張志紅，王菊華，戴年華，張國(guó)華，黃江麗，黃 黃，圣 平，丁建南

( 江西省科學(xué)院 生物資源研究所，江西 南昌 330096 )

甲殼素發(fā)酵液養(yǎng)殖草魚(yú)、鰱魚(yú)幼魚(yú)試驗(yàn)

張志紅，王菊華，戴年華，張國(guó)華，黃江麗，黃 黃，圣 平，丁建南

( 江西省科學(xué)院 生物資源研究所，江西 南昌 330096 )

為研究甲殼素發(fā)酵液對(duì)草魚(yú)和鰱魚(yú)幼魚(yú)養(yǎng)殖效果，用商品殼聚糖作參比，基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組，分析甲殼素發(fā)酵液對(duì)魚(yú)體生長(zhǎng)和水質(zhì)環(huán)境等影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，甲殼素發(fā)酵液處理組草魚(yú)和鰱魚(yú)幼魚(yú)質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率比對(duì)照組高36.25%和122.47% (P<0.05)，草魚(yú)體內(nèi)脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶3種消化酶分別比對(duì)照組高144.39%、29.53%和29.75%，鰱魚(yú)體內(nèi)消化酶比對(duì)照組高48.06%以上(P<0.05)。與對(duì)照組比較，甲殼素發(fā)酵液顯著降低水中亞硝態(tài)氮(61.84%)、氨態(tài)氮(30.06%)、總磷含量(52.43%)，提高了草魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌抗性。在試驗(yàn)條件下，甲殼素發(fā)酵液對(duì)草魚(yú)和鰱魚(yú)幼魚(yú)起到一定的促生長(zhǎng)作用，并能改善水質(zhì)環(huán)境，甲殼素發(fā)酵液具有作為微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用的潛力。

甲殼素發(fā)酵液；殼聚糖；消化酶；嗜水氣單胞菌

甲殼素大量存在于節(jié)肢動(dòng)物如蝦、蟹和昆蟲(chóng)外殼中，也存在于菌類、藻類和高等植物的細(xì)胞壁中，分布極其廣泛，是保健食品、醫(yī)用材料以及化妝品行業(yè)重要原料[1]。殼聚糖又稱為脫乙酰甲殼質(zhì)、可溶性甲殼素、甲殼胺等，是由甲殼素脫乙?；笊傻闹辨湺嗵牵哂辛己玫纳砘钚院蜕锵嗳菪訹2]。殼聚糖作為飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖上應(yīng)用，具有調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗氧化能力和提高抗病及免疫能力等作用，可部分替代抗生素等化學(xué)藥物，對(duì)推動(dòng)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)、健康發(fā)展十分有益[3-4]。甲殼素通過(guò)化學(xué)方法制備殼聚糖，因能耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重越來(lái)越受到限制[5]。利用微生物降解甲殼素生產(chǎn)殼聚糖，降解產(chǎn)物豐富，操作過(guò)程安全環(huán)保。本試驗(yàn)選用商品殼聚糖和課題組研制的甲殼素微生物發(fā)酵液，研究其在草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)和鰱魚(yú) (Hypophthalmichthysmolitrix)養(yǎng)殖中的效果，比較兩種殼聚糖產(chǎn)品對(duì)淡水魚(yú)生長(zhǎng)性能、抗病能力和水質(zhì)的影響，為提高漁業(yè)養(yǎng)殖技術(shù)、開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

魚(yú)苗：草魚(yú)和鰱魚(yú)幼魚(yú)購(gòu)于江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，體質(zhì)量約50 g，體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊。

飼料：購(gòu)于江西省南昌市鑫泰飼料有限公司，主要成份含量為粗蛋白≥28.0%，粗脂肪≥8.5%，總磷≥0.60%，粗纖維≤10.0%，粗灰分≤11.0%，水分≤13.0%。

病原菌：草魚(yú)病原菌為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，購(gòu)于上海海洋大學(xué)。甲殼素發(fā)酵液：是由3種芽孢桿菌(Bacillus)和1種酵母菌(Saccharomycessp.)聯(lián)合降解膠質(zhì)甲殼素得到的發(fā)酵液。發(fā)酵液中甲殼素降解為不同鏈長(zhǎng)度的殼聚糖(脫乙酰度≥65%)，4種微生物含量≥1.0×109個(gè)/mL，含有大量脫乙酰酶和幾丁質(zhì)酶。

商品殼聚糖：購(gòu)于山東青島海良生物制品有限公司，脫乙酰度為99%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 養(yǎng)殖試驗(yàn)

試驗(yàn)于室外4 m2、深0.5 m的水泥池中進(jìn)行，設(shè)投喂甲殼素發(fā)酵液處理組(按池水量0.02%投入，每7 d潑灑一次)、投喂殼聚糖處理組(在基礎(chǔ)飼料中添加0.1%)、對(duì)照組(基礎(chǔ)飼料)，每組放草魚(yú)40尾，鰱魚(yú)10尾，每組3個(gè)重復(fù)。按初始魚(yú)體質(zhì)量的3%投喂基礎(chǔ)飼料，每日上下午各1次。馴養(yǎng)至攝食正常后，開(kāi)始正式試驗(yàn)。養(yǎng)殖水源為地下水，試驗(yàn)過(guò)程中，池水日充氣時(shí)間約10 h。養(yǎng)殖60 d后，全部幼魚(yú)稱量質(zhì)量。

