，，，賀修

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)腫瘤研究所)

·臨床醫(yī)學(xué)·

結(jié)腸癌中DLC-1與Moesin的表達及臨床病理學(xué)意義

全勝1，陳雄新1，華中昌1，賀修勝2*

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)腫瘤研究所)

目的探討結(jié)腸癌組織中DLC-1及Moesin表達的相關(guān)性與臨床病理學(xué)意義。方法收集結(jié)腸癌標本72例及相應(yīng)癌旁結(jié)腸黏膜組織，分別應(yīng)用Western blotting和免疫組化方法檢測DLC-1及Moesin蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果結(jié)腸癌組織中DLC-1蛋白表達水平及其陽性表達率明顯低于癌旁結(jié)腸黏膜組織，而Moesin蛋白表達水平及其陽性表達率明顯高于癌旁結(jié)腸黏膜組織，兩者表達呈負相關(guān)。低分化結(jié)腸癌組織中DLC-1陽性表達率低于高、中分化結(jié)腸癌組織，而Moesin陽性表達率高于高、中分化結(jié)腸癌組織；Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中DLC-1陽性表達率低于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)腸癌組織，而Moesin陽性表達率高于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)腸癌組織；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及5年內(nèi)病情復(fù)發(fā)或者死亡病例結(jié)腸癌組織中DLC-1陽性表達率分別低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及5年內(nèi)無復(fù)發(fā)病例，而Moesin陽性表達率分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及5年內(nèi)無復(fù)發(fā)病例，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論結(jié)腸癌組織中DLC-1低表達，Moesin高表達，兩者表達呈負相關(guān)。DLC-1低表達及Moesin高表達與結(jié)腸癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

結(jié)腸癌； Moesin； DLC-1； 分化； TNM分期； 轉(zhuǎn)移

目前我國及世界范圍內(nèi)結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，嚴重危害人們的健康[1]。侵襲和轉(zhuǎn)移也是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者死亡的主要原因，探討侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制對于防治結(jié)腸癌具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌缺失基因(deleted in liver cancer-1,DLC-1)低表達可導(dǎo)致Rho蛋白活化，而活化的Rho蛋白可導(dǎo)致膜突蛋白(Moesin)表達增高，參與肝癌、多形性膠質(zhì)瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[2-3]；體外實驗也證實轉(zhuǎn)染DLC-1基因能抑制結(jié)腸癌細胞生長增殖[4-5]，但關(guān)于結(jié)腸癌組織中DLC-1與Moesin表達的相關(guān)性及其作用機制未見報道。本研究通過檢測DLC-1及Moesin蛋白質(zhì)在結(jié)腸癌組織中的表達，分析其相關(guān)性及臨床病理學(xué)意義，為進一步研究DLC-1及Moesin在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1臨床資料收集南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院2009年10月～2011年10月行結(jié)腸癌根治術(shù)并建立電話隨訪的72例病例標本及相應(yīng)的癌旁(距癌組織至少5 cm或以上)結(jié)腸黏膜組織，所有病例均經(jīng)過病理學(xué)診斷證實，且術(shù)前均未接受放化療，其中男性50例，女性22例，年齡<50歲32例，≥50歲40例，高、中分化結(jié)腸癌28例、低分化結(jié)腸癌44例；TNM分期Ⅰ和Ⅱ期40例、Ⅲ和Ⅳ期32例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例；38例在5年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡，34例5年內(nèi)無復(fù)發(fā)。所有病例標本手術(shù)取材后保存于液氮罐，分別用于提取組織蛋白質(zhì)或經(jīng)4%多聚甲醛固定制成石蠟切片。

1.2實驗試劑蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、PVDF膜購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗人β-actin單抗購自武漢博士德公司，Moesin及DLC-1兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.3實驗方法

1.3.1 Western blotting法 提取各組結(jié)腸組織標本總蛋白并采用BCA 法測定樣品蛋白濃度，將樣品與上樣緩沖液混合后SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)到 PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉1.5 h，分別加入Moesin( 1∶800)及DLC-1( 1∶1000)兔抗人多克隆抗體和β-actin 抗體( 1∶500) ，37 ℃孵育2 h，HRP 標記II抗孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采用Quantity One軟件測定各條帶的吸光度值，分別以各條帶與β-actin吸光度的比值計算各組標本中DLC-1及Moesin蛋白的相對含量。

