吳 瑛，張 勇，姚合斌

高脂聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素建立實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型

吳 瑛，張 勇，姚合斌

目的探討建立具有胰島素抵抗、近似人2型糖尿病特征的SD大鼠模型。方法將36只SD大鼠隨機(jī)分為A組(對照組即普通飼料組)6只、B組(高脂飼料組)6只、C組[普通飼料＋小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)組]12只、D組(高脂飼料＋小劑量STZ組)12只共4組。C組、D組大鼠分別在普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)4周后使用小劑量STZ(30 mg/kg)腹腔注射5 d。隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L且持續(xù)2周為建模成功。結(jié)果C組、D組能建立2型糖尿病SD大鼠模型，成模率分別為66.7%(8/12)、91.7%(11/12)。結(jié)論高脂飼料＋小劑量STZ發(fā)病過程接近自然，成模率更高，模型穩(wěn)定，是值得推廣的2型糖尿病動物模型。

2型糖尿??；血糖；高脂；鏈脲佐菌素；模型，大鼠

糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其慢性并發(fā)癥已成為嚴(yán)重影響人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題之一。預(yù)計(jì)到2035年，全球?qū)⒂薪?.92億人患DM[1]，其中2型DM(type 2 DM，T2DM)占90%以上。目前DM的病因及發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，因此建立可靠的動物模型，對T2DM發(fā)病機(jī)制的研究、治療和預(yù)防至關(guān)重要。目前復(fù)制T2DM動物模型的方法有很多種，如膳食誘導(dǎo)、藥物誘導(dǎo)、基因敲除、自發(fā)性模型等[2]，但存在建模時間長、胰島損傷重、經(jīng)費(fèi)高、不能完全模擬人類T2DM的發(fā)生過程等諸多問題。本研究用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)加高脂飼料誘導(dǎo)建立T2DM大鼠模型，以篩選出更適合建立此模型的STZ劑量和飼料配方，為優(yōu)化方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠36只，無特定病原體級，體重150～180 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心[SCXK-(渝)-2016-0004]提供。

1.1.2 飼料 普通飼料由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。普通飼料含碳水化合物53%、脂肪25%、蛋白質(zhì)22%；高脂飼料為普通飼料添加10%豬油、1%膽固醇混合加工而成，其中含碳水化合物39%、脂肪42%、蛋白質(zhì)19%。

2 結(jié)果

2.1 成模 C組成模率為66.7%(8/12)、D組成模率為91.7%(11/12)。建模后，T2DM大鼠較正常大鼠逐漸出現(xiàn)進(jìn)食與水量增多、排尿增多、體重下降、精神委靡、毛色枯黃、形體消瘦等特征。

2.2 體重 建模前各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；建模后的C組、D組體重明顯低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為3.257、4.804，P分別為0.009、0.001)，且D組體重下降明顯。見表1。

2.3 隨機(jī)血糖 建模前，各組隨機(jī)血糖值均在正常范圍(4～6 mmol/L)。建模后，A組、B組隨機(jī)血糖值仍維持在正常水平，C組8只、D組11只隨機(jī)血糖值維持在16.7 mmol/L以上且持續(xù)2周。C組、D組在建模后隨機(jī)血糖值高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為14.290、21.244，P均為0.000)。見表1。

2.4 空腹血糖和胰島素水平 建模后C組、D組空腹血糖高于A組(t分別為16.023、14.290，P均為0.000)，B組空腹胰島素高于A組(t＝2.999、P＝0.013)。見表1。

表1 建模前后大鼠體重、隨機(jī)血糖、空腹血糖、空腹胰島素(±s)

表1 建模前后大鼠體重、隨機(jī)血糖、空腹血糖、空腹胰島素(±s)

注:與A組比較，?P＜0.01，☆P＜0.05

組別建模前體重(g)隨機(jī)血糖(mmol/L)空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mU/L)建模后體重(g)隨機(jī)血糖(mmol/L)空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mU/L)A組(n＝6)261.86±30.524.99±0.224.98±0.659.85±4.37342.67±57.775.36±2.525.10±0.1612.32±1.66 B組(n＝6)295.71±75.255.03±0.315.33±0.5811.73±4.16361.90±25.017.42±3.235.27±0.2115.23±3.78☆C組(n＝12)259.22±41.064.63±0.514.92±0.4110.64±5.32301.30±40.63?19.30±2.65?18.15±2.23?10.93±4.21 D組(n＝12)290.62±56.004.18±0.545.37±0.8011.85±5.24283.80±33.66?32.30±3.98?26.27±2.65?13.12±2.11

