張俊，李進(jìn)，呂海英，馬雪

(新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830054)

響應(yīng)面法優(yōu)化扁桃果皮熊果酸的純化工藝

張俊，李進(jìn)*，呂海英，馬雪

(新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830054)

利用響應(yīng)面法優(yōu)化扁桃果皮中熊果酸的最佳純化工藝。為純化扁桃果皮中的熊果酸，以吸附量與解析率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從6種大孔樹(shù)脂篩選出AB-8和HPD100兩種最優(yōu)樹(shù)脂，按照一定質(zhì)量比進(jìn)行混合試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，得到優(yōu)化純化工藝為：上樣液濃度0.31 mg/mL，上樣液pH5.01，上樣液流速1.0 mL/min；洗脫液濃度90%，洗脫液pH 5.06，洗脫液流速1.0 mL/min，在此條件下熊果酸的純度由原來(lái)的6.35%提高到32%，提高了5.03倍。

扁桃；熊果酸；混合樹(shù)脂；響應(yīng)面

扁桃(AmygdaluscommunisL.)，屬薔薇科(Rosaceae)桃屬(AmygdalusL.)喬木，為世界上著名的木本油料樹(shù)和干果樹(shù)種[1]。我國(guó)扁桃的規(guī)?；a(chǎn)主要集中在新疆的喀什和和田地區(qū)[2]，以喀什莎車縣為主產(chǎn)區(qū)[3]，扁桃的生產(chǎn)為當(dāng)?shù)毓r(nóng)帶來(lái)了豐厚的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)，加工過(guò)程中也產(chǎn)生了大量果皮廢棄物，而果皮中含有具有生物活性的熊果酸[4]。熊果酸是多種天然產(chǎn)物的功能性成分[5]，具有抗氧化、保肝、抗腫瘤、抗炎抑菌、降低血脂等多種活性[6-11]，具有廣泛的應(yīng)用前景。

大孔吸附樹(shù)脂廣泛應(yīng)用于關(guān)于黃酮、多糖、多酚、皂苷等活性成分的分離純化[12-15]，其成本較低、吸附速度快、洗脫容易等優(yōu)點(diǎn)[16]。扁桃的研究主要有營(yíng)養(yǎng)功效及栽培技術(shù)，但對(duì)扁桃果皮熊果酸研究鮮有報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)以扁桃果皮為原料來(lái)提取扁桃果皮中的熊果酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扁桃果皮，2016年8月下旬采集于新疆莎車縣扁桃種植區(qū)，由本實(shí)驗(yàn)室植物學(xué)專家鑒定。扁桃干燥果皮經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩后，存于室內(nèi)陰涼干燥處備用。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；乙醇、香草醛-冰醋酸、高氯酸、冰醋酸，均為分析純；蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能粉碎機(jī)，永康市小寶電器有限公司；RV10自動(dòng)控制型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA集團(tuán)； AUY220電子天平，日本島津公司；TDL-60-B臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；VIS-7220紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，無(wú)水乙醇定容至50 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL分別置于6個(gè)比色管內(nèi)，水浴加熱揮去溶劑，加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，加入高氯酸0.8 mL，搖勻；在60℃的水浴鍋內(nèi)進(jìn)行顯色處理15 min，用冰乙酸定容至5 mL，搖勻。以空白試劑為參比，測(cè)定546 nm波長(zhǎng)處吸光度，以熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品含量(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[17-18]。得回歸方程y=0.067x-0.003 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8。

1.3.2 樣品溶液的制備

取2 g扁桃果皮粉，以體積分?jǐn)?shù)為65%乙醇為提取液，料液比1∶20(g∶mL)，80 ℃提取1.5 h，浸提2次，合并浸提液，減壓濃縮，常溫下定容至100 mL容量瓶中，待用。

1. 4 大孔樹(shù)脂的篩選

1.4.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理[19]

D101、AB-8、HPD-100、X-5、S-8和NKA-9大孔吸附樹(shù)脂，使用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液浸泡24 h，用蒸餾水沖洗樹(shù)脂無(wú)醇味，然后進(jìn)行酸堿處理，5% HCl溶液浸泡3 h，5% NaOH溶液浸泡3 h，分別用蒸餾水洗至溶液pH值為中性，放入烘箱50 ℃烘干，備用。

