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(1.湖南省婁底市婁星區(qū)人民醫(yī)院,湖南 婁底 417000； 2.湖南省中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,湖南 株洲 412000)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

游泳訓(xùn)練對新生大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬神經(jīng)發(fā)生的影響

劉鵬英1,張春花1,陳歆2,賀軍民1*

(1.湖南省婁底市婁星區(qū)人民醫(yī)院,湖南 婁底 417000； 2.湖南省中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,湖南 株洲 412000)

目的觀察游泳訓(xùn)練對新生大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬神經(jīng)發(fā)生的影響。方法雄性7日齡新生SD大鼠隨機分為對照和游泳訓(xùn)練組。訓(xùn)練組大鼠出生后第11天進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練3周。Morris水迷宮法檢測學(xué)習(xí)記憶能力,BrdU+/NeuN+免疫熒光雙標(biāo)染色分析海馬神經(jīng)發(fā)生,Western blot檢測海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白表達(dá)。結(jié)果對照和游泳訓(xùn)練組大鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)增加,尋找平臺潛伏期均明顯縮短(均P<0.05)；定位航行實驗的第二、三和四天,游泳訓(xùn)練組大鼠尋找平臺潛伏期較對照組均顯著減小(均P<0.05)。游泳訓(xùn)練組大鼠穿越目標(biāo)次數(shù)何時間明顯增加(均P<0.05)。與對照相比,游泳訓(xùn)練組大鼠海馬齒狀回NeuN+/BrdU+陽性數(shù)量顯著增加(P<0.05),BDNF表達(dá)顯著增加(P<0.05)。結(jié)論游泳訓(xùn)練提高了新生大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其機制可能與游泳訓(xùn)練顯著上調(diào)大鼠海馬BDNF的表達(dá)促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生有關(guān)。

新生大鼠； 游泳訓(xùn)練； 學(xué)習(xí)記憶； 海馬； 神經(jīng)發(fā)生； 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

研究發(fā)現(xiàn)運動能促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能和個性發(fā)展,增強體魄,保障身體健康,還能促進(jìn)心理健康,也能降低以認(rèn)知功能障礙為特征的阿爾默海茨病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病風(fēng)險[1]。海馬是參與學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū),研究表明運動能上調(diào)大鼠海馬組織中c-fos和c-jun等即刻早期基因的表達(dá),促進(jìn)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元的增殖和分化,誘導(dǎo)長時程增強,增加學(xué)習(xí)和記憶能力[2-3]。海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞亞層是神經(jīng)干細(xì)胞的聚集區(qū),能夠不斷產(chǎn)生新的顆粒細(xì)胞,這些新生的細(xì)胞能不斷的分化、遷移,最終發(fā)育為新的、完整的神經(jīng)細(xì)胞,這個過程稱為海馬神經(jīng)發(fā)生[4-5]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)在神經(jīng)元生長發(fā)育過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,特別是在與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的海馬中,參與了海馬神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控[6-7]。嬰幼兒時期是學(xué)習(xí)和記憶功能發(fā)育的重要時期,研究顯示早期的強度過大、時間過長的不良刺激,如：麻醉、慢性疼痛等可抑制學(xué)習(xí)和記憶功能的發(fā)育,對學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生不良影響[8]。早期的適宜刺激可增加海馬的突觸密度,增強學(xué)習(xí)記憶功能的發(fā)育。因此本研究旨在探討游泳訓(xùn)練對新生大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的影響,并從BDNF信號通路和海馬神經(jīng)發(fā)生的角度初步探索其機制。

1 材料與方法

1.1材料改良型Morris水迷宮實驗裝置(成都泰盟科技有限公司)。BrdU(美國Sigma公司),BrdU一抗(美國Accurate Chemical Westbury公司)和神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN一抗(美國Millipore公司)。BCA蛋白定量試劑(美國Invitrogen公司)。兔抗大鼠BDNF和β-actin抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國Santa Cruz公司)。