1.2.2 草魚(yú)攻毒試驗(yàn)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)處理選擇20尾草魚(yú)放入90 cm×75 cm×60 cm的室內(nèi)水族箱內(nèi)，溫度約25 ℃，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。菌種活化3次，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定攻毒密度為4×107個(gè)/mL，按每尾0.1 mL，腹腔注射嗜水氣單胞菌液。每日記錄攻毒之后草魚(yú)的累積死亡數(shù)。按下式計(jì)算各處理相對(duì)保護(hù)率[6]。

相對(duì)保護(hù)率/%=(1-處理死亡率/對(duì)照死亡率)×100%

1.2.3 水質(zhì)測(cè)定

室外養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和總磷含量，氨氮測(cè)定采用納氏試劑分光光度法，總磷采用鉬酸銨分光光度法，亞硝態(tài)氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[7]。

1.2.4 幼魚(yú)體內(nèi)消化酶測(cè)定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后取饑餓1 d的幼魚(yú)，用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定魚(yú)體內(nèi)淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性。從每個(gè)處理組中隨機(jī)取幼魚(yú)6尾，取出全腸和肝胰臟，將全腸和肝胰臟一起稱量質(zhì)量，置于勻漿器中，加入10倍體積的高純水勻漿，于冰箱中4 ℃靜置過(guò)夜。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液置于冰箱中4 ℃待用[8]。脂肪酶活性測(cè)定以37 ℃條件下每克組織蛋白在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為1 個(gè)酶活力單位(U)。蛋白酶活性測(cè)定以每毫克組織蛋白37 ℃每分鐘水解生成1 μg氨基酸作為1個(gè)酶活力單位(U)。淀粉酶活性采用碘—淀粉比色法，以組織中每毫克蛋白在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位(U)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SAS V8軟件Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 甲殼素發(fā)酵液對(duì)幼魚(yú)生長(zhǎng)和抗病能力的影響

幼魚(yú)飼養(yǎng)60 d后甲殼素發(fā)酵液和殼聚糖處理組草魚(yú)質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率分別比對(duì)照組高36.25%和24.26%，鰱魚(yú)為122.47%和72.3%，說(shuō)明甲殼素發(fā)酵液對(duì)草魚(yú)和鰱魚(yú)幼魚(yú)均有促進(jìn)生長(zhǎng)效果，與商品殼聚糖和對(duì)照組差異顯著(P<0.05)(表1)。

表1 不同處理對(duì)草魚(yú)和鰱魚(yú)生長(zhǎng)的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)到顯著性(P<0.05).

攻毒1 d后對(duì)照組草魚(yú)死亡率達(dá)90%，第10 d全部死亡，甲殼素發(fā)酵液和殼聚糖處理組草魚(yú)死亡率較低，相對(duì)保護(hù)率分別達(dá)到70%和65%。甲殼素發(fā)酵液有減輕病原菌侵害，提高草魚(yú)抗病能力、持續(xù)保護(hù)幼魚(yú)和降低死亡率效果(表2)。

表2 草魚(yú)幼魚(yú)感染嗜水氣單胞菌后死亡情況

2.2 甲殼素發(fā)酵液對(duì)草魚(yú)和鰱魚(yú)幼魚(yú)消化酶的影響

從3種消化酶測(cè)定結(jié)果看，甲殼素發(fā)酵液處理組的草魚(yú)體內(nèi)脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶均顯著高于對(duì)照組和殼聚糖組(P<0.05)，分別比對(duì)照組高144.39%、29.53%和29.75%，分別比殼聚糖處理組高13.76%、18.51%和6.23%(表3)。同樣，甲殼素發(fā)酵液處理組鰱魚(yú)體內(nèi)3種消化酶顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，甲殼素發(fā)酵液明顯促進(jìn)了草魚(yú)和鰱魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)消化酶活力。

表3 不同處理對(duì)草魚(yú)和鰱魚(yú)體內(nèi)消化酶影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)到顯著性(P<0.05).

2.2 甲殼素發(fā)酵液對(duì)養(yǎng)殖水體的影響

與對(duì)照組比較，甲殼素發(fā)酵液處理組水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和總磷含量分別降低61.84%、30.06%和52.43%，差異顯著(P<0.05)；殼聚糖處理組分別比對(duì)照組降低1.08%、3.92%和2.22%(P>0.05)(表4)。甲殼素發(fā)酵液改善水質(zhì)效果好于殼聚糖處理組。

表4 不同處理對(duì)養(yǎng)殖水體參數(shù)的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).

