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(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽 421001；2.廣州市微米生物科技有限公司)

·技術(shù)與方法·

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2免疫熒光層析法的建立及臨床應(yīng)用

謝海濤1，湯永平2*，解巧麗2，張曉麗2，潘秀華2

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽 421001；2.廣州市微米生物科技有限公司)

目的建立脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2免疫熒光層析定量測(cè)定方法，并對(duì)其進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)。方法

利用雙抗體夾心法，研制脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2時(shí)間分辨免疫熒光層析試紙條，通過檢測(cè)其線性范圍、最低檢測(cè)限、精密度等指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室性能評(píng)估；選取230例臨床血清樣本，同時(shí)使用本方法和美國Diadexus公司的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2試劑進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)估。結(jié)果脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2免疫熒光層析定量測(cè)定試劑線性范圍為20 μg/L～1 000 μg/L，最低檢測(cè)限為10 μg/L，重復(fù)檢測(cè)不同濃度的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2蛋白，批次內(nèi)及批次間變異系數(shù)均小于10%；本試劑與美國的Diadexus公司的試劑檢測(cè)臨床樣本的總符合率為90.87%，Kappa值為0.804，相關(guān)系數(shù)r=0.968，相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論免疫熒光層析法測(cè)定脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2，各項(xiàng)分析指標(biāo)均能達(dá)到臨床要求，且便捷準(zhǔn)確，可用于臨床血清樣本的快速檢測(cè)。

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2； 免疫熒光層析； 動(dòng)脈粥樣硬化

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)是心血管疾病中一種新的炎癥酶，能水解氧化低密度脂蛋白(low density lipoprotein， LDL)，產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，Lyso-PC)和氧化型游離脂肪酸(oxidized free fatty acids，ox-FA)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成和發(fā)展，其與臨床疾病的關(guān)系日益受到關(guān)注。近年來研究認(rèn)為對(duì)Lp-PLA2水平的檢測(cè)可以識(shí)別心腦血管病高危個(gè)體[1]。

Lp-PLA2由PLA2G7基因編碼，又被稱為血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor-AH，PAF-AH)，屬于磷脂酶家族中PLA2的一種，是絲氨酸依賴的磷脂酶，其催化活性不需要Ca2+。迄今為止，已知Lp-PLA2有兩種類型：血漿型Lp-PLA2與細(xì)胞型Lp-PLA2。血漿型Lp-PLA2分子量為45 kDa；細(xì)胞型Lp-PLA2包括：Lp-PLA2II、Lp-PLA2 Ib[2]。人血漿Lp-PLA2主要由成熟的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、肝細(xì)胞等分泌生成，并受炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，如γ干擾素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)促進(jìn)其分泌。Lp-PLA2的主要作用包括：產(chǎn)生二十烷酸類炎性介質(zhì)、參與磷脂重建及生物膜的穩(wěn)定平衡、脂蛋白的代謝、細(xì)胞信號(hào)傳遞、宿主反應(yīng)、促進(jìn)機(jī)體壞死組織自體消失等[3]。

目前實(shí)驗(yàn)研究及流行病學(xué)研究結(jié)果揭示了Lp-PLA2能生成的多種促炎產(chǎn)物，并參與從動(dòng)脈粥樣斑塊形成到斑塊不穩(wěn)定的各個(gè)階段，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用，成為新的心腦事件獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。所以，建立靈敏便捷的Lp-PLA2檢測(cè)方法對(duì)冠心病的早期診斷預(yù)后有重要意義[4]。目前國內(nèi)各大醫(yī)院多使用進(jìn)口試劑盒如美國Diadexus公司的Lp-PLA2產(chǎn)品進(jìn)行Lp-PLA2檢測(cè)，操作繁瑣、測(cè)定時(shí)間長，本文擬采用時(shí)間分辨免疫熒光層析技術(shù)建立快速檢測(cè)Lp-PLA2試劑盒。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源230例臨床血清由南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2材料與試劑Lp-PLA2單克隆抗體1#和2#，Lp-PLA2蛋白均購于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司；羊抗鼠IgG、吸水墊、硝酸纖維素膜(NC膜)、PVC板、聚酯纖維素膜等購于上海杰一生物有限公司；熒光微球購自德國默克公司；比對(duì)試劑購自美國Diadexus公司(酶聯(lián)免疫法)。