1.4.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

取已處理好的大孔吸附樹(shù)脂各2.0 g，置于250 mL 錐形瓶中，加入熊果酸提取液20 mL，室溫置于120 r/min振蕩器吸附24 h。將充分吸附后的樹(shù)脂過(guò)濾，置于250 mL錐形瓶中，再加入95%的乙醇20 mL，室溫置于振蕩器洗脫24 h，計(jì)算樹(shù)脂的靜態(tài)飽和吸附率和解吸量、解吸率。

吸附量/(mg·g-1)=(C0-C1)V1/m

(1)

解吸量/(mg·g-1)=C2V2/m

(2)

解吸率/%=[C2V2/(C0-C1)V1]×100

(3)

式中：C0為上樣液中熊果酸質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附液中熊果質(zhì)量酸濃度，mg/mL；C2為解吸液中熊果酸質(zhì)量濃度，mg/mL；m為干樹(shù)脂質(zhì)量，g；V1為吸附液體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

上述方法選出的效果較好的2種樹(shù)脂按照不同質(zhì)量比例混合[20]，準(zhǔn)確稱取2.0 g預(yù)處理過(guò)的混合樹(shù)脂放入錐形瓶中，量取0.15 mg/mL的扁桃果皮熊果酸溶液20 mL進(jìn)行吸附和洗脫，計(jì)算吸附率和洗脫率，選出最優(yōu)的混合比例。

1.5 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸單因素試驗(yàn)

1.5.1 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取已預(yù)處理好的大孔吸附樹(shù)脂各8 mL濕法裝柱，分別考察上樣液濃度、上樣量、pH、流速對(duì)吸附率的影響，測(cè)定流出液中熊果酸的含量，計(jì)算吸附率。

1.5.2 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解吸單因素試驗(yàn)

按上述確定的最佳吸附條件上樣，用3BV蒸餾水沖洗，分別考察洗脫液體積分?jǐn)?shù)、洗脫量、pH、流速對(duì)解吸率的影響，測(cè)定流出液中熊果酸的含量，計(jì)算解吸率。

1.6 吸附與解吸響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò) Design-Expert 8.0.6.1軟件，根據(jù)Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1、表2。

表1 吸附響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design for the optimization of adsorption conditions

表2 解吸響應(yīng)面因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design for the optimization of desorption conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

2.1.1 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

6種不同型號(hào)樹(shù)脂對(duì)扁桃果皮熊果酸的靜態(tài)吸附和解吸性能試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。S-8和HPD100樹(shù)脂吸附量較大，但在靜態(tài)解吸試驗(yàn)中，AB-8解吸率較大，綜合吸附量與解吸率數(shù)據(jù)，最終選用AB-8和HPD100樹(shù)脂按一定質(zhì)量比進(jìn)行混合。

表3 不同樹(shù)脂對(duì)熊果酸的靜態(tài)吸附和解吸性能Table 3 Static Adsorption and Desorption capabilities of different resins to ursolic acid

2.1.2 AB-8和HPD100樹(shù)脂混合比例的篩選

AB-8和HPD100按照不同質(zhì)量比例混合，靜態(tài)吸附和解吸性能試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)質(zhì)量比例為1∶2時(shí)純化效果最佳，故最終選擇AB-8和HPD100的混合質(zhì)量比例為1∶2。

圖1 AB-8和HPD100的混合比例的篩選Fig.1 Determination of the ratio of AB-8 and HPD100

2.2 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

2.2.1 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附單因素試驗(yàn)

由圖2可以看出，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為0.35 mg/mL時(shí)，吸附率達(dá)到最大，之后樹(shù)脂吸附率隨著上樣液質(zhì)量濃度增加而減小。這可能是上樣液濃度達(dá)到0.35 mg/mL時(shí)，樹(shù)脂達(dá)到吸附飽和[21]，又因?yàn)殡S著上樣液質(zhì)量濃度的增大，樹(shù)脂吸附的雜質(zhì)量也有所增加，產(chǎn)生多層吸附，樹(shù)脂微孔堵塞，導(dǎo)致吸附率降低[22]，故選擇上樣液質(zhì)量濃度為0.35 mg/mL。

