李 碩，白 玉，薛 蓓，婁海華，楊秀航，董 逸，賴曉芳,2,3，閻斌倫,2,3，高 煥,2,3

( 1．淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222001； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014 )

脊尾白蝦腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因應(yīng)答蛻皮的表達特征研究

李 碩1，白 玉1，薛 蓓1，婁海華1，楊秀航1，董 逸1，賴曉芳1,2,3，閻斌倫1,2,3，高 煥1,2,3

( 1．淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222001； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014 )

蛻皮是脊尾白蝦等甲殼類生物的一種特殊生活史，在前期克隆獲得腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的基礎(chǔ)上，研究了該基因在脊尾白蝦蛻皮后不同組織和不同時間點(0、1、5、10、15 min)的表達特征。試驗結(jié)果表明，蛻皮后鰓組織中腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的表達量顯著上升(P<0.01)；在蛻皮后1 min，腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的表達量開始升高，至10 min時達到峰值，隨后下降。該結(jié)果顯示，腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的表達特征與脊尾白蝦蛻皮時的行為學(xué)特征一致，說明腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因在甲殼動物蛻皮過程中起著非常重要的作用。

脊尾白蝦；腺苷酸轉(zhuǎn)移酶；蛻皮；表達特征；基因

腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(ANT)作為真核細胞的轉(zhuǎn)運蛋白家族成員，是線粒體中最豐富的蛋白質(zhì)之一，約占細胞線粒體內(nèi)膜總蛋白的1%～10%[1-3]。腺苷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白酶的生物學(xué)功能主要是作為重要代謝物的載體參與線粒體的各種生理活動，將線粒體內(nèi)合成的三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運至胞漿供能，并將胞漿二磷酸腺苷轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)通過氧化磷酸化產(chǎn)能[1]。生物體內(nèi)大約1/2～1/3的基礎(chǔ)電子傳遞由腺苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，因此腺苷酸轉(zhuǎn)移酶是保持細胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵成分[4]。

目前甲殼類生物中，該基因的功能已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注，如在舊金山灣鹵蟲(Artemiafranciscana)胚胎中的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白酶與鈣離子運輸密切相關(guān)[5]；在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)中腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達變化與低溫脅迫有關(guān)[6-7]。筆者也克隆了脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因(GenBank號：KP892663)，并探討了該基因在不同發(fā)育期的表達特征(另文發(fā)表)，但該基因如何響應(yīng)蛻皮這一生理活動的表達特征一直未見相關(guān)報道，而這對于揭示甲殼類蛻皮過程中的分子調(diào)控機理又具有重要的意義。

脊尾白蝦作為一種重要的經(jīng)濟蝦類，不僅其養(yǎng)殖生物學(xué)日益受到關(guān)注[8]，而關(guān)于其作為海洋蝦類模式生物研究的優(yōu)點也受到肯定[9]，如具有生長速度快、繁殖率高、環(huán)境適應(yīng)性廣等特點[10]，因此以此蝦為試驗材料的文獻越來越多。本文以脊尾白蝦為試驗材料，通過對其蛻皮后至恢復(fù)正常狀態(tài)這一過程中不同時間點腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達特征的研究，以期為揭示甲殼類蛻皮過程中的能量傳遞相關(guān)基因的調(diào)控特征提供指導(dǎo)幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用脊尾白蝦取自一個養(yǎng)殖池塘自繁的“半成年”個體(比成年個體具有更快的蛻皮生長潛力)，選取體長(3.19±0.39) cm、體質(zhì)量(1.12±0.40) g、健康無病的個體，每兩尾個體作為一組放入28 cm×18 cm×20 cm的透明水族箱中進行養(yǎng)殖，每日早晚各投喂1次，利用虹吸法吸底層排泄物1次。養(yǎng)殖鹽度26，pH 8.1±0.2，平均水溫24 ℃。

1.2 蛻皮行為觀察及取樣

全天24 h不間斷觀察各養(yǎng)殖水箱中脊尾白蝦活動狀況；查明脊尾白蝦蛻皮活動規(guī)律后，分別在蛻皮后的第0(對照)、1、5、10、15 min點取樣，每個時間點各取3次(3次重復(fù))。同時以同一養(yǎng)殖水箱中與蛻皮個體共同養(yǎng)殖的未發(fā)生蛻皮的脊尾白蝦個體作為對照。取樣后，立即放入冰箱中-80 ℃保存待用。

1.3 RNA提取及cDNA第一鏈合成。

根據(jù)試劑盒說明，利用Trizol試劑(Invitrogen)提取各個時間點各蝦肌肉組織中的總RNA，同時為了考察蛻皮后腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因在組織間的表達是否存在差異，在蛻皮1 min時，分別提取肌肉、胃、鰓和眼柄4個組織中的總RNA，利用不含有RNA酶的DNaseI處理RNA以去除可能存有的DNA后，再利用反轉(zhuǎn)錄酶[M-MLV reverse transcriptase (BBI)]以T7d(T)12(引物序列見表1)為引物合成cDNA第一鏈。