3 討論

理想的DM動物模型應(yīng)該具有相似的發(fā)病誘因、發(fā)病過程和臨床特征，高血糖動物模型是否能在一定程度上代表臨床T2DM的病理特征，是評判動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒Φ年P(guān)鍵。本研究將高脂飲食與STZ干預(yù)相結(jié)合，采用成年SD大鼠高脂喂養(yǎng)1個月后，產(chǎn)生胰島素抵抗，再給予小劑量STZ腹腔注射成功誘導(dǎo)出病理、生理改變接近于人類的T2DM模型。

3.1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇 目前國內(nèi)外對DM動物模型的研究很多，常根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的動物，國內(nèi)臨床研究采用最多的是SD、Wistar大鼠。由于大鼠在建模過程中會出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體重明顯減輕等DM癥狀，SD大鼠與Wistar大鼠相比病死率低，抵抗力更強(qiáng)[3]，且少見自發(fā)緩解現(xiàn)象[4-5]，因此本實(shí)驗(yàn)選用了無特定病原體級的成年SD大鼠作為研究對象。

3.2 方法的選擇 由于單純高脂飼料喂養(yǎng)周期長，飼料成本較高，因此許多研究都選擇藥物聯(lián)合誘導(dǎo)的方法；然而藥物誘導(dǎo)DM模型也因藥物選擇、給藥方式、給藥劑量的不同，其成模效果也不同。給動物大劑量注射四氧嘧啶或STZ后破壞胰島細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌障礙，比較符合1型DM特征；多次小劑量注射STZ、高脂飲食＋小劑量STZ聯(lián)合使用誘發(fā)DM模型比較符合T2DM特征[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采取高脂飲食＋小劑量STZ腹腔注射，對組織毒性小，動物存活率高，且更好地模擬了人類DM的發(fā)生過程；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，高脂飲食可使大鼠體重明顯增加，形成胰島素抵抗，再給予小劑量STZ血糖明顯升高且保持穩(wěn)定水平，成模率較高。在注射部位選擇上本實(shí)驗(yàn)采取腹腔注射，方法易于掌握，避免了靜脈注射中因用藥過量和速度過快導(dǎo)致心力衰竭[8]，注射部位固定也可保證成模后血糖數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性[9]。

3.3 注射劑量的確定 關(guān)于STZ的用量，很多研究報道不一，小劑量一般在25～40 mg/kg、大劑量一般在50～70 mg/kg[10-13]，病死率也隨著用藥劑量的增大而增高[13]。反復(fù)小劑量或大劑量一次性注射易造成胰島細(xì)胞直接損傷，比較了有關(guān)文獻(xiàn)報道后本實(shí)驗(yàn)選擇30 mg/kg的劑量；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，此劑量條件下成模大鼠血糖值和胰島素水平明顯升高，具有胰島素抵抗、高血糖、高胰島素血癥的T2DM臨床特征。

3.4 成模標(biāo)準(zhǔn)的確定 關(guān)于DM大鼠成模水平的判斷，目前國內(nèi)外的研究對DM模型判定標(biāo)準(zhǔn)不一，大多數(shù)研究傾向于空腹血糖＞7.8 mmol/L或隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L[14-15]。由于空腹時間大于12 h，易造成低血糖且容易造成DM癥狀較重的大鼠死亡，因此選擇隨機(jī)血糖更為靈活、操作性更強(qiáng)。為了避免病情自發(fā)緩解的問題，分別在建模后第3、7、14天測定血糖，以建模后14 d隨機(jī)血糖仍維持在16.7 mmol/L以上作為模型成功的標(biāo)志，確保了模型的穩(wěn)定性。

DM是一種由代謝系統(tǒng)紊亂引起的內(nèi)分泌疾病，其主要發(fā)病機(jī)制為胰島素相對不足且伴隨有胰島素抵抗。本研究在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上將高脂飲食與STZ干預(yù)相結(jié)合，采用成年SD大鼠高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射的方法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿等DM癥狀，體重明顯下降，血糖明顯升高且出現(xiàn)胰島素抵抗，其病理、生理改變接近于人類T2DM模型，具有時間短、成模率高、血糖水平穩(wěn)定的特點(diǎn)，是值得推廣的T2DM模型。