3 討 論

3.1 甲殼素發(fā)酵液對(duì)促進(jìn)幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

大量研究表明殼聚糖應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖，具有改善動(dòng)物攝食性能、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)效果。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，草魚(yú)飼料中添加殼聚糖能顯著促進(jìn)草魚(yú)生長(zhǎng)。于東祥等[9]在對(duì)真鯛(Pagrosomusmajor)幼魚(yú)的試驗(yàn)中比較殼聚糖與腐植酸鈉、海藻酸鈉等不同添加劑對(duì)幼魚(yú)生長(zhǎng)影響，殼聚糖處理組比對(duì)照組體質(zhì)量增28.03%，效果好于其他添加劑。殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物促生長(zhǎng)作用主要表現(xiàn)為提高消化酶活性，研究認(rèn)為提高腸道消化酶活性是殼聚糖促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)的重要原因之一[10]。本試驗(yàn)中，甲殼素發(fā)酵液和商品殼聚糖均能提高3種消化酶活性，進(jìn)而提高草魚(yú)和鰱魚(yú)生長(zhǎng)速度。甲殼素發(fā)酵液不僅含有殼聚糖、脫乙酰酶、幾丁質(zhì)酶等活性物質(zhì)，而且還有芽孢桿菌和酵母菌等有益微生物，促生長(zhǎng)效果比殼聚糖處理組明顯。研究認(rèn)為芽孢桿菌定殖在腸道后刺激腸道內(nèi)壁，增加內(nèi)源性消化酶的分泌，提高消化吸收能力，保證機(jī)體快速生長(zhǎng)[11-12]。

3.2 甲殼素發(fā)酵液對(duì)提高幼魚(yú)抗病能力的影響

閆大偉等[6]研究表明殼聚糖可提高草魚(yú)抗病(嗜水氣單胞菌)能力，且隨著殼聚糖添加量的增加呈先升后降的趨勢(shì)。Anthi等[13]在飼料中添加殼聚糖連續(xù)飼喂鯪魚(yú)(Cirrhinamolitorella)30、60、90 d后注射嗜水氣單胞菌，結(jié)果表明殼聚糖處理的魚(yú)體明顯提高了抗病能力，隨著殼聚糖處理時(shí)間延長(zhǎng)抗病能力增強(qiáng)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的芽孢桿菌可抑制副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和哈維弧菌(V.harveyi)等病原菌繁殖[14]，提高腸道中有益菌群乳酸桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)含量[15]，增強(qiáng)消化系統(tǒng)穩(wěn)定性和自身調(diào)節(jié)能力，改善腸道微生態(tài)環(huán)境。芽孢桿菌也能提高機(jī)體免疫相關(guān)酶如超氧化物歧化酶和酚氧化酶等活性[16]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，甲殼素發(fā)酵液能明顯提高草魚(yú)幼魚(yú)抗嗜水氣單胞菌的能力，減輕病原菌侵害，保護(hù)幼魚(yú)、降低死亡率。

3.3 甲殼素發(fā)酵液對(duì)水質(zhì)的影響

水質(zhì)環(huán)境優(yōu)劣是水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵，在養(yǎng)殖過(guò)程中各種殘餌和排泄物影響水質(zhì)，引起水產(chǎn)動(dòng)物死亡[17]。殼聚糖廣泛應(yīng)用在廢水處理中，可作為吸附劑、絮凝劑及抑菌劑等[18-19]。任秀芳等[20]在水體中添加羧化殼聚糖，能顯著降低水體中氨氮、硫化氫、亞硝態(tài)氮的含量，孫艷輝等[21]在體外模擬條件下，研究了殼聚糖對(duì)亞硝態(tài)氮的清除作用，隨殼聚糖用量增加對(duì)亞硝態(tài)氮清除能力也升高。芽孢桿菌對(duì)水質(zhì)改善也有一定效果，李永芹等[22]研究表明，芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝態(tài)氮的降解率分別為81.9%和64.3%，對(duì)凈化養(yǎng)殖池塘水質(zhì)有明顯作用。張峰峰等[23]研究認(rèn)為芽孢桿菌可迅速有效的降低水體中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量，4 d去除率均達(dá)99%以上，可有效降低水體pH值。本試驗(yàn)中甲殼素發(fā)酵液處理顯著降低水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和總磷含量，對(duì)養(yǎng)殖水體改善具有顯著效果。

致謝

感謝江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所章海鑫等同志對(duì)本研究給予的指導(dǎo)和幫助。

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EffectsofChitinFermentationLiquidonGrassCarpandSilverCarp

ZHANG Zhihong, WANG Juhua, DAI Nianhua, ZHANG Guohua, HUANG Jiangli, HUANG Huang, SHENG Ping, DING Jiannan

( Institute of Biological Resources, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330029, China )

chitin fermentation liquid (CFL); chitosan; digestive enzyme;Aeromonashydrophila

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.017

2016-01-18；

2016-06-21.

江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BBF60043).

張志紅(1972-)，女，副研究員，博士；研究方向：資源環(huán)境和微生物.E-mail：zzh04scau@126.com. 通訊作者：丁建南(1955-)，男，研究員，博士；研究方向：微生物生態(tài). E-mail：345810710@qq.com.

S942.3

A

1003-1111(2017)02-0212-04