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(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽421001；2. 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

·小專論·

三鄰甲苯基磷酸酯的神經(jīng)毒性研究進(jìn)展

江嵐1,2，龍鼎新2

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽421001；2. 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

三鄰甲苯基磷酸酯(TOCP)是眾多有機(jī)磷酸酯類化合物代表之一，有多器官毒性作用主要表現(xiàn)在對(duì)動(dòng)物生殖毒性、免疫毒性和神經(jīng)毒性。本文主要綜述了TOCP分子理化特性、TOCP神經(jīng)毒性作用的研究，并從骨架蛋白含量改變、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬等方面對(duì)TOCP神經(jīng)毒性作用機(jī)制進(jìn)行了綜述。

三鄰甲苯磷酸酯(TOCP)； 神經(jīng)毒性； 有機(jī)磷酯類化合物誘發(fā)的遲發(fā)性神經(jīng)毒性(OPIDN)

1 TOCP分子理化特性與用途

三鄰甲苯基磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)屬于三甲苯磷酸酯的鄰、對(duì)及間位3種異構(gòu)體中的一種，三鄰甲苯磷酸酯的分子式為C21H21O4P，分子量為368.36。分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下：摩爾折射率為102.14，摩爾體積為306.6 m3/mol，等張比容(90.2 K)為793.2，表面張力為44.7 dyne/cm，極化率(10～24 cm3)為40.49。其分子結(jié)構(gòu)如下(圖1)。

圖1 三鄰甲苯磷酸酯結(jié)構(gòu)式

常溫下，TOCP是無味、微黃透明的液體。不溶于水，能溶于醇、醚、苯等有機(jī)溶劑。由于具有化學(xué)與熱穩(wěn)定性，可用作增塑劑，阻燃劑、軟化劑使用，常用于塑料、橡膠、涂料及合成纖維等工業(yè)，也可作為機(jī)油添加劑與汽油中鉛的凈化劑等[1-2]。因此，TOCP在工業(yè)上及日常生活中TOCP用途極為廣泛。

2 TOCP的神經(jīng)毒性作用

關(guān)于TOCP的神經(jīng)毒性，目前有三種不同的毒性結(jié)局：(1)抑制膽堿酯酶而誘發(fā)急性中毒；(2)短期或長期多次接觸TOCP可以引起神經(jīng)退行性綜合癥；(3)一次或多次接觸TOCP引起的遲發(fā)性神經(jīng)毒性(organophosphoms ester-induced delayed neurotoxieity，簡稱OPIDN)[2]。遲發(fā)性神經(jīng)毒性是TOCP的神經(jīng)毒性中最為常見的癥狀。早在20世紀(jì)30年代，美國有上萬人因飲用污染了TOCP的牙買加姜汁酒發(fā)生癱瘓；隨后南非和摩洛哥、斯里蘭卡和印度等其他國家也出現(xiàn)因食用TOCP污染食用油而導(dǎo)致人群癱瘓的中毒事件[3]。我國自20世紀(jì)90年代初以來，在北京、西安和深圳等地也相繼發(fā)生多起因食用污染TOCP面粉和食用油而導(dǎo)致同類事件[4]。由于TOCP能誘發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)毒素，造成以肢體遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)障礙功能為主的周圍神經(jīng)脫髓鞘病變。該病可持續(xù)數(shù)十年，嚴(yán)重者能導(dǎo)致終生殘疾，危害十分嚴(yán)重，人們對(duì)其的重視度逐漸提高。