1.4 Real-time PCR分析

針對脊尾白蝦ANT基因的cDNA序列，設(shè)計了一對用于實時定量PCR分析的引物(引物序列見表1)，同時以18S rRNA基因作為內(nèi)參基因(引物序列見表1)，通過實時定量PCR技術(shù)對各個蛻皮時期的脊尾白蝦個體的ANT基因表達情況進行相對定量分析。熒光實時定量PCR采用20 μL擴增體系，反應(yīng)體系各成分終濃度為：1×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ、正反向引物量各為400 nmol/L、1×ROX Reference Dye、40 ng cDNA。采用StepOnePlusTM型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems Inc.)進行擴增，擴增程序為：先95 ℃變性30 s,再95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性31 s進行40個循環(huán)，最后是一個熔解曲線程序(95 ℃進行15 s， 60 ℃進行60 s，再95 ℃ 15 s)。

表1 本研究中所使用的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用比較Ct法對獲得的定量結(jié)果進行分析，利用T檢驗對不同時間點脫殼后與對照組間的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達量進行差異分析。

2 結(jié) 果

2.1 脊尾白蝦蛻皮的行為學(xué)觀察

正常情況下，脊尾白蝦腹部體色透明；將要蛻皮的脊尾白蝦腹部微發(fā)白，不再透明，小斑點明顯；蛻皮后，蝦通體輕微發(fā)紅。投喂時，正常蝦行為活躍，爭搶餌料；而將要蛻皮蝦不活躍，不進食。另外，大部分將要蛻皮蝦在蛻皮前活動不積極，遠離蝦群，單獨靜臥在水族箱角落。

在脊尾白蝦嘗試蛻皮間隔期間，少數(shù)蝦靜伏不動，多數(shù)蝦會四處游走，并且伴隨著抖頭、抖尾、身體翻轉(zhuǎn)倒游和身體斜側(cè)運動等行為。將要蛻皮時，其腹部向內(nèi)收，呈弓形蜷縮狀，游泳足和步足靠在一起。此時，任何打擾(其他蝦的靠近、外界響聲、震動、光照等)都會造成其立即放棄蛻皮，腹部伸展回正常狀態(tài)。在無打擾情況下，脊尾白蝦在5～10 min嘗試蛻皮3～5次。若未蛻皮成功，1～1.5 h后脊尾白蝦將再次嘗試蛻皮。

脊尾白蝦蛻皮活躍時間點為0:00～6:00。蛻皮時，脊尾白蝦自胸和腹部相接處蛻出，此過程約3～5 min，隨后蛻皮個體開始逐漸恢復(fù)活動能力，而蛻皮10 min后個體已經(jīng)從外觀上完全恢復(fù)正常。

2.2 蛻皮后不同組織表達特征差異

選取脊尾白蝦蛻皮前(對照)和蛻皮后(蛻皮后1 min)的肌肉、眼柄、鰓和胃4種組織，研究了腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因在這些組織中的表達量變化(圖1)，結(jié)果表明，腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因在鰓組織中的表達量變化最大，與蛻皮前相比，其表達量提高了約1000倍，與其他組織相比差異極顯著(P<0.01)，而在其他組織中蛻皮前后的表達量變化不大，不存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異(P>0.05)。按照表達豐度的大小，腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達量在4種組織中的順序為：鰓>肌肉>眼柄>胃。

圖1 蛻皮前后腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因在不同組織中的表達量變化

2.2 蛻皮后不同時間點的表達特征

蛻皮后第0、1、5、10、15 min時間點脊尾白蝦肌肉組織中的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達特征見圖2。在蛻皮后1 min，腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達量開始上升，在第10 min時達到峰值(與對照相比，表達量增加了844倍)，隨后開始下降，在第15 min時表達量與第1 min時的表達量已經(jīng)近似。T檢驗表明，在第1、5、10、15 min時，蛻皮個體肌肉組織中的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達量與對照組相比均存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異(P<0.05)。

圖2 蛻皮前后腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因在不同時間點的表達量變化

3 討 論

蛻皮是甲殼類動物在生長發(fā)育過程中不斷通過蛻掉外骨骼而進行生長的一種特殊生活史特征，是一個內(nèi)在生理反應(yīng)和外在環(huán)境相協(xié)調(diào)的過程[11]。已有研究表明，溫度、鹽度和pH值均能顯著影響對蝦的蛻皮和生長，如對于印度明對蝦(Fenneropenaeusindicus)而言，只有最佳的環(huán)境條件才能讓蛻皮次數(shù)和生長達到同步的增長[12]。本研究中為盡快獲得不同蛻皮時間點下的個體，采用了生長狀況良好、蛻皮能力強的“半成年”個體，同時將鹽度、溫度和pH等環(huán)境因素均設(shè)置在脊尾白蝦生長狀況最適條件。對脊尾白蝦蛻皮過程的觀察表明，脊尾白蝦在蛻皮過程中保持著較高的警惕性，任何意外的碰觸都可能導(dǎo)致其終止蛻皮過程。這可能是因為脊尾白蝦蛻皮過程中自我保護力最弱，身體柔軟，極易受到同類及其他敵害生物的殘食[13]，因此只有找到一個最安全的空間和時間才發(fā)生蛻皮活動，這也是動物長期進化過程中形成的一種保護機制。