1.3儀器與設(shè)備HM3030三維平面點(diǎn)膜噴金儀購于上海金標(biāo)生物科技有限公司；C6M切條機(jī)購于上海韓感電子科技有限公司；免疫熒光檢測(cè)儀購于廣州藍(lán)勃生物科技有限公司。

1.4 Lp-PLA2免疫熒光層析試劑的制備試紙條由卡殼、PVC底板、吸收墊、硝酸纖維素膜(CN95)、結(jié)合墊、樣品墊構(gòu)成。用劃膜儀將羊抗鼠IgG(0.5 g/L)和Lp-PLA2的單克隆抗體2#(1g/L)分別包被在硝酸纖維素膜上，作為質(zhì)控線和檢測(cè)線，于35 ℃恒溫箱中干燥8 h，即為反應(yīng)膜；將Lp-PLA2單克隆抗體1#按碳化二亞胺法偶聯(lián)到納米熒光微球上，抗體與微球的比例為1∶3，用點(diǎn)膜噴金儀噴于聚酯纖維素膜上，于35 ℃恒溫箱中干燥8 h，即為結(jié)合墊；將聚酯纖維素膜浸泡在含有20 g/L海藻糖、5 g/L BSA的0.2 mol/L硼酸—硼砂緩沖液(pH=8.0)中，待液體擴(kuò)散均勻后，取出放置于架子上室溫晾干，即為樣品墊。組裝與檢測(cè)原理如圖1所示。

圖1 Lp-PLA2免疫熒光層析試劑原理

1.5試劑性能分析

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用0.01 mol/L PBS (pH7.4)配制0、20、100、200、500、1 000 μg/L的Lp-PLA2蛋白溶液，取樣75 μL滴至測(cè)試卡孔中，10 min后放置于熒光檢測(cè)儀測(cè)試，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)試3次。采用雙對(duì)數(shù)擬合模型，以Lp-PLA2蛋白濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度的檢測(cè)線與質(zhì)控線熒光信號(hào)比值(T/C)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制劑量—反應(yīng)曲線。

1.5.3 精密度 取三個(gè)批次的Lp-PLA2試劑，分別檢測(cè)40、200、600 μg/L的Lp-PLA2蛋白，每批次重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算測(cè)試濃度的變異系數(shù)(coefficient variation，CV)，并將三批次的檢測(cè)結(jié)果分析，計(jì)算批次間的變異系數(shù)。

1.5.4 準(zhǔn)確度 用20、100、200、500、1 000 μg/L的Lp-PLA2蛋白重復(fù)測(cè)定3次，按擬合的方程計(jì)算出相應(yīng)的濃度，計(jì)算與標(biāo)示濃度的相對(duì)偏差。

1.5.5 干擾實(shí)驗(yàn) 為考察血液中常見干擾物對(duì)試劑的影響，在不同濃度的血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素中分別加入Lp-PLA2蛋白，使Lp-PLA2終濃度為40 μg/L、200 μg/L、600 μg/L，重復(fù)測(cè)試3次，并計(jì)算其相對(duì)偏差的平均值，觀察檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差的變異系數(shù)是否在10%以內(nèi)，而判定干擾物對(duì)樣本測(cè)試是否有干擾。

