%，而乙醇的比生成速率卻提高了9.7%，實現(xiàn)了高生物量和低產(chǎn)酸的相對統(tǒng)一。乙醛的添加使NADH的氧化由丁酸合成途徑部分向乙醇合成支路遷移，增強(qiáng)了乙醇的合成效率，降低丁酸、乙酸的積累，提高了丁酸梭菌的生長效率。

丁酸梭菌；生物量；NADH的氧化；乙醛

丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)主要存在于干酪、動物的腸道與糞便、土壤等自然環(huán)境中[1-2]，是直或彎曲的革蘭氏陽性厭氧內(nèi)生芽孢桿菌。菌落白色或奶油色，呈煎蛋樣，中間隆起，菌體中常有圓形或卵圓形芽孢，無孢子外壁和附屬絲，形成芽孢后中部膨大呈梭狀或紡錘狀使菌體偏末端部膨大呈梭狀，單個或成對，短鏈，偶見絲狀菌體，周生鞭毛，具有運動性[3-4]。

丁酸梭菌經(jīng)糖酵解途徑發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸、NADH和ATP。乙酰CoA在系列酶的作用下生成丁酸伴隨NADH的氧化和ATP的生成，丁酸、NADH的氧化和ATP的摩爾關(guān)系是1∶2∶1。乙酰CoA在乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶的作用下經(jīng)乙醛生成乙醇，伴隨著NADH的氧化，乙醇和NADH的氧化的摩爾關(guān)系是1∶2，但是該方向的碳通量往往不是很大[6]。

發(fā)酵過程中隨細(xì)菌快速增長而大量積累的有機(jī)酸會對細(xì)胞產(chǎn)生酸脅迫效應(yīng)[7-9]，細(xì)菌應(yīng)激響應(yīng)策略之一是代謝由酸生成向有機(jī)分子(如乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇等)合成遷移。乙醛是酵母等微生物厭氧發(fā)酵過程中常見的特征性分子[10]，乙醛還原為乙醇的過程中能通過NAD+的再生促進(jìn)NADH/NAD+的平衡而刺激酵母生長[11]。但是，由于丁酸梭菌經(jīng)乙醛生成乙醇的碳通量不是很大[6]，能否通過強(qiáng)化該途徑以競爭性降低乙酸、丁酸的合成效率來緩解酸脅迫還未見報道。

為提高丁酸梭菌的生物量及生長效率，本研究首先在厭氧瓶水平優(yōu)化了乙醛的添加濃度，確定了乙醛的促生長功能。在此基礎(chǔ)上重點研究了10 L發(fā)酵罐水平丁酸梭菌批培養(yǎng)、碳源補(bǔ)料發(fā)酵和碳源乙醛共補(bǔ)料發(fā)酵的生長、酸醇代謝差異，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁酸梭狀芽孢桿菌HBUT-01(ClostridiumbutyricumHBUT-01)，為本實驗室從河畔污泥中分離得到的菌株，菌落為奶油色的規(guī)則圓形菌落，生長過程中有H2產(chǎn)生，細(xì)胞中間膨脹，呈梭形，一端有淀粉粒積累，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC M 2016628)[12]。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖8.0，胰蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母粉3.0，瓊脂20，pH 7.2，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖16.1，蛋白胨25.0，酵母粉7.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.8，MnSO4·H2O 0.02，p H 7.2，115 ℃滅菌20 min。

酵母粉：安琪酵母股份有限公司；甲酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；蛋白胨：山東青島悅康生物技術(shù)有限公司；其他試劑均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320 pH計，梅特勒托利多儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CJ-2D型無菌操作臺，天津市泰斯特儀器有限公司；SGJ-10 L/C發(fā)酵罐，上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司；TG18M臺式高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器儀表有限公司； UVmini-1240紫外可見分光光度計，島津制作所；蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司；高效氣相色譜，安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養(yǎng)方法