甲殼動物的蛻皮過程主要是由蛻皮抑制激素和蛻皮激素相互拮抗進行調(diào)控的[14]，除此之外，還有很多遺傳因子參與蛻皮的過程，如鈣調(diào)蛋白基因[15]、法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因[16]等。但是對這些基因表達特征的分析主要集中在一個完整蛻皮周期循環(huán)上，如蛻皮后期、蛻皮間期、蛻皮前期和蛻皮期[17]，而對于蛻皮后至恢復(fù)正常狀態(tài)這一短期(約10 min)過程中不同時間點上能量傳遞相關(guān)基因的表達特征還不清楚。已知蛻皮過程在宏觀上與生態(tài)能學(xué)(溫度)有關(guān)[18]，本研究則從基因表達角度闡釋了這一過程與能量傳遞相關(guān)基因表達的關(guān)系。在剛蛻皮后(1 min)，與能量傳遞相關(guān)的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達水平開始升高，至10 min左右達到峰值，隨后開始下降。這一腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達特征與實際觀察的蛻皮行為吻合：蛻皮后，脊尾白蝦需要大量能量來恢復(fù)身體的“損傷”，所以蛻皮后腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達量開始上升，而在蛻皮后約10 min時蛻皮個體完全恢復(fù)正常，此時腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的表達量也最大，隨后隨著機體恢復(fù)正常，腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達量又開始下降。由此可見，腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因在蛻皮過程中起著非常重要的作用。

不同基因在不同組織中的表達量是存在差別的，這主要與該基因的作用有關(guān)[19]。在本研究中，蛻皮后腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因主要在鰓中表達，其表達量是其他組織的幾百倍，這可能與鰓是脊尾白蝦的呼吸器官有關(guān)。作為脊尾白蝦的呼吸器官，雖然蛻皮時其他器官都幾乎靜止不動，但是鰓卻需要不停的擺動以獲得充足的氧氣來維持機體的生命功能，因此鰓此時是機體蛻皮時能量需求最旺盛的器官，而腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的表達是與能量產(chǎn)生和傳遞相關(guān)的，也就不難理解腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因為何在此器官中表達量如此之高了。

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ExpressionProfilesofANTinResponsetoDifferentTimeafterPost-moltinginRidgetailWhitePrawnExopalaemoncarinicauda

LI Shuo1, BAI Yu1, XUE Bei1, LOU Haihua1, YANG Xiuhang1, DONG Yi1, LAI Xiaofang1,2,3, YAN Binlun1,2,3, GAO Huan1,2,3

( 1.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China;2.Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology, Lianyungang 222005, China;3.The Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014, China )

As one of the mitochondrial proteins, the adenine nucleotide translocase (ANT) facilitates the exchange of ADP and ATP across the mitochondrial inner membrane, and plays an essential role in cellular energy metabolism. In our previous studies, a gene coding adenine nucleotide translocase in the ridgetail white prawnExopalaemoncarinicaudawas cloned. Here, the profiles of ANT expression in different tissues and 0, 1, 5, 10 and 15 min after molting were analyzed in order to explore how the ANT takes part in the molting. The results showed that the expression level of ANT was increased dramatically in gills, significantly different from the control (P<0.01). Additionally, the expression level was tended to increase at initial molting stage, then decrease after obtaining a summit at the 10th minute. The expression profiles was consistent with the molting procedure observed in our previous study. The findings suggest that the ANT plays an important role in the process of molting for ridgetail white prawn.

Exopalaemoncarinicauda; adenine nucleotide translocase (ANT); molt; expression profile; gene

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.020

2016-04-19；

2016-06-29.

2015年度江蘇省大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(5509005)；水產(chǎn)類重點專業(yè)建設(shè)項目(ZD2014001)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計劃(BE2013363)；江蘇省高?！扒嗨{工程”培養(yǎng)基金、連云港市產(chǎn)學(xué)研合作項目(CXY1517)；淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室研究基金資助項目(2015HS001).

李碩(1995-)，男，本科生；研究方向：海洋生物學(xué). E-mail:shiyeyishang@sina.com. 通訊作者： 高煥(1976-)，男，副教授；研究方向：海洋甲殼類遺傳學(xué). E-mail: huanmr@163.com.

S917

A

1003-1111(2017)02-0224-04