王文斌，劉 兵，王天陽，呂海濤，劉學(xué)青

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤科，河北 石家莊 050051)

·論著·

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3、細胞周期素D1在膽管癌組織中的表達及意義

王文斌1，劉 兵2，王天陽1，呂海濤1，劉學(xué)青1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤科，河北 石家莊 050051)

目的檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、細胞周期素D1(Cyclin D1)在膽管癌組織中的表達并分析其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測STAT3、Cyclin D1在70例膽管癌組織和15例非腫瘤膽道上皮組織中的表達情況。結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示70例膽管癌組織和15例非腫瘤膽道上皮組織中STAT3、Cyclin D1陽性表達率分別為61.4%、33.3%和42.9%、13.3%。STAT3、Cyclin D1蛋白在膽管癌組織中的表達均明顯高于非腫瘤膽道上皮組織(P<0.05)。STAT3蛋白表達與膽管癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級明顯相關(guān)(P<0.05)；膽管癌組織中Cyclin D1蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級明顯相關(guān)(P<0.05)。STAT3與Cyclin D1表達呈明顯正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。STAT3、Cyclin D1蛋白共陰性表達組生存時間明顯長于共陽性表達組(P<0.01)。結(jié)論STAT3、Cyclin D1可能是反映膽管癌發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)指標(biāo)。

膽管腫瘤;轉(zhuǎn)錄激活因子3；細胞周期素D1

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.009

膽管癌是一種相對較少見的腫瘤，占肝膽系統(tǒng)腫瘤的10%～15%，人類腫瘤的2%～3%[1-2]，但發(fā)生率逐年升高[3]。根據(jù)起源部位不同分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌，肝外膽管癌又分為肝門膽管癌和遠端膽管癌。由于發(fā)病隱匿，具有浸潤生長和淋巴、神經(jīng)轉(zhuǎn)移等特點，綜合治療效果不理想[4]，5年生存率20%～40%[5]。故研究膽管癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特點和機制，對于膽管癌的治療有著重要指導(dǎo)意義。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)位于細胞質(zhì)中，當(dāng)被上游相關(guān)信號激活后，其磷酸化形成二聚體或與STAT3的其他成員形成異質(zhì)二聚體。激活的STAT3復(fù)活物移位到細胞核中作用于STAT3目的基因，促進細胞周期素D1(Cyclin D1)等的表達，進而引起組織細胞的癌變、增殖和侵犯。已有研究顯示STAT3在多種實體腫瘤中均起到促癌作用[6-7]。Cyclin D1是STAT3的下游基因，其高表達可促進細胞大量增殖，進而引起癌變，與食管癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測STAT3、Cyclin D1在膽管癌中的表達并探討其臨床意義，旨在為膽管癌的診斷和治療提供一個新的靶點。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2009年3月—2014年4月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院手術(shù)切除經(jīng)病理證實的膽管癌標(biāo)本70例(腺癌62例，黏液腺癌3例，乳頭狀腺癌3例，鱗癌1例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例)，男性50例，女性20例，年齡35～82歲，平均(59.0±9.7)歲。其中，高分化31例，中分化18例，低分化21例。按照美國癌癥學(xué)會肝外膽管癌TNM分期(2006版)：Ⅰ期25例，Ⅱ期30例，Ⅲ期12例，Ⅳ期3例；Ⅰ+Ⅱ期為早期，Ⅲ+Ⅳ為進展期。所有患者術(shù)前未經(jīng)放化療。選擇15例非腫瘤膽管上皮組織作為對照組，男性9例，女性6例，年齡32～61歲，平均(46.7±9.1)歲。

1.2試劑 鼠抗人STAT3單克隆抗體為英國Abcam公司產(chǎn)品，鼠抗人Cyclin D1單克隆抗體為美國Zymed公司產(chǎn)品，ElivisionTM plus檢測試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.3方法

1.3.1檢測方法 采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-過氧化物酶法檢測標(biāo)本中STAT3和Cyclin D1蛋白的表達。蠟塊經(jīng)4 μm厚度連續(xù)切片后，置烤箱75 ℃烤片過夜；切片脫蠟至水：石蠟切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，95%、85%、75%酒精各5 min，自來水沖洗。用0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次?？乖迯?fù)：放入枸櫞酸鹽緩沖液中(修復(fù)盒)加熱，保持92～98 ℃，15 min，室溫下自然冷卻。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。除去PBS，滴加一抗(STAT3稀釋濃度為1∶200，Cyclin D1稀釋濃度為1∶200)，濕盒內(nèi)4 ℃冰箱內(nèi)過夜。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗5 min×3次。除去PBS液，滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。除去PBS液，滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。除去PBS液，滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片劑封片。染色過程中以結(jié)腸癌組織切片作為陽性對照，陰性對照以PBS替代一抗。