斜面種子活化方法：將保藏在-20 ℃中的丁酸梭菌的厭氧甘油管在氮氣保護(hù)下，用接種環(huán)接種到厭氧管斜面，恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h。

厭氧瓶種子培養(yǎng)方法：培養(yǎng)好的斜面，在氮氣保護(hù)下加無菌、無氧的生理鹽水3 mL洗菌苔，倒入無菌無氧的空三角瓶中，搖晃均勻，取0.6 mL菌懸液于種子培養(yǎng)基(厭氧瓶120 mL，裝液量30 mL)，于37 ℃、100 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)12 h。

厭氧瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法：裝液體量30 mL，初始pH 7.2，115 ℃高壓滅菌20 min，以2%的接種量轉(zhuǎn)接厭氧瓶種子菌液，37 ℃，100 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)9～12 h。

10 L罐培養(yǎng)方法：發(fā)酵培養(yǎng)基基料5 L，接種量2.5%(v/v)，轉(zhuǎn)速100 r/min，接種前、后通氮氣(流量0.1 vvm)各1 h，后密閉培養(yǎng)。37 ℃培養(yǎng)約12 h左右。用10 mol/L的NH3·H2O控制pH在6.0左右。

10 L罐葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵方法：補(bǔ)料瓶中裝8%葡萄糖溶液600 mL，115 ℃高壓滅菌20 min，5～10 h流加8%葡萄糖溶液，控制流加速率使葡萄糖維持在3.0 g/L左右。pH控制同上。

10 L罐葡萄糖和乙醛的共補(bǔ)料發(fā)酵方法：滅過菌的8%葡萄糖溶液中加40%乙醛溶液(0.22 μm濾膜過濾)0.16 mL，流加方法同上。pH控制同上。

1.3.2 菌體干重測定

取8 mL發(fā)酵液于離心管中，6 000 r/min離心5 min后棄上清。將收集到的菌體用5 mL蒸餾水重懸菌體，離心并重復(fù)洗滌2次。然后將菌體105 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量計算細(xì)胞干重[13]。

1.3.3 細(xì)胞數(shù)的測定

使用Hungate滾管計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)[14]。

1.3.4 丁酸、乙酸的測定

采用氣相色譜法測定：安捷倫7890B GC，F(xiàn)ID檢測器，HP-INNOWax毛細(xì)管柱柱長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1 μm；程序升溫條件：40 ℃保留5 min，后以20 ℃/min升到120 ℃，再以10 ℃/min 升到220 ℃，220 ℃ 保留3 min。流速 5 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器280 ℃[15]。

1.3.5 葡萄糖測定

葡萄糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法[16]。

1.3.6 乙醇濃度的測定

使用SBA-40C生物傳感器測定乙醇濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醛添加量對丁酸梭菌生物量的影響

發(fā)酵過程代謝由小分子有機(jī)酸向醇分子合成遷移是細(xì)菌和酵母等微生物緩解酸脅迫效應(yīng)的應(yīng)激響應(yīng)策略之一。由于丁酸梭菌經(jīng)乙醛生成乙醇的碳通量不是很大[6]，能否通過強(qiáng)化該途徑降低乙酸、丁酸的合成效率來緩解酸脅迫？因此，考察了不同乙醛添加量對丁酸梭菌生長的影響，如圖1所示。

圖1 乙醛的添加對生物量的影響Fig.1 Effect of acetaldehyde addition on the biomass

乙醛的添加量對丁酸梭菌細(xì)胞數(shù)的影響成峰型分布，以0.2 mmol/L的添加量生物量最高，達(dá)到9.31×108CFU/mL，比對照組(7.35×108CFU/mL)提高26.7%，比0.1 mmol/L和0.3 mmol/L的添加量分別提高1.3%和20.1%。考慮到丁酸梭菌在厭氧瓶和10 L發(fā)酵罐規(guī)模的代謝差異以及在10 L發(fā)酵罐規(guī)模生物量的提高，0.1 mmol/L可能不能滿足菌體的需要，因此確定乙醛的最佳添加濃度為0.2 mmol/L。