1.5.6 臨床應(yīng)用對(duì)比 本方法與美國Diadexus公司Lp-PLA2試劑同步測(cè)試230例臨床樣本，繪制四格表，以Diadexus試劑測(cè)試結(jié)果為參照，分析本方法的符合率，并進(jìn)行卡方試驗(yàn)及相關(guān)性評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1建立Lp-PLA2標(biāo)準(zhǔn)曲線配制20、100、200、500、1 000μg/L的Lp-PLA2蛋白進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3次測(cè)試，將熒光檢測(cè)儀檢測(cè)的信號(hào)值T/C與測(cè)試樣品的濃度進(jìn)行雙對(duì)數(shù)擬合，T/C值對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，樣品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，雙對(duì)數(shù)擬合方程為Y= 0.9908X- 1.4772，R2= 0.9993。結(jié)果表明二者線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線可以很好的反映熒光信號(hào)值與樣品濃度的關(guān)系，即熒光信號(hào)值越高，樣品濃度越高。本試劑最低檢測(cè)限為10 μg/L，方法學(xué)的線性范圍為20～1 000 μg/L。見圖2。

圖2 Lp-PLA2雙對(duì)數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線注：T/C為檢測(cè)線與質(zhì)控線熒光信號(hào)比值

2.3精密度從表1可知，用40、200、600 μg/L的Lp-PLA2蛋白，每批次重復(fù)檢測(cè)10次，本試劑的批次內(nèi)CV<10%，批次間CV<10%，結(jié)果表明試劑精密度較好。

表1 批次內(nèi)與批次間精密度分析

注：40、200、600 μg/L的Lp-PLA2蛋白，每批次重復(fù)檢測(cè)10次，求均值

2.4準(zhǔn)確度用20、100、200、500、1 000 μg/L的Lp-PLA2蛋白，每批次重復(fù)測(cè)定3次，從表2可知，本試劑在檢測(cè)20～1 000 μg/L范圍內(nèi)的Lp-PLA2的相對(duì)偏差均小于±15%，結(jié)果表明試劑的準(zhǔn)確度較好。

2.5干擾實(shí)驗(yàn)從圖3、圖4、圖5可知當(dāng)血紅蛋白濃度低于5 g/L，甘油三酯濃度低于10 g/L時(shí)，膽紅素濃度低于0.2 g/L，對(duì)低(40 μg/L)、中(200 μg/L)、高(600 μg/L)濃度的Lp-PLA2蛋白重復(fù)測(cè)試3次，檢測(cè)結(jié)果CV在10%以內(nèi)，具有良好的精密度，此時(shí)干擾物對(duì)樣本測(cè)試無干擾。

2.6本試劑與比對(duì)試劑的臨床符合率用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)考核數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從本試劑與比對(duì)試劑的對(duì)比結(jié)果(表3)可知兩者總符合率為90.87%，陽性符合率為79.34%，陰性符合率為98.55%，調(diào)整一致性90.74%。本試劑與比對(duì)試劑陰陽性一致性檢驗(yàn)結(jié)果Kappa值為0.804(表4)，兩者一致性較好。

表2 批次內(nèi)與批次間準(zhǔn)確度分析

注：每批次試劑測(cè)試20、100、200、500、1 000 μg/L的Lp-PLA2蛋白，每個(gè)濃度測(cè)試3次，求均值

圖3 血紅蛋白干擾實(shí)驗(yàn)

圖4 甘油三脂干擾實(shí)驗(yàn)

圖5 膽紅素干擾實(shí)驗(yàn)

2.7本試劑與比對(duì)試劑檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析將兩種試劑檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示研制的Lp-PLA2免疫熒光定量測(cè)定試劑與美國Diadexus公司的Lp-PLA2定量試劑盒(酶聯(lián)免疫法)測(cè)值之間有良好的線性回歸關(guān)系，回歸方程為Y= 1.205X-15.550(n=230)，相關(guān)系數(shù)r=0.968；P值小于0.01，相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5，圖6)，兩者結(jié)果一致性較好。

表3 本試劑與美國Diadexus試劑比對(duì)結(jié)果分析(例)