1.3.2 免疫組織化學(xué)方法 采用改良型SP法檢測標本中DLC-1及Moesin蛋白的表達。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2孵育10 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，10%枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原，PBS 洗后滴加適度稀釋的Moesin( 1∶300)及DLC-1( 1∶200)兔抗人多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下觀察。陰性對照以PBS代替I抗。免疫組化染色結(jié)果判斷根據(jù)文獻[6]進行：每張切片至少隨機觀察10個高倍視野，按照陽性細胞所占比例記分:無陽性細胞為0分；≤ 10% 為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75% 為 4分。同時根據(jù)染色強度記分為: 無黃色為0分；淡黃色為1分；黃色或深黃色為2 分；褐色或深褐色為3 分。兩項指標的積分相乘結(jié)果: ≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理各組數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用百分率(%) 表示，樣本率的比較行2檢驗；計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較行t檢驗，DLC-1及Moesin在結(jié)腸癌組織中的表達進行Spearman相關(guān)性分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌組織中DLC-1及Moesin蛋白的表達

Western blotting檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中DLC-1的相對含量(0.08±0.01)明顯低于癌旁結(jié)腸黏膜組織(0.98±0.06)，而結(jié)腸癌組織中Moesin蛋白(1.16±0.09)明顯高于癌旁結(jié)腸黏膜組織(0.10±0.02)(P<0.05,圖1)。免疫組化顯示，DLC-1陽性表達于胞漿，Moesin陽性表達定位于胞漿、胞膜(圖2，圖3)。在結(jié)腸癌及癌旁結(jié)腸黏膜組織中DLC-1的陽性表達率分別為29.2%(21/72)及87.5%(63/72)，Moesin的陽性表達率分別為83.3%(60/72)及11.1%(8/72)，差異均有顯著性(P<0.05)。

2.2結(jié)腸癌組織DLC-1及Moesin蛋白表達的相關(guān)性51例DLC-1蛋白表達陰性結(jié)腸癌組織標本中有46例Moesin表達陽性，而21例DLC-1表達陽性的結(jié)腸癌組織標本有7例Moesin表達陰性，兩者均陽性的標本有14例，相關(guān)性分析表明，結(jié)腸癌組織標本中DLC-1及Moesin蛋白表達呈負相關(guān)(2=27.245，r= - 0.524，P<0.05)。

2.3結(jié)腸癌組織中DLC-1及Moesin蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系如表1所示，不同年齡、性別結(jié)腸癌組織中DLC-1及Moesin蛋白陽性表達率無明顯差異。低分化結(jié)腸癌組織中DLC-1、Moesin陽性表達率分別為13.6%(6/44)及93.2%(41/44)，而高、中分化結(jié)腸癌組織的陽性表達率分別為53.6%(15/28)及67.9%(19/28)；Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中DLC-1、Moesin陽性表達率分別為11.1%(4/36)及97.2%(35/36)，而Ⅰ、Ⅱ期分別為47.2%(17/36)及69.4%(25/36)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中DLC-1、Moesin陽性表達率分別為6.7%(2/30)及100%(30/30)，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分別為45.2%(19/42)及71.4%(30/42)；5年內(nèi)病情復(fù)發(fā)或者死亡病例結(jié)腸癌組織中DLC-1、Moesin陽性表達率分別為13.2%(5/38)及97.4%(37/38),而5年內(nèi)無復(fù)發(fā)病例分別為47.1%(16/34)及67.6%(23/34)，差異均有顯著性(P<0.05)。

圖1 Western blotting檢測DLC-1及Moesin蛋白表達A：免疫印跡檢測兩種蛋白質(zhì)表達的代表性圖；B：兩種蛋白質(zhì)相對表達量統(tǒng)計分析(n=72).與癌旁結(jié)腸組織比較，*P<0.05. T：結(jié)腸癌組織;N: 癌旁結(jié)腸組織