2.2 厭氧瓶中添加0.2 mmol/L乙醛對丁酸梭菌生長和代謝的影響

厭氧瓶發(fā)酵，0 h添加0.2 mmol/L的乙醛(實驗組)，其對丁酸梭菌生長和主要代謝的影響如圖2所示。

圖2 添加0.2 mmol/L乙醛對丁酸梭菌生物量、丁酸、乙酸和乙醇的影響(實心標(biāo)識為對照組、空心標(biāo)識為實驗組)Fig.2 Effect of acetaldehyde addition at 0 h on biomass, butycate, acetic and ethanol of Clostridium butyricum (Filled symbols are the experimental, open symbols are the control)

發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)比對照組提高10%～15%。另外，發(fā)酵過程中丁酸、乙酸質(zhì)量濃度都持續(xù)增加，發(fā)酵結(jié)束時實驗組丁酸、乙酸質(zhì)量濃度分別為2.55 g/L和0.73 g/L，比對照組的3.25 g/L和0.87 g/L分別降低21.5%和16.4%。但是，發(fā)酵結(jié)束時實驗組乙醇質(zhì)量濃度為0.24 g/L，比對照組提高20%，說明乙醛的添加確實促進(jìn)了乙醇的生成，降低丁酸、乙酸的合成，提高了丁酸梭菌的生長效率。

2.3 10 L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)丁酸梭菌的生長與產(chǎn)酸特性

在10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)丁酸梭菌，菌體生長和主要代謝變化如圖3所示。

圖3 丁酸梭菌在10 L發(fā)酵罐中的生長與產(chǎn)酸醇過程Fig.3 Time course of cell growth as well as acids and ethanol production in batch culture by Clostridium butyricum

經(jīng)過短暫的延遲期，細(xì)胞對數(shù)生長至8 h(峰值，9.39×108CFU/mL)后開始自溶，10 h為7.85×108CFU/mL，比峰值下降16.4%。有趣的是，丁酸濃度與細(xì)胞數(shù)的變化幾乎一致，菌體的生長和丁酸濃度存在明顯的相關(guān)性，并有很好的線性相關(guān)性(以丁酸濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)時間點的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)得到一線性方程：y=0.356 8x-0.587，R2=0.971 7)。2～8 h丁酸質(zhì)量濃度持續(xù)增加至2.98 g/L，之后逐漸降低。乙酸的積累相對較少，8 h乙酸質(zhì)量濃度(峰值)為0.5 g/L。發(fā)酵至10 h時，丁酸濃度是乙酸濃度的6.32倍(表1)，這也說明，丁酸梭菌以丁酸發(fā)酵為碳代謝主流。2～8 h細(xì)胞對數(shù)生長的同時葡萄糖快速消耗，平均消耗速率為2.56 mg/(g·h)，8 h發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度僅為0.88 g/L。由于葡萄糖等碳源的不足使菌體的抗逆性變差，8 h后細(xì)胞開始自溶，這為后期的研究提供了重要的補(bǔ)料窗口信息。

2.4 流加葡萄糖對HBUT-01生長和代謝的影響

在10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)丁酸梭菌，5～10 h流加8%葡萄糖溶液(600 mL)，控制流加速率使葡萄糖維持在3.0 g/L左右(優(yōu)化后的殘?zhí)菨舛龋Y料未顯示)，菌體生長和主要代謝變化如圖4所示。

圖4 流加葡萄糖對丁酸梭菌生長和代謝的影響(虛線表示補(bǔ)料的結(jié)束和開始)Fig.4 Effects of the feed with glucose on biomass and metabolism of Clostridium butyricum (The vertical dotted lines indicate the start and the end of fed-batch)