1.3.2結(jié)果判定 STAT3陽性細胞為胞漿或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的著色顆粒，Cyclin D1陽性染色位于胞核，為黃色、深棕黃色顆粒，從陽性腫瘤細胞百分?jǐn)?shù)和染色深淺兩個方面評分。按陽性區(qū)域染色強度評分，無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；按陽性細胞所占比例評分，無陽性細胞計0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩分值相乘，0～3分為陰性，>3分為陽性。

1.4隨訪 通過電話、信訪、門診檢查的方式隨訪，隨訪率為100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析；用Kaplan-Meier生存曲線法計算患者生存率并行l(wèi)og-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1STAT3、Cyclin D1在膽管癌組織中的表達 STAT3主要表達于膽管癌細胞的胞漿和胞核，以胞漿為主，呈棕黃色顆粒。70例膽管癌組織中43例(61.4%)STAT3蛋白表達陽性，15例非腫瘤膽道上皮組織中6例(33.3%)STAT3蛋白表達陽性。STAT3蛋白在膽管癌組織中的表達高于非腫瘤膽道上皮組織中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.967，P=0.046)。Cyclin D1陽性染色位于細胞核內(nèi)，為黃色、棕黃色顆粒。在部分正常膽管組織和膽管癌細胞中，細胞漿也呈淡棕黃色著色。70例膽管癌組織中30例(42.9%)Cyclin D1蛋白表達陽性，15例非腫瘤膽道上皮組織中2例(13.3%)Cyclin D1蛋白陽性表達。Cyclin D1蛋白在膽管癌組織中的表達高于非腫瘤膽道上皮組織中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.587，P=0.032)。見圖1，圖2。

2.2STAT3、Cyclin D1表達與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系 STAT3表達與膽管癌臨床進展相關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期STAT3蛋白表達明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，中低分化組STAT3蛋白表達明顯高于高分化組(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組STAT3蛋白表達明顯高于高分化組(P<0.05)；年齡、性別、腫瘤大小間STAT3蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Cyclin D1表達與膽管癌組織學(xué)分級密切相關(guān)，中低分化組Cyclin蛋白表達明顯高于高分化組(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Cyclin D1蛋白表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期間Cyclin D1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1STAT3在膽管癌組織中的表達(免疫組織化學(xué)染色×20)

Figure1ExpressionofSTAT3incholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×20)

圖2CyclinD1在膽管癌組織中的表達(免疫組織化學(xué)染色×20)

Figure2ExpressionofCyclinD1incholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×20)

表1 膽管癌組織中STAT3、Cyclin D1蛋白表達與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between expression of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma and clinical pathological factors (例數(shù)，%)

2.3STAT3與Cyclin D1蛋白相關(guān)分析及對膽管癌患者預(yù)后的影響 在STAT3蛋白陽性表達43例中Cyclin D1蛋白表達陽性23例，而STAT3蛋白陰性表達27例中Cyclin D1蛋白表達陰性20例，STAT3與Cyclin D1蛋白在膽管癌組織中的表達呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.271，P=0.023)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，STAT3與Cyclin D1共同陽性表達組中位生存時間為13個月，共同陰性表達組中位生存時間為47個月。STAT3與Cyclin D1共同陰性表達組生存時間明顯長于共同陽性表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.560，P=0.000)，見表2，圖3。

表2 膽管癌組織中STAT3與Cyclin D1表達的相關(guān)性Table 2 Correlation between expression of STAT3 andCyclin D1 in cholangiocarcinoma tissues (例數(shù))

圖370例膽管癌生存曲線

Figure3Theoverallsurvivalcurveof70casesofpatientswithcholangiocarcinoma

3 討 論

膽管癌的發(fā)生是一個多因素、多基因改變相互作用的復(fù)雜過程，膽管癌的預(yù)后因而也受到各種因素的影響．目前在對腫瘤的具體發(fā)生機制不甚明了的情況下，對腫瘤的治療仍以手術(shù)為主，輔以放療、化療及其他治療，但是效果仍然很差。因此，尋找能有效反映膽管癌惡性生物學(xué)行為，判斷患者預(yù)后的指標(biāo)就顯得很重要。

STAT3是一類結(jié)構(gòu)保守的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，除了具有STAT 家族成員共同的結(jié)構(gòu)之外，還含有N端氨基酸保守序列、與蛋白相互作用的螺旋區(qū)域、DNA結(jié)合域、SH2結(jié)構(gòu)域、保守的Tyr705以及位于C端的編碼轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域。作為多種細胞因子及生長因子下游重要的信號轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與細胞的生長、增殖、分化過程，維持機體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，調(diào)控免疫功能。STAT3目前被公認(rèn)為癌基因之一，是腫瘤研究的熱點。在正常細胞中，其活性是瞬間的，當(dāng)在某些外在刺激或內(nèi)在因素的作用下[10]，STAT3持續(xù)性活化，并且持續(xù)位于細胞核中，恒定地調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄，如抗凋亡基因MCL-1、誘導(dǎo)細胞凋亡基因Bak、細胞周期調(diào)控基因Cyclin D1以及血管內(nèi)皮生長因子、生存素等，促使細胞惡性增殖，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的產(chǎn)生[11-12]。