圖2 上樣液濃度對(duì)吸附率的影響Fig.2 Effect of sample concentration on the adsorption rate

由圖3可知，當(dāng)上樣量為2 BV時(shí)，流出液中熊果酸的濃度達(dá)到上樣液濃度的10%，為大孔樹(shù)脂的泄漏點(diǎn)[23]，隨著上樣量的增加，流出液中熊果酸濃度逐漸增大，為了避免樣品浪費(fèi)，選擇最佳上樣量為2 BV。

圖3 上樣量對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of sample volume on the adsorption rate

如圖4所示，當(dāng)pH=5時(shí)吸附率達(dá)到最大值，隨著pH值的繼續(xù)增大，樹(shù)脂吸附率逐漸減小，這是因?yàn)閜H值過(guò)低熊果酸以佯鹽形式存在，不利于其吸附；pH值過(guò)高則以離子形式存在，都不利于被弱極性的樹(shù)脂吸附[24]，故選擇上樣液pH=5 為最佳。

圖4 上樣液pH對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effect of sample pH on the adsorption rate

從圖5可知，隨著上樣液流速的增大，樹(shù)脂吸附率逐漸降低。上樣液流速對(duì)樹(shù)脂吸附的影響主要是溶質(zhì)向樹(shù)脂表面的擴(kuò)散作用[25]。流速太快，不利于上樣液與樹(shù)脂表面充分接觸，吸附率降低，但流速過(guò)低，生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，生產(chǎn)效率降低。綜合考慮選取上樣液流速為2.0 mL/min。

圖5 上樣液流速對(duì)吸附率的影響Fig.5 Effect of flow rate on the adsorption rate

2.2.2 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解吸單因素試驗(yàn)

由圖6所示，當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí)，熊果酸解吸率接近最大值。洗脫液體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，熊果酸不易被洗脫，體積分?jǐn)?shù)過(guò)大，部分雜質(zhì)被一起洗脫。故選用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行解吸。

圖6 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響Fig.6 Effect of eluent concentration on the desorption rate

由圖7可知，洗脫液用量為2BV時(shí)，洗脫液中熊果酸濃度達(dá)到最大值，增加洗脫液用量，熊果酸濃度降低，當(dāng)洗脫液用量為3BV 時(shí)，洗脫液中熊果酸濃度不足0.01 mg/mL，說(shuō)明熊果酸基本洗脫完全[26]。

圖7 洗脫液用量對(duì)解吸率的影響Fig.7 Effect of eluent volume on the desorption rate

由圖8可知，當(dāng)洗脫液pH=5時(shí)解析率達(dá)到最大值，說(shuō)明洗脫液偏弱酸時(shí)，解吸率效果較好，繼續(xù)增大pH，解吸率快速降低。因此選擇洗脫液pH=5。

圖8 洗脫液pH對(duì)解吸率的影響Fig.8 Effect of eluent pH on the desorption rate

如圖9所示，隨著洗脫液流速的增大，洗脫率逐漸降低。由于洗脫液流速過(guò)快，洗脫液不能與樹(shù)脂吸附的熊果酸分子充分接觸，導(dǎo)致熊果酸解吸率降低。綜合考慮生產(chǎn)效率與生產(chǎn)周期最終選擇洗脫液流速為2.0 mL/min。

圖9 洗脫液流速對(duì)解吸率的影響Fig.9 Effect of eluent flow rate on the desorption rate

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò) Design-Expert 8.0.6.1軟件試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表4 吸附熊果酸響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiment for adsorption rate of ursolic acid

表5 解吸熊果酸響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiment for the desorption rate of ursolic acid

2.3.2 響應(yīng)面方差分析

采用 Design expert 8.0.6.1 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合。

吸附率(Y1)對(duì)上樣液濃度(A1)、上樣液pH(B1)、上樣液流速(C1)的二次多元回歸方程：

Y1=63.05-2.19A1+0.69B1-2.69C1+0.5A1B1+1.15A1C1+0.43B1C1-3.83A12-1.85B12-0.38C12

(4)