3 TOCP神經(jīng)毒性作用機(jī)制

3.1骨架蛋白含量改變TOCP處理后雞大腦組織中神經(jīng)絲含量變化比微管與微絲蛋白大，該變化可能與OPIDN有關(guān)。 研究表明，TOCP處理之后，雞的脊髓神經(jīng)細(xì)胞膜上的[3H]DFP(diisopropy-lfluorophosphate)結(jié)合量降低[5],而各段脊髓神經(jīng)細(xì)胞膜之間[3H]DFP的結(jié)合量變化不大。推測TOCP先結(jié)合脊髓神經(jīng)細(xì)胞膜上的特異性蛋白，由于特異性蛋白和[3H]DFP之間存在競爭，使[3H]DFP的結(jié)合受到抑制。隨著TOCP處理后時(shí)間的增加，結(jié)合受體代謝了TOCP，從而結(jié)合受體的量變小，使[3H]DFP結(jié)合到空余的受體上，使[3H]DFP的結(jié)合量升高。TOCP和DFP都具有遲發(fā)性神經(jīng)毒性，因此，脊髓神經(jīng)細(xì)胞膜上的特異性位置可能與OPIDN相關(guān)。還發(fā)現(xiàn)，TOCP能致受試成年雞細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase5,CDK5)異常磷酸化增強(qiáng)[6]。已知CDK5異常激活及其磷酸化與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，CDK5與其它一些激酶一起共同對(duì)多種細(xì)胞骨架蛋白磷酸化，在神經(jīng)軸突生長過程中調(diào)節(jié)骨架蛋白之間的相互作用[7-8],TOCP處理的實(shí)驗(yàn)雞的中樞及外周神經(jīng)軸突中確實(shí)有磷酸化骨架蛋白的異常聚集。細(xì)胞骨架蛋白磷酸化增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞骨架成分的降解，既而引起順行性軸漿運(yùn)輸加速，最終導(dǎo)致降解后的細(xì)胞骨架成分在軸突末梢部位的聚集[9]。TOCP處理成年雞產(chǎn)生OPIDN，脊髓組織中NFs含量紊亂，預(yù)先用PMSF處理可阻斷OPIDN，并可顯著抑制脊髓NFs含量的紊亂[10]。

研究發(fā)現(xiàn)TOCP中毒可改變雞神經(jīng)組織中的微管相關(guān)蛋白2(microtubulin-associated protein 2,MAP-2)含量，可能與其遲發(fā)性神經(jīng)毒性相關(guān)。MAP-2是成熟神經(jīng)元樹突的主要標(biāo)志之一，已知微管是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的主要成分,在神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)和功能的維持中發(fā)揮重要作用[11]。TOCP處理是否直接損傷培養(yǎng)雞少突膠質(zhì)細(xì)胞，TOCP對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞有直接作用，能使其突起變性損傷，胞體出現(xiàn)空泡樣變；推測少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷可能和OPIDN發(fā)病機(jī)制有關(guān)[12]。

3.2氧化應(yīng)激研究表明，有機(jī)磷化合物能誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激，生成活性氧，發(fā)生抗氧化反應(yīng)[13-14]。TOCP作為一種有機(jī)磷酸酯類化合物，也能造成成年雞神經(jīng)組織出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致氧化應(yīng)激?？寡趸到y(tǒng)失衡、脂質(zhì)過氧化可能為TOCP引起OPIDN的一個(gè)重要機(jī)制。TOCP引起母雞OPIDN中抗氧化系統(tǒng)和凋亡相關(guān)蛋白改變，隨時(shí)間推移TOCP使母雞神經(jīng)組織與血清的脂質(zhì)過氧化物增加，損傷其抗氧化防御系統(tǒng)；TOCP對(duì)坐骨神經(jīng)影響較早、較敏感，坐骨神經(jīng)脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)和抗氧化能力降低與其傳導(dǎo)功能降低顯著相關(guān)。隨著時(shí)間的推移，成年雞中樞神經(jīng)組織中大腦與脊髓中Cyt-c蛋白的表達(dá)增加。體外實(shí)驗(yàn)證明，TOCP對(duì)人成神經(jīng)瘤細(xì)胞SH-SY5Y存在著氧化損傷，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧可以引起蛋白質(zhì)的氧化損傷和錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)的變化。為了防止過多氧化修飾蛋白以及其它受損蛋白在細(xì)胞內(nèi)集聚而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)其保護(hù)機(jī)制—增加或加速異常蛋白的水解。研究表明，蛋白酶解系統(tǒng)在細(xì)胞對(duì)毒物或環(huán)境應(yīng)激的應(yīng)答等方面具有重要作用[15]。研究表明高濃度TOCP能顯著增加泛素化蛋白的集聚，并呈現(xiàn)較明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。提示較高濃度的TOCP可致泛素蛋白酶體途徑的阻斷或抑制。