表4 臨床樣本比對(duì)測(cè)試Kappa值(n=230)

a：不假定零假設(shè)；b：使用漸進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)誤差假定零假設(shè)

表5 臨床樣本檢測(cè)值相關(guān)系數(shù)(n=230)

**，在0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

圖6 本試劑與PLAC試劑相關(guān)性分析

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)。斑塊形成，斑塊由穩(wěn)定變成不穩(wěn)定，不穩(wěn)定斑塊容易破裂，引起凝血反應(yīng)，致使血小板凝聚，血栓形成，這是造成冠心病的主要原因[5-6]。Lp-PLA2水平與心腦血管疾病呈顯著正相關(guān)，是血管炎癥的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，因此對(duì)心腦血管栓塞性疾病的預(yù)測(cè)、治療和預(yù)后的判斷具有重要意義[7-9]。

本試劑采用時(shí)間分辨免疫熒光層析技術(shù)(time-resolved fluorescent immune-chromatographic assay，TRFICA) ，以三價(jià)鑭系元素及其螯合物標(biāo)記抗體分子，層析待反應(yīng)體系發(fā)生后，用時(shí)間分辨法檢測(cè)信號(hào)。Eu3+螯合物的發(fā)光特點(diǎn)：stokes位移大，激發(fā)光譜與發(fā)射光譜不重疊，可減少由激發(fā)光引起的特異雜散光對(duì)檢測(cè)的干擾，提高檢測(cè)的靈敏度與準(zhǔn)確度；熒光壽命長，檢測(cè)中在每個(gè)激發(fā)光脈沖過后采用延緩測(cè)量時(shí)間的方式，待短壽命背景熒光物質(zhì)消失后，再檢測(cè)長壽命Eu3+鰲合物發(fā)射的特異性熒光，可以避免本底熒光對(duì)待測(cè)物的干擾，提高檢測(cè)精密度；時(shí)間分辨熒光激發(fā)波長較寬，發(fā)射光譜范圍較窄，極大地降低了本底熒光，實(shí)現(xiàn)了高信噪比[10-14]。

與比對(duì)試劑相比，本方法具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)最低檢出限和精密度與進(jìn)口試劑相當(dāng)；(2)操作過程簡單，測(cè)定時(shí)間短，10 min即可得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不需要昂貴的儀器設(shè)備，測(cè)試結(jié)果基本不受環(huán)境因素干擾，適合臨床應(yīng)用；(3)既可以用于大規(guī)模臨床樣本測(cè)試，又可單人份檢測(cè)，減少患者等待時(shí)間。

本方法試劑靈敏度為10 μg/L，線性范圍為20 μg/L～1 000 μg/L，精密度良好(批次內(nèi)與批次間CV均小于10%)，測(cè)試濃度與Lp-PLA2校準(zhǔn)品相對(duì)偏差小于±15%，當(dāng)血紅蛋白濃度低于5 g/L、甘油三酯濃度低于10 g/L時(shí)、膽紅素濃度低于0.2 g/L，檢測(cè)結(jié)果CV在10%以內(nèi)，精密度較好，此時(shí)干擾物對(duì)樣本測(cè)試無干擾；與酶聯(lián)免疫法相比，兩種方法相關(guān)性良好(r=0.968)。

綜上所述，本法建立的Lp-PLA2免疫熒光層析試劑性能達(dá)到了相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，具有靈敏度高、特異性好、定量檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡單、快速診斷、配套儀器小巧智能、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，既能滿足大型醫(yī)院門診科室隨來隨檢的診療需求，又適合在社區(qū)農(nóng)村基層醫(yī)院中進(jìn)行推廣使用。

[1] Maiolino G,Bisogni V,Rossitto G,et al.Lipoprotein-associated phospholipase A2 prognostic role in atherosclerotic complications[J].World Cardiol,2015,7(10):609-620.