1.2實驗方法

1.2.1 實驗動物與分組 實驗中共使用SPF級6窩SD新生大鼠,每窩6～10只大鼠,共81只7日齡新生大鼠和10只孕鼠(湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供)。孕鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng),每籠1只,孕鼠自然分娩。選擇36只健康雄性新生SD大鼠用于后續(xù)實驗。在哺乳期間母鼠與新生SD大鼠同籠飼養(yǎng),采用母乳喂養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫為22 ℃,相對濕度為55%,12 h光照,自由進(jìn)食和飲水。根據(jù)隨機區(qū)組化實驗設(shè)計的原則,將入選的健康雄性新生SD大鼠隨機分為對照組和游泳訓(xùn)練組(n=18)。

1.2.2 游泳訓(xùn)練 進(jìn)行游泳訓(xùn)練的圓形水池高30 cm,直徑是50 cm,水面距離圓形水池上緣20 cm,水溫維持在24～26 ℃。7日齡的新生大鼠從出生后第8天開始進(jìn)行3次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,每次30 min,每天1次,共進(jìn)行3天。隨后從出生后第11天進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練,每次60 min,每天1次,共進(jìn)行3周。3周的游泳訓(xùn)練結(jié)束后將每組大鼠隨機地分為三個亞組(n=6),一個亞組大鼠用于行為學(xué)檢測,一個亞組大鼠用于BrdU注射和免疫熒光雙標(biāo)記染色實驗,余下的大鼠用于Western blot分析。

1.2.3 Morris水迷宮測試 3周的游泳訓(xùn)練結(jié)束后,進(jìn)行Morris水迷宮測試。大鼠先熟悉實驗環(huán)境3天后,然后依次進(jìn)行定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗歷時4天,每天上午每只大鼠訓(xùn)練4次,每次訓(xùn)練采用不同象限入水,在大鼠放入水池時,都使大鼠面向池壁,同一次訓(xùn)練所有大鼠從相同的象限入水。每次訓(xùn)練60 s,大鼠如在60 s內(nèi)找到平臺并停留3 s,則訓(xùn)練結(jié)束,記錄其找到平臺的時間為潛伏期。如果大鼠在60 s內(nèi)沒有找到平臺,則人為的把大鼠引到平臺上,則其找到平臺的潛伏期為60 s。大鼠在每次爬到平臺上或被引到平臺上后,在平臺上停留休息15 s,實驗共進(jìn)行4次。空間探索實驗在大鼠的最后一次定位航行實驗結(jié)束后的24 h進(jìn)行,撤去平臺,選擇第三象限作為下水點,記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺區(qū)域次數(shù),記為穿越目標(biāo)次數(shù)；記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺區(qū)域的時間,記為穿越目標(biāo)時間。

1.2.4 BrdU注射和免疫熒光雙標(biāo)記染色 從游泳訓(xùn)練開始的第1天,所有大鼠通過腹腔注射BrdU(50 mg/kg體重),每天1次,連續(xù)進(jìn)行10天。3周的游泳訓(xùn)練結(jié)束后,2%戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g體重)腹腔注射麻醉大鼠,打開大鼠的胸腔,暴露心臟,剪開左心耳,從左心尖處插入灌流針,灌注0.1 mol/L PBS。將血液沖洗干凈后,再用4%多聚甲醛繼續(xù)灌注。打開顱腦骨,取出腦組織,在4%多聚甲醛中固定24 h,然后放置在30%蔗糖溶液中,4 ℃條件下保存。當(dāng)大鼠的腦組織沉到瓶底后,進(jìn)行冰凍切片,切片厚度為40 μm。

每只大鼠在海馬部位每6張腦切片選取第1張切片,切片選取好后,用HCl溶液(2 mmol/L)在37 ℃下處理30 min,PBS液清洗,在封閉液中室溫下孵育1 h。加入兔抗BrdU(1∶400)和山羊抗NeuN(1∶200),4 ℃孵育過夜。第2天用PBS清洗后,加入Alexa Fluor488(NeuN)和Alexa Fluor 594(BrdU)熒光染料標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶200),室溫下避光孵育2 h,PBS清洗、封片,在奧林巴斯共聚焦顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞層。在熒光顯微鏡下,BrdU+細(xì)胞呈現(xiàn)紅色顆粒狀熒光。NeuN+細(xì)胞呈現(xiàn)綠色顆粒狀熒光。BrdU+/NeuN+共同標(biāo)記細(xì)胞呈現(xiàn)黃色顆粒狀熒光。計算海馬DG區(qū)BrdU+/NeuN+熒光雙標(biāo)陽性細(xì)胞占BrdU+陽性細(xì)胞總數(shù)的百分率(%)。