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Study of streptozotocin and high-fat diet inducing type 2 diabetes in a rat model

WU Ying1，ZHANG Yong2，YAO Hebin3
(1.Department of Nutrition，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Chinese People’s Liberation Army 32150，Xinxiang Henan 453000，China；3.Department of Endocrinology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo set up a SD rat model similar to human type 2 diabetes mellitus with insulin resistance.MethodsThirty-six SD rats were randomized into four groups，normal group(group A，n＝6)，high-fat diet group(group B，n＝6)，low-does streptozotocin group[group C，streptozotocin(STZ)，30 mg/kg，n＝12]，and high-fat diet and low-does STZ(30 mg/kg)group(group D，n＝12).Group C and D were induced by an injection of low-does STZ(30 mg/kg)after 4 weeks of normal chow feeding and high-fat chow feeding respectively.Rats with random plasma glucose levels＞16.7 mmol/L for 2 weeks were modeling success.ResultsBoth normal chow feeding associated with low-does STZ(30 mg/kg)and high-fat chow feeding associated with low-does STZ(30 mg/kg)can establish type 2 diabetes animal model.The diabetes morbidity was 66.7%(8/12)in group C，and 91.7%(11/12)in group D.ConclusionGroup D has moderately high blood sugar，insulin resistance，the success rate is high，and can be used as a good model of type 2 diabetes mellitus in relevant research.

Type 2 diabetes mellitus；Blood glucose；High fat；Streptozotocin(STZ)；Model，rat

R587.1－332

A

2095-3097(2017)06-0355-03

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.06.009

解放軍總后勤部保健專項(xiàng)課題(CWS14BJ38)

100048北京，海軍總醫(yī)院營養(yǎng)科(吳 瑛)；453000河南新鄉(xiāng)，中國人民解放軍32150部隊(duì)醫(yī)院(張 勇)；100048北京，海軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科(姚合斌)

1.1.3 試劑及儀器 STZ(美國Sigma公司)－20℃凍存，檸檬酸、檸檬酸三鈉(天津市津宏化工有限公司)；微量血糖儀及配套血糖試紙(美國強(qiáng)生公司)，BS224S電子天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模方法

1.2.1.1 用藥及制備 使用檸檬酸和檸檬酸三鈉配制成0.01 mol/L、pH 4.5的檸檬酸緩沖液，4～8℃冷藏保存。使用前用STZ配制成2%的STZ溶液。

1.2.1.2 動物飼養(yǎng)及分組 所有SD大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(23±1)℃，明暗周期12 h，相對濕度50%～60%，自由進(jìn)食、水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為A組(對照組即普通飼料組)6只、B組(高脂飼料組)6只、C組(普通飼料＋小劑量STZ注射組)12只、D組(高脂飼料＋小劑量STZ注射組)12只4組。

1.2.1.3 給藥途徑和劑量 4組大鼠在分組4周后，禁食、不禁水12 h，測空腹血糖，并同時稱體重。A組、B組大鼠按30 mg/kg注射檸檬酸緩沖液，C組、D組大鼠按30 mg/kg連續(xù)5 d腹腔注射2%STZ檸檬酸緩沖液。

1.2.1.4 成模標(biāo)準(zhǔn) 隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L且持續(xù)2周為造模成功。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 一般狀況 每日觀察各組大鼠進(jìn)食、飲水、排尿量及死亡情況，每周稱重1次。

1.2.2.2 血清生化指標(biāo) 建模后分別于第3、7、14天尾靜脈測定血糖。實(shí)驗(yàn)大鼠于處死前空腹12 h禁食、不禁水，測完空腹血糖和體重后乙醚麻醉大鼠，靜脈采血，放射免疫分析法測定空腹胰島素。

1.2.2.3 蘇木精-伊紅染色 大鼠處死后，立即取出骨骼肌組織，放入甲醛溶液中浸泡；肌肉組織石蠟包埋，切片后行蘇木精-伊紅染色，觀察大鼠骨骼肌組織變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2016-12-02 本文編輯:徐海琴)