3.3細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬有研究表明，TOCP誘發(fā)成年母雞遲發(fā)性神經(jīng)毒性過程中出現(xiàn)腰髓前角神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，而且神經(jīng)元凋亡發(fā)生在遲發(fā)性神經(jīng)毒性癥狀出現(xiàn)之前，提示細(xì)胞凋亡可能在遲發(fā)性神經(jīng)病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[16]。Mou DL等[17]發(fā)現(xiàn)TOCP誘發(fā)的OPIDN中母雞的脊髓神經(jīng)元的損傷，電鏡觀察染毒第5天出現(xiàn)神經(jīng)元的凋亡，均提示凋亡可能涉及OPIDN的發(fā)展。一些體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TOCP可明顯影響SH-SY5Y細(xì)胞的存活，并且具有濃度及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，顯示TOCP能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，TOCP處理的SH-SY5Y細(xì)胞在其細(xì)胞周期直方圖上并未出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，另外，凋亡促進(jìn)基因P53在mRNA水平和蛋白水平均未見表達(dá)增強(qiáng)[18]。以上結(jié)果提示TOCP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡并非凋亡，有可能是程序性細(xì)胞死亡的另一種形式—自噬性細(xì)胞死亡。

自噬(autophagy)是近年來新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式，稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。自噬與人類多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，如在帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病中可發(fā)現(xiàn)自噬體的積聚[19]。維持生理水平的自噬對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的健康和功能的發(fā)揮至關(guān)重要；而自噬的紊亂(自噬缺失或過度)則可導(dǎo)致神經(jīng)突起的退行性病變及神經(jīng)細(xì)胞死亡。本文作者發(fā)現(xiàn) TOCP可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞自噬性死亡，并且TOCP處理濃度與自噬發(fā)生呈正相關(guān)，TOCP導(dǎo)致骨架蛋白的降解方式包括自噬。在TOCP誘發(fā)成年雞的OPIDN中，脊髓、坐骨神經(jīng)的自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)呈時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，隨著染毒時(shí)間的延長，OPIDN癥狀越明顯，蛋白表達(dá)增多，說明自噬與OP導(dǎo)致的OPIDN存在密切的聯(lián)系。TOCP染毒造成成年雞脊髓和脛神經(jīng)里面的beclin-1含量明顯降低，但是u-calpain含量增加顯著。經(jīng)過PMSF預(yù)處理在將TOCP造成的OPIDN的同時(shí)，可以顯著抑制TOCP引起的beclin降低和u-calpain含量的升高，推斷TOCP是神經(jīng)元中的自噬調(diào)節(jié)機(jī)制[20]。

4 展 望

隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，TOCP方面的研究也逐漸從形態(tài)表現(xiàn)、生理生化性狀向分子生物學(xué)發(fā)展，其神經(jīng)毒性機(jī)制也日益深化。而關(guān)于其解毒機(jī)制方面的研究卻少見報(bào)道，相信這方面會(huì)成為將來的研究熱點(diǎn)。TOCP神經(jīng)毒性研究屬于一項(xiàng)綜合性的系統(tǒng)課題，涉及醫(yī)藥學(xué)、病理學(xué)、毒理學(xué)、動(dòng)物學(xué)、分子生物學(xué)等諸多學(xué)科，需要多學(xué)科的專家進(jìn)行整合研究，因此，多學(xué)科的交叉融合或許是將來的一個(gè)研究方向。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.05.026

2016-09-17；

2017-07-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81172712)；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11JJ6078)； 湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目(09B087)；南華大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2010XQD19).

*通訊作者，E-mail:dxlong99@163.com.

R136.32

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蔣湘蓮)