1.2.5 Western blot分析 3周的游泳訓(xùn)練結(jié)束后,2%戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g體重)腹腔注射麻醉大鼠,打開大鼠的胸腔,暴露心臟,心臟放血處死大鼠,打開顱腦骨,取出腦組織。按試劑盒說明提取腦組織總蛋白,取適量蛋白樣本煮沸10 min變性蛋白。取蛋白樣品10 μL,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。通過電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜,4%脫脂牛奶孵育聚偏氟乙烯膜2 h以封閉非特異性抗原。加入兔抗大鼠BDNF和β-actin的一抗,4℃下孵育過夜。洗膜3次,加入二抗,4℃下繼續(xù)孵育4 h。ECL試劑顯影在膠片上,凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片并分析處理結(jié)果。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17 0統(tǒng)計軟件分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間差異比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1游泳訓(xùn)練對新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響采用Morris水迷宮實驗觀察游泳訓(xùn)練對新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。結(jié)果如表1所示：對照組和游泳訓(xùn)練組大鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)增加,尋找平臺的潛伏期均明顯縮短(均P<0.05)；在定位航行實驗的第二、三和四天,游泳訓(xùn)練組大鼠的尋找平臺潛伏期與對照組比較均顯著減小(均P<0.05)?？臻g探索實驗中,游泳訓(xùn)練組大鼠穿越目標(biāo)次數(shù)明顯增加(P<0.05),穿越目標(biāo)時間明顯延長(P<0.05)。

與對照組比較，a:P<0.05,n=14

2.2游泳訓(xùn)練對新生大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響B(tài)rdU可以標(biāo)記新生的細(xì)胞,而NeuN是成熟神經(jīng)元核內(nèi)標(biāo)記物,雙標(biāo)陽性的細(xì)胞為新生的成熟顆粒細(xì)胞。結(jié)果如圖1所示：與對照組相比,游泳訓(xùn)練組的大鼠海馬齒狀回NeuN+/BrdU+陽性數(shù)量顯著增加(P<0.05),表明游泳訓(xùn)練促進(jìn)了新生大鼠海馬新生細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元的分化。

2.3游泳訓(xùn)練對新生大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響結(jié)果如圖2所示：與對照組相比,游泳訓(xùn)練組的大鼠海馬BDNF表達(dá)水平顯著性增加(P<0.05)。

3 討 論

嬰幼兒時期是人和動物學(xué)習(xí)和記憶功能發(fā)育的關(guān)鍵時期。剛出生的大鼠在年齡上相當(dāng)于人類的孕期為28周的胎兒,出生7 天的大鼠相當(dāng)于人類的孕期為36周的胎兒,出生21 天的大鼠相當(dāng)于人類1～2歲的幼兒[9]。本研究中選擇出生7 天的新生大鼠作為研究對象,相當(dāng)于人類的早產(chǎn)兒的嬰兒時期,通過給予大鼠持續(xù)3周的游泳訓(xùn)練,觀察游泳訓(xùn)練對新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。本研究結(jié)果顯示游泳訓(xùn)練明顯增強了新生大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力,表現(xiàn)為在定位航行實驗的第二、三和四天,游泳訓(xùn)練組大鼠的尋找平臺潛伏期與對照組比較均顯著減小。游泳訓(xùn)練組大鼠穿越目標(biāo)次數(shù)明顯增加,穿越目標(biāo)時間明顯延長。

圖2 游泳訓(xùn)練對新生大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響與對照組比較,*P<0.05。

Morris水迷宮實驗是檢測鼠類動物的空間學(xué)習(xí)和記憶的形成和維持時間的常用行為學(xué)檢測方法[10]。Morris水迷宮實驗中的定位航行實驗可以檢測鼠類對空間記憶的獲得能力,找到平臺的潛伏期越長提示動物習(xí)得能力越低。Morris水迷宮實驗中的空間探索實驗可以檢測鼠類對記憶的保持能力,動物穿越目標(biāo)次數(shù)減少和穿越目標(biāo)時間縮短表明記憶保持能力降低[11]。本研究結(jié)果表明與對照組比較游泳訓(xùn)練組的新生大鼠的空間記憶的習(xí)得能力和記憶保持能力均明顯增加,早期的游泳訓(xùn)練能改善幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