解吸率(Y2)對(duì)洗脫液體積分?jǐn)?shù)(A2)、洗脫液pH(B2)、洗脫液流速(C2)的二次多元回歸方程：

Y2=49.56+3.61A2+0.49B2-3.46C2-0.14A2B2+0.092A2C2+0.23B2C2-3.49A22-1.53B22-0.5C22

(5)

表6 吸附率回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model for the adsorption rate

注：**.極顯著(p<0.01)，*.顯著(p<0.05)，下同。

表7 解吸率回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model for the desorption rate

2.3.3 響應(yīng)面分析

如圖10所示，響應(yīng)面開(kāi)口向下，隨著各因素的增加，響應(yīng)值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，說(shuō)明響應(yīng)值具有最大值，響應(yīng)面圖的坡度及等高線的形狀可以反應(yīng)兩因素之間交互作用強(qiáng)弱，響應(yīng)面圖形的坡度越陡，等高線形狀為橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[28]。通過(guò)Design expert 8.0.6.1分析可得，吸附最佳條件為：上樣液濃度0.31 mg/mL，上樣液pH 5.01，上樣液流速1 mL/min，吸附率為66.23%；洗脫最佳條件為：洗脫液濃度90.2%，洗脫液pH 5.06，洗脫液流速1.0 mL/min，解吸率為53.42%。為實(shí)際操作方便，將洗脫最佳條件修正為：洗脫液濃度90%，洗脫液pH5.06，洗脫液流速1.0 mL/min。在此條件下實(shí)際測(cè)得吸附率為62.25%，解吸率為50.35%，與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明由響應(yīng)面法得出的熊果酸最佳純化工藝的可行的。

圖10 兩因素交互影響吸附率與解吸率的響應(yīng)曲面圖分析Fig.10 Response surface analysis of adsorption and desorption rate affected by two-factor

3 結(jié)論

通過(guò)比較樹(shù)脂對(duì)熊果酸吸附和解吸效果，AB-8和HPD100為最佳樹(shù)脂，當(dāng)樹(shù)脂質(zhì)量比為1∶2時(shí)純化效果最佳。利用響應(yīng)面法對(duì)熊果酸純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳吸附工藝條件為上樣液濃度0.31 mg/mL，上樣液pH 5.01，上樣液流速1 mL/min，在此條件下熊果酸吸附率為62.25%；最佳洗脫工藝條件為洗脫液濃度90%，洗脫液pH 5.06，洗脫液流速1.0 mL/min，在此條件下熊果酸解吸率為50.35%，熊果酸純度由原來(lái)的6.35%提升到32%。

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OptimizationofpurificationprocessforursolicacidfromAmygdaluscommunisL.peelbyresponsesurfacemethodology

ZHANG Jun, LI Jin*, LYU Hai-ying, MA Xue

(Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology,Key Laboratory of Plant Stress Biology in Arid Land，College of Life Sciences, Xinjiang Normal University, ürümqi 830054, China)

Response surface methodology was used to optimize purification process of ursolic acid fromAmygdaluscommunisL. peel. In order to purify ursolic acid inAmygdaluscommunisL. peel, adsorption mass and desorption rate were selected as the evaluation indexes, two resins of AB-8 and HPD100 were screened from six resins, and mixed with a certain mass ratio. On the basis of single factor experiments, response surface test was designed by Box-Benhnken experimental principle. The optimum purification process were as follows: sample concentration 0.31 mg/mL, sample pH 5.01, sample flow rate1.0 mL/min; eluent concentration 90%, eluent pH 5.06, eluent flow rate 1.0 mL/min. Under the above conditions, ursolic acid purity increased 5.03 times which was from 6.35% to 32%.

amygdalus communis; ursolic acid; mixed resin; response surface methodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014344

碩士研究生(李進(jìn)教授為通訊作者,E-mail：xjcjlj4@xjnu.edu.cn)。

新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(xjsfdx2016-06)

2017-03-20，改回日期：2017-04-20