圖2 免疫組化檢測DLC-1的表達A：癌旁結(jié)腸組織；B：結(jié)腸癌組織

圖3 免疫組化檢測Moesin的表達A：癌旁結(jié)腸組織；B：結(jié)腸癌組織

表1 結(jié)腸癌組織中DLC-1及Moesin蛋白表達與臨床病理特征#關(guān)系

#結(jié)腸癌組織學(xué)分型及TNM分期標準根據(jù)2013年4月國家衛(wèi)計委頒發(fā)“結(jié)腸癌規(guī)范化診療指南(試行)”執(zhí)行

3 討 論

DLC-1基因位于人染色體8p21.3-22區(qū)，其cDNA全長3 850 bp，含14個外顯子，編碼由1 091個氨基酸組成、相對分子質(zhì)量為123 kDa的蛋白質(zhì)。DLC-1蛋白主要位于細胞質(zhì)中，它含有RhoGTP酶激活蛋白(Rho GTPase activating protein,Rho GAP)、類固醇急性調(diào)節(jié)相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移域( steroidogenic acute regulatory related lipid transfer domains,START)和山姆(sterile alpha motif,SAM) 3個重要的功能結(jié)構(gòu)域，此外，在Rho GAP和SAM結(jié)構(gòu)域之間富含絲氨酸的區(qū)域存在一個黏著斑定位序列(focal adhesion targeting sequence)[7]。其中Rho GAP結(jié)構(gòu)域能特異性增強Rho家族蛋白自身內(nèi)源性GTP酶水解活性，催化GTP水解使Rho蛋白失活，因此DLC-1蛋白通過Rho GAP結(jié)構(gòu)域扮演了Rho蛋白負性調(diào)控因子的作用，Rho GAP結(jié)構(gòu)域也是DLC-1蛋白抗腫瘤作用的主要位點[8]。黏著斑定位序列使DLC-1蛋白可以結(jié)合張力蛋白和肌動蛋白上的SH2結(jié)構(gòu)域，在黏著斑定位及腫瘤抑制中也發(fā)揮重要作用[9]。DLC-1基因在肝癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中經(jīng)常發(fā)生表達的缺失或下調(diào)，其下調(diào)機制往往與啟動子區(qū)域甲基化有關(guān)[6,10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默DLC-1陽性表達的LoVo結(jié)腸癌細胞株中DLC-1的表達，可導(dǎo)致細胞增殖加快，侵襲能力明顯增強[11]；而將DLC-1基因轉(zhuǎn)染至DLC-1低表達的SW480及HT-29結(jié)腸癌細胞后，能使其細胞周期阻滯，抑制其增殖和遷移能力，其機制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路及CyclinD1、p21的表達有關(guān)[4-5]，表明DLC-1基因?qū)Y(jié)腸癌細胞有抑制作用，可能也是結(jié)腸癌的一種抑制基因。本文結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中DLC-1蛋白表達水平及其陽性表達率明顯低于癌旁結(jié)腸黏膜組織，且分化程度越低的結(jié)腸癌組織中DLC-1陽性表達率越低，Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中DLC-1陽性表達率低于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)腸癌組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及5年內(nèi)病情復(fù)發(fā)或者死亡病例結(jié)腸癌組織中DLC-1陽性表達率分別低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及5年內(nèi)無復(fù)發(fā)病例，證實DLC-1基因在結(jié)腸癌中具有抑制基因功能，其低表達與結(jié)腸癌分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