認(rèn)知功能是指大腦對信息的獲取、儲存、加工和提取的能力,也就是對事物的構(gòu)成、事物的性能、該事物與他物的關(guān)系、事物的發(fā)展動力和方向及基本規(guī)律的把握能力。認(rèn)知功能包括學(xué)習(xí)、記憶、語言、執(zhí)行、計算和判斷等。研究表明與空間學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能關(guān)系最密切的腦區(qū)是海馬,海馬的齒狀回的顆粒下區(qū)有大量的祖細(xì)胞,這些具有增殖和分化成為成熟神經(jīng)細(xì)胞的潛能,稱為海馬神經(jīng)發(fā)生[12]。新生的神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和功能特征與成熟顆粒細(xì)胞基本相同,他們能與分子層及多形層細(xì)胞形成突觸聯(lián)系,參與到海馬功能的神經(jīng)環(huán)路中,參與海馬的功能活動,而海馬神經(jīng)發(fā)生的減少可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)素家族的主要成員,具有調(diào)節(jié)中樞突觸形成和可塑性,促進(jìn)神經(jīng)元存活,促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)及結(jié)構(gòu)重建和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等作用。BDNF在海馬神經(jīng)發(fā)生及學(xué)習(xí)和記憶過程中發(fā)揮著重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)BDNF基因在與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的表達(dá)增加可增強大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力[14]。情景學(xué)習(xí)的過程是海馬依賴的,可選擇性上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)BDNF的表達(dá)。長時程增強(longterm potentiation,LTP)是學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)基礎(chǔ),敲除BDNF基因可抑制LTP,而補充BDNF可逆轉(zhuǎn)這種作用[15-16]。本研究的結(jié)果顯示游泳訓(xùn)練顯著上調(diào)了大鼠海馬組織中BDNF的表達(dá),顯著增加了NeuN+/BrdU+陽性數(shù)量,這些結(jié)果提示游泳訓(xùn)練可增加BDNF的分泌,促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生。

總之，本實驗結(jié)果闡明游泳訓(xùn)練提高了新生大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其機制可能與游泳訓(xùn)練顯著上調(diào)了大鼠海馬BDNF的表達(dá)促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生有關(guān)。因此對新出生的嬰兒進(jìn)行游泳訓(xùn)練可增強海馬神經(jīng)發(fā)生,提高空間學(xué)習(xí)記憶能力。

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Effectsofswimmingtrainingonthelearningandmemoryandhippocampusneurogenesisinnewbornrats

LIU Pengying,ZHANG Chunhua,CHEN Xin,et al

(People’sHospitalofLouxingDistrict,Loudi417000,Hunan,China)

ObjectiveTo observe effect of swimming training on learning and memory and hippocampus neurogenesis in neonatal rats.Methods7-days-old newborn Sprague-Dawley rats were randomly divided into control and swimming training group.From eleventh days after birth,the rats in swimming group were carried on 3-weeks swimming training with no load once a day,60 min every time.Learning and memory was evaluated by Morris water maze.The number of BrdU+/NeuN+was counted by immunofluorescence double labeling staining.The expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF) was tested by Western blot.ResultsThe latency for finding the hidden platform in control and swimming training group was obviously decreased with the training days increasing (allP<0.05).On the second,third and forth day,the latency for finding the hidden platform in swimming training group was significantly decreased compared with control (allP<0.05).Number across platform and the time across platform was significantly increased in swimming training group compared with control (allP<0.05).Number of NeuN+/BrdU+cells was significantly increased and expression of BDNF was significantly increased in swimming training group compared with control (allP<0.05).ConclusionSwimming training increases capacity of learning and memory in neonatal rats,which mechanism may be related with up-regulation of BDNF expression and increase of neurogenesis in hippocampus of rats.

newborn rats; swimming training; hippocampus; neurogenesis; brain derived neurotrophic factor

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.009

2016-10-31；

2017-01-08

*通訊作者,E-mail:904383407@qq.com.

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秦旭平)