經(jīng)過2 h的延遲期，細(xì)胞對數(shù)生長至8 h細(xì)胞數(shù)最大(9.93×108CFU/mL)，比批發(fā)酵對照提高6%。由于葡萄糖的流加，整個發(fā)酵周期中丁酸和乙酸質(zhì)量濃度都持續(xù)增加。對數(shù)末期(8 h，以下同)丁酸質(zhì)量濃度及其比生成速率分別為3.09 g/L(比對照批發(fā)酵提高4%)和74 mg/(g·h)(比對照批發(fā)酵僅降低1.33%)，乙酸質(zhì)量濃度和比生成速率分別為0.36 g/L、8.67 mg/(g·h)。

另外，補(bǔ)料結(jié)束時，流加葡萄糖批發(fā)酵的乙醇質(zhì)量濃度為0.26 g/L，和對照批發(fā)酵相當(dāng)。丁酸質(zhì)量濃度是乙酸的8.02倍(表1)，比對照批發(fā)酵高26.9%，說明流加葡萄糖增強(qiáng)了EMP途徑碳通量，增加的NADH優(yōu)先通過合成丁酸來生成NAD+，保證NADH/ NAD+的平衡，維持代謝過程的正常進(jìn)行，而且碳流經(jīng)乙醇合成途徑氧化NADH不占優(yōu)勢[17]。流加葡萄糖生成乙醇的濃度并沒有增加，再次驗證了乙酰輔酶A到乙醇的碳通量不是很大的報道[6]。

表1 菌株HBUT-01在不同發(fā)酵條件下的酸醇比生成速率(實驗數(shù)據(jù)為3個樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)Table 1 Specific production rate of acids, ethanol in different fed-batch culture condition of HBUT-01(Data are means±S.D., n=3)

注：相同的字母表示差異不顯著(p<0.05)。

2.5 流加葡萄糖和乙醛對丁酸梭菌生長和代謝的影響

在上述分批補(bǔ)料條件下，8%的葡萄糖補(bǔ)料溶液中添加0.16 mL濃度40%的乙醛(罐內(nèi)終濃度為0.2 mmol/L)，控制相同的流加速率，菌體生長和主要代謝變化如圖5所示。

圖5 流加葡萄糖和乙醛共補(bǔ)粒對丁酸梭菌生長和代謝的影響(虛線表示補(bǔ)粒的結(jié)束和開始)Fig.5 Effects of the co-feed with glucose and acetaldehyde on biomass and metabolish of Clostridium butyricum(The vertical dotted lines indicate the start and the end of fed-batch)

2～8 h細(xì)胞快速生長達(dá)到峰值(11.37×108CFU/mL)，比葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵提高14.5%，比批發(fā)酵提高21.1%。葡萄糖和乙醛共補(bǔ)料的整個發(fā)酵過程中，丁酸和乙酸的合成效率均降低。8 h丁酸質(zhì)量濃度(2.76 g/L)和其比生成速率比葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵分別降低10.7%、18.9%，見表1；乙酸質(zhì)量濃度(0.33 g/L)和其比生成速率比只補(bǔ)葡萄糖的對照組分別降低11.6%、17.3%。

另外，葡萄糖和乙醛共補(bǔ)料，乙醇的合成增強(qiáng)。對數(shù)末期乙醇質(zhì)量濃度(0.35 g/L)和比生成速率比只葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵分別提高20.7%和10%。補(bǔ)料結(jié)束時乙醇質(zhì)量濃度(0.36 g/L)和比生成速率分別比只補(bǔ)葡萄糖的對照組(0.26 g/L、7.47 mg/(g·h))提高38.5%和3.1%。