[2] Reddy KJ,Singh M,Bangit JR,et al.The role of lipoprotein-associated phospholipase A2 on cardiovascular disease risk assessment and plaque rupture:a clinical review[J].J Clin Lipidol,2009,3(2):85-93.

[3] 胡大一.脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2臨床應(yīng)用專家建議[J].中華心血管病雜志，2015,43(10):843-847.

[4] 黃美容.LP-PLA2的原核表達(dá)、抗體制備及表位分析[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué),2011：1-64.

[5] 劉俊田.動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的炎癥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015,36(2):141-152.

[6] 吳宜娟，王麗娟，張雄.血小板活化因子乙酰水解酶臨床治療研究進(jìn)展[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011,11(9):1097-1098.

[7] Dallmeier D,Koenig W.Strategies for vascular disease prevention:the role of lipids and related markers including apolipoproteins,low-density lipoproteins (LDL)-particle size,high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP),lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) and lipoprotein(a) (Lp(a))[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab,2014,28(3):281-294.

[8] 田鳳.脂蛋白a、ApoB/ApoA與冠狀動(dòng)脈病變的相關(guān)性研究[D].新疆：石河子大學(xué),2014：1-27.

[9] Gerber Y,Dunlay S M,Jaffe A S,et al.Plasma lipoprotein-associated phospholipase A2 levels in heart failure:Association with mortality in the community[J].Atherosclerosis,2009,203(2):593-598.

[10] 朱嵐，周衍，黃飚，等.鐵蛋白時(shí)間分辨熒光免疫層析法的建立及臨床應(yīng)用[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2016,36(1):50-53.

[11] 郭明明，周衍，周劍波，等.熒光微球時(shí)間分辨免疫層析技術(shù)定量檢測(cè)甲胎蛋白的研究[J].免疫學(xué)雜志，2015,31(10):897-901.

[12] 劉鑫.熒光免疫層析分析儀的設(shè)計(jì)分析[J].生命科學(xué)儀器，2015,13(3):23-26.

[13] 李陽，王云龍.免疫層析技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015,25(22):3978-3980.

[14] 張兆威，李培武，張奇，等.農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的時(shí)間分辨熒光免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014,47(18):3668-3674.

Theestablishmentandclinicalapplicationofimmunofluorescencechromatographyassayforlipoprotein-associatedphospholipaseA2

XIE Haitao,TANG Yongping,XIE Qiaoli,et al

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo explore the quality of a reagent for quantitative immunofluorescence chromatography assay and evaluate the clinical value for diagnosis of lipoprotein-associated phospholipase A2.MethodsBased on the technology of double-antibody sandwich method,the lipoprotein-associated phospholipase A2 immunofluorescence chromatography strip was established.The performance of kit was evaluated by the range of linearity,sensitivity,accuracy and precision.The kit for Lipoprotein-Associated Phospholipase A2 was compared with Diadexus PLAC Test ELISA Kit made in USA by the parallel experiment in 230 serum specimens.The clinical application were evaluated.ResultsThe minimum limit of detection was 10μg/L.The linear range of lipoprotein-associated phospholipase A2 kit was 20～1 000μg/L．The coefficient of variation values for low,median and high concentration calibrators respectively were all less than 10%．The total coincidence rate of lipoprotein-associated phospholipase A2 kit and PLAC Test ELISA Kit was 90.87%，Kappa was 0.804,r=0.968.The date showed there was no significant difference between the results of two kits.ConclusionsThe immunofluorescence chromatography method targeted at the lipoprotein-associated phospholipase A2 protein was convenient,rapid and sensitive.It is an excellent technique and readily applicable for clinical use.

lipoprotein-associated phospholipase A2; immunofluorescence chromatography; atherosclerosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.05.025

2016-10-17；

2017-02-27

2015年科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金(合同編號(hào)：201501010052).

*通訊作者，E-mail：346853531@qq.com.

R446.11

A

蔣湘蓮)