膜突蛋白(Moesin)屬埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(Ezrin-Radixin -Moesin，ERM)家族成員，該蛋白家族的成員在維持細胞骨架結(jié)構(gòu)和細胞運動過程起著重要作用[12]。膜突蛋白基因定位于Xq11.2-Xq12區(qū)，其cDNA全長3835 bp，編碼577個氨基酸組成的蛋白質(zhì)分子。激活的Moesin蛋白能介導(dǎo)肌動蛋白與質(zhì)膜的交聯(lián)從而引發(fā)肌動蛋白骨架的重構(gòu)，促進細胞生長、遷移，因此Moesin蛋白高表達參與了多種腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移過程[13-14]。已有研究表明Moesin高表達不僅與乳腺癌分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是乳腺癌的潛在標志物[15]，而且與宮頸鱗癌[16]、甲狀腺乳頭狀癌[17]等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中Moesin蛋白表達水平及其陽性表達率明顯高于癌旁結(jié)腸黏膜組織；Moesin表達與性別、年齡無關(guān)，但低分化結(jié)腸癌組織中Moesin陽性表達率明顯高于高、中分化結(jié)腸癌組織，且Moesin蛋白高表達與結(jié)腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期結(jié)腸癌組織Moesin陽性表達率高于Ⅰ+Ⅱ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及5年內(nèi)病情復(fù)發(fā)或者死亡病例結(jié)腸癌組織中Moesin陽性表達率分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及5年內(nèi)無復(fù)發(fā)病例，提示Moesin在結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移過程可能具有重要作用，這也與先前的研究報道認為Moesin高表達與結(jié)直腸癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes'分期有關(guān)的觀點相符[18]。由于Moesin高表達能導(dǎo)致細胞骨架重構(gòu)，促進腫瘤細胞浸潤及轉(zhuǎn)移，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移與結(jié)腸癌患者臨床分期及預(yù)后息息相關(guān)，這也就不難解釋本研究中DLC-1低表達及Moesin高表達與結(jié)腸癌臨床分期及預(yù)后直接相關(guān)。

既往有研究報道，DLC-1低表達可通過Rho蛋白級聯(lián)導(dǎo)致Moesin表達增高，參與多形性膠質(zhì)瘤、肝癌等的侵襲、轉(zhuǎn)移[2-3]。本文結(jié)腸癌組織中DLC-1與Moesin的表達呈負相關(guān)，提示結(jié)腸癌組織中DLC-1的低表達也能促進Moesin高表達，進而參與結(jié)腸癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，但結(jié)腸癌中DLC-1低表達是否也可通過Rho蛋白導(dǎo)致Moesin表達改變，有待進一步研究。

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TheexpressionandclinicalpathologicalsignificancesofDLC-1andMoesininhumancoloncancertissues

QUAN Sheng，CHEN Xiongxin，HUA Zhongchang，et al

(MedicalCollege,HunanPolytechnicofEnvironmentandBiology,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo explore the correlation and clinical pathological significances of DLC-1and Moesin in colon cancer tissues.Methods72 cases of human colon carcinoma tissues with different clinical stage and differentiation degree and matching colon mucosa tissues in paratumor were collected，in which the expression of DLC-1and Moesin were detected by Western blotting and immunohistochemistry,respectively.ResultsCompared with colon mucosa tissues in paratumor，the expression and positive rates of DLC-1 protein in carcinoma tissues decreased,but Moesin increased significantly.DLC-1 expression was found to inversely correlate with Moesin in colon carcinoma tissues.The positive rate of DLC-1 in poorly-differentiated colon carcinoma tissues was lower than that in well or moderately-differentiated colon cancer tissues.In colon carcinoma tissues at Ⅲ or Ⅳof TNM stage,with lymphatic metastasis and with recurrence or death in less than 5 years,the positive rate of DLC-1 was lower than that at Ⅰ or Ⅱ stage,without lymphatic metastasis and with relapse-free in five years,respectively.The positive rates of Moesin was inverse to DLC-1 in colon carcinoma tissues with different differentiation degree,TNM stage,lymph node metastasis and prognosis.ConclusionThe expression of DLC-1 protein decreased and was inversely correlated with Moesin which was increased significantly in colon carcinoma tissues,and Moesin and DLC-1 were highly correlated with tumor differentiation,TNM stage,lymph node metastasis and prognosis of colon cancer．

colon cancer; Moesin; DLC-1; differentiation; TNM stage; metastasis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.013

2016-07-16；

2017-03-30

2014年湖南省教育廳科研項目(編號：14C0387 ).

*通訊作者，E-mail: Hexiusheng@hotmail.com.

R735.35

A

蔣湘蓮)