由于丁酸梭菌以丁酸發(fā)酵為主，以補(bǔ)料結(jié)束時生成的丁酸和乙醇的摩爾質(zhì)量和葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵相比，進(jìn)行概算，發(fā)現(xiàn)：添加乙醛分子后乙醇的生成量增加2.2 mmol/L，由于1 mol乙酰CoA生成乙醇需要氧化2 mol的NADH，因此，由此途徑氧化的NADH增加4.4 mmol/L。另一方面丁酸減少5.34 mmol/L，由于1 mol乙酰CoA生成丁酸需要氧化2 mol的NADH，因此，由此途徑氧化的NADH減少10.68 mmol/L。說明：經(jīng)丁酸合成途徑氧化的NADH有41.2%向乙醇支路遷移，增強(qiáng)了乙醇合成、減少了丁酸生成；有2 mmol/L的乙醇的碳架是由乙酰CoA節(jié)點流入，乙醛分子作為代謝調(diào)控因子起到了調(diào)控糖代謝流的作用；丁酸梭菌碳代謝中NADH的氧化還有乳酸和氫氣的生成途徑等，減少的約有58.8%的經(jīng)丁酸合成途徑氧化的NADH也可能進(jìn)入了這些途徑。

3 結(jié)論

本實驗在10 L發(fā)酵罐水平考察了葡萄糖和乙醛共補(bǔ)料策略對丁酸梭菌發(fā)酵生長的影響，獲得了一種有效的流加發(fā)酵策略，即5～10 h同時流加葡萄糖和乙醛溶液，生物量達(dá)到了11.37×108CFU/mL，并且發(fā)酵液中丁酸和乙酸濃度降低，使得原來經(jīng)丁酸合成途徑氧化的NADH有41.2%向乙醇支路遷移，強(qiáng)化了乙醇途徑，有效緩解了酸脅迫，促進(jìn)丁酸梭菌的生長，成功實現(xiàn)了高生物量和低有機(jī)酸產(chǎn)量的相對統(tǒng)一。并且發(fā)現(xiàn)乙醇生成途徑不是丁酸梭菌NADH氧化的主要通路，但是該途徑可以通過外源乙醛分子的添加得到強(qiáng)化，乙醛還原酶可能是該途徑的代謝瓶頸。本研究獲得的流加策略對丁酸梭菌工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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NADHoxidationtransferpromotesthegrowthofClostridiumbutyricum

XIA Hui-li1, CHEN Si-si1, CHEN Xiong1, HUANG Ya-nan2,XIE Ting3, LI Ai-ling3, WANG Zhi1*

1(Key Laboratory of Engineering (Ministry of Education), Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology, Hubei University of Technology, Wuhan 430068,China)2(Nanjiecun (Group) Co. Ltd., Linying 462600, China) 3(Topfond Pharmaceutical Co. Ltd., Zhumadian 463000, China)

In order to improve the biomass ofClostridiumbutyricum, acetaldehyde addition with an optimized concentration of 0.2 mmol/L at 0 h was first ensured at the anaerobic bottles level, which can significantly increase the biomass, and then, the effects of glucose co-feeding with acetaldehyde strategies on the fermentation characteristics ofClostridiumbutyricumin a 10 L bioreactor were investigated. The results showed that glucose co-feeding with acetaldehyde enhanced the cell growth (11.37×108CFU/mL), which was 14.5% and 21.1% higher than those of glucose fed-batch culture (9.93×108CFU/mL) and the batch culture (9.39×108CFU/mL). Furthermore, the specific productivity of butyrate and acetic decreased by 18.9% and 17.3%, and the specific productivity of ethanol was increased by 9.7% glucose fed-batch culture, achieving the unity between a higher biomass and a lower acid production simultaneously. The addition of acetaldehyde promoted the NADH oxidation from butyrate biosynthesis pathway to the ethanol biosynthesis branch, which enhanced the ethanol synthesis with the reduced accumulation of butyrate and acetate, and the cell growth efficiency ofClostridiumbutyricumwas improved simultaneously.

Clostridiumbutyricum; biomass; NADH oxidation; acetaldehyde

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014394

碩士研究生(王志副教授為通訊作者,E-mail: 476462848@qq.com)。

湖北省自然科學(xué)基金(2014CFB604)

2017-03-27，改回日期：2017-05-08