Cyclin D1是細胞周期素家族成員之一，Cyclin D1基因位于第11號染色體短臂上，長約15 kd，含5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼由295個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為34 000的蛋白質(zhì)。Cyclin D1與依賴周期素的激酶和激酶抑制因子是細胞生長發(fā)育過程中細胞周期調(diào)控的主要因子。Cyclin D1在正常細胞中的功能是促進細胞周期從G1期進入S期，啟動DNA的合成，參與細胞的增生、分化和凋亡，當(dāng)其表達過量時，可使細胞持續(xù)增殖，若失控則導(dǎo)致多種腫瘤的形成，故也被視為一種癌基因[13-14]。國內(nèi)學(xué)者證實通過轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)Cyclin D1過表達促進了宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。

STAT3通過激活相關(guān)的靶基因，能夠引起細胞癌變的關(guān)鍵性基因產(chǎn)物的過度表達，Cyclin D1為其重要靶基因之一。STAT3可能通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶/細胞周期素復(fù)合物與細胞周期依賴性激酶抑制因子成員之間的平衡，縮短細胞周期中G1至S這一時相，進而調(diào)節(jié)惡性腫瘤細胞異常增殖，介導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化。有學(xué)者報道STAT3、Cyclin D1可能促進了惡性黑色素瘤的發(fā)生、浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移，兩者具有協(xié)同作用[16]。Li等[17]報道食管鱗癌STAT3、Cyclin D1陽性表達患者的預(yù)后差。表明兩者在腫瘤預(yù)后判斷方面存在一定價值。

目前STAT3、Cyclin D1在膽管癌中的共表達情況以及預(yù)后的相關(guān)性未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3、Cyclin D1在膽管癌組織中的表達較非腫瘤膽管組織中的表達明顯升高。STAT3蛋白表達與膽管癌的臨床進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及組織學(xué)分級密切相關(guān)，臨床進展期(Ⅲ+Ⅳ期)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及中低分化膽管癌患者的STAT3陽性表達率明顯高于臨床早期(Ⅰ+Ⅱ期)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高分化患者；而Cyclin D1蛋白表達與膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及組織學(xué)分級密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及中低分化膽管癌患者的Cyclin D1陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高分化患者。說明STAT3、Cyclin D1可能參與了膽管癌的發(fā)生、增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移。STAT3與 Cyclin D1的表達呈高度一致性，呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，表明STAT3可通過調(diào)控Cyclin D1促使細胞周期的運轉(zhuǎn)，從而參與膽管癌發(fā)生發(fā)展，并促進膽管癌的浸潤轉(zhuǎn)移。生存分析顯示兩者共同陽性表達患者的預(yù)后明顯差于陰性表達患者，表明兩者在膽管癌預(yù)后分析方面具有重要的參考價值，可作為膽管癌患者預(yù)后評估的有效指標(biāo)。

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TheexpressionandclinicalsignificanceofSTAT3andCyclinD1incholangiocarcinoma

WANG Wen-bin1, LIU Bing2, WANG Tian-yang1, LYU Hai-tao1, LIU Xue-qing1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China； 2.DepartmentofOncology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of signal transducer and activator of transcription 3(STAT3 ) and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma tissues.MethodsImmunohistochemical staining was used to detect the expression of STAT3 and Cyclin D1 in 70 cases of cholangiocarcinoma and 15 cases of non-tumor bile duct epithelium.ResultsThe expression of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma(61.4%, 42.9%) was significantly higher than that in non-tumor bile duct epithelium(33.3%, 13.3%)(P<0.05). STAT3 expression significantly correlated with clinical stage, lymph nodes metastasis and tumor grade. The positive rates of STAT3 was significantly higher in the stage Ⅲ+Ⅳ group , lymph nodes metastasis group and moderately or poorly-differentiated group than those in stageⅠ+Ⅱ group, no lymph nodes metastasis group and well-differentiated group(P<0.05). Cyclin D1 expression was significantly correlated with lymph nodes metastasis and tumor grade. The positive rates of Cyclin D1 was significantly higher in the lymph nodes metastasis group and moderately or poorly-differentiated than those in no lymph nodes metastasis group and well-differentiated. A significant correlation was found between the expressions of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma(P<0.05). The survival time of negative expression of STAT3 and Cyclin D1 group was longer than that of positive expression of STAT3 and Cyclin D1 group(P<0.01).ConclusionSTAT3 and Cyclin D1 may be important biomarkers in carcinogenesis and progression of cholangiocarcinoma.

bile duct neoplasms; activating transcription factor 3； Cyclin D1

2017-05-05；

2017-06-02

王文斌(1973-)，男，河北保定人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事肝膽外科疾病診治研究。

R735.8

A

1007-3205(2017)12-1397-05

劉斯靜)