高 巖，裴 超，張 超，李 箏，孔祥會

( 河南師范大學 水產(chǎn)學院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

草魚呼腸孤病毒疫苗的研發(fā)與應用

高 巖，裴 超，張 超，李 箏，孔祥會

( 河南師范大學 水產(chǎn)學院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

草魚呼腸孤病毒；疫苗研發(fā)；免疫預防

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷擴大，我國已成為世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)消費和進出口國家。2000年至2013年，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量以每年5%～6%穩(wěn)步增長，在2013年，中國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量達4.542×107t，占全球水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%以上[1]。根據(jù)世界糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)顯示，2015年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖總量達7.430×107t。這些數(shù)據(jù)表明我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不僅保障了中國水產(chǎn)品的市場供應，也對世界水產(chǎn)品供給做出了重大貢獻[2]。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖以淡水魚類為主，其中草魚(Ctenopharyngodonidellus)養(yǎng)殖是淡水養(yǎng)殖中重要的組成部分，也是國內(nèi)養(yǎng)殖量最大的魚類[3]。草魚由于飼料來源廣，生長速度快，經(jīng)濟價值高，養(yǎng)殖范圍規(guī)模大，廣受養(yǎng)殖人員的喜愛，但草魚抗病能力差，各個階段都易受到病害感染，常見疾病有草魚腸炎病、赤皮病、爛鰓病和病毒性出血病，其中草魚病毒性出血病是危害最嚴重的病害，流行地區(qū)廣泛、發(fā)病率高、死亡率高，嚴重威脅著草魚養(yǎng)殖業(yè)[4-5]。早在20世紀50年代，我國就開始對草魚出血病進行研究，在70年代末分離確定病原為病毒顆粒，至1991年國際病毒分類委員會將其命名為草魚呼腸孤病毒(AquareovirusC type Grass carp reovirus)[6]。國內(nèi)許多學者對草魚呼腸孤病毒的研究集中在病毒的生物學特性[7-8]、感染機制[9]、與草魚免疫系統(tǒng)的相互作用[10]，取得了許多成果，為抗病毒疫苗和藥物的研發(fā)提供基礎資料。目前該病發(fā)生后沒有非常有效的治療藥物，而運用疫苗和免疫藥物來提高草魚抗呼腸孤病毒的免疫能力是當前防治疾病的主要措施。筆者著重總結了近年來關于草魚呼腸孤病毒疫苗的制備方法、給藥方式及其優(yōu)缺點的比較等內(nèi)容，以期為草魚呼腸孤病毒病的免疫防治提供參考。

1 草魚呼腸孤病毒研究

1.1 病原

草魚呼腸孤病毒，是我國分離到的第一株魚類病毒，隸屬水生呼腸孤病毒屬。其形態(tài)結構為20面體對稱的球形顆粒，直徑為70～80 nm，具雙衣殼，無囊膜[11]。方勤等[12]對草魚呼腸孤病毒及衣殼蛋白的純化和低溫電鏡觀察確定病毒顆粒呈多層排列，包括RNA核心與內(nèi)殼層、中間層及外殼層，同時衣殼蛋白電泳顯示，病毒顆粒含有7種蛋白(VP1～VP7)組分。其基因組由雙鏈RNA組成，現(xiàn)在已經(jīng)確認的基因組有11個片段，命名為S1～S11，編碼11或12種蛋白[13-14]。根據(jù)-vp6-基因序列比較，草魚呼腸孤病毒分離株至少存在3種基因型，代表株分別為Ⅰ型草魚呼腸孤病毒經(jīng)典株(873株)、Ⅱ型浙江湖州分離株(HZ08株)和Ⅲ型湖北分離株(104株)[15]。常見毒株基因與編碼蛋白對應見表1。草魚呼腸孤病毒在pH 3～10 的范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，HZ08的適應范圍較其他毒株廣，3種類型毒株對乙醚和胰蛋白酶處理均不敏感，反復凍融對病毒活性影響較大，不同細胞系對不同毒株的敏感性不同[16]。

表1 常見毒株基因及其編碼蛋白

注：HZ08為浙江湖州分離株，GD108株為廣東分離株，GCReV-109株為湖北分離株.

1.2 病毒感染及致病機制

根據(jù)呼腸孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原則和已知研究，草魚呼腸孤病毒結構蛋白VP1～VP7及非結構蛋白NS80、NS31、NS38等的功能已經(jīng)初步明確[17-22]，進而可推測病毒粒子的感染機制。草魚呼腸孤病毒進入細胞分為侵入、增殖、裝配和釋放4個步驟。第一步，病毒進入細胞階段主要靠VP5和VP7等外衣殼蛋白發(fā)揮識別和穿膜作用協(xié)助病毒進入細胞；第二步，病毒核酸和蛋白質(zhì)合成階段，病毒核酸在VP2作用下合成mRNA，雙層衣殼中的VP1形成跨內(nèi)外衣殼蛋白層的通道，便于mRNA轉移；第三步，在病毒粒子組裝過程中NS80和NS38共同形成包涵體的基本結構，VP3是內(nèi)層核衣殼骨架蛋白，能綁定dsRNA。NS80通過結合VP3在包涵體內(nèi)富集病毒內(nèi)層蛋白和病毒基因組，首先組裝病毒內(nèi)層核衣殼，之后外衣殼蛋白再進入包涵體進行外層衣殼的組裝。VP6用于連接內(nèi)層蛋白層與外層蛋白層，和VP4蛋白共同在病毒復制過程中起輔助作用；第四步，NS31蛋白具有膜滲透性和引起膜融合的功能，將病毒滲透到細胞外繼而引起細胞融合[23-26]。

草魚呼腸孤病毒主要感染2齡以下的魚種，健康草魚從感染到發(fā)病需要4～15 d，死亡率超過80%。在臨床上會表現(xiàn)以下癥狀：初期草魚會有食欲不振、頭部發(fā)黑、停止攝食、離群緩游等癥狀，隨著病情加重草魚會出現(xiàn)不同部位的出血癥狀，可見部位有頭部、鰓蓋、上下頜、腹部及尾部等，據(jù)此可分為紅肌肉型、紅鰭紅鰓蓋型和腸炎型3種[27]。病理組織觀察血管內(nèi)皮細胞受損，血管壁通透性增高引起毛細血管或小血管出血，使循環(huán)血量減少，同時形成血於或血栓破壞了局部的血循環(huán)，使正常代謝發(fā)生障礙，進而導致臟器組織病變[28]。

2 草魚呼腸孤病毒疫苗的研發(fā)

草魚出血病嚴重危害漁業(yè)養(yǎng)殖的經(jīng)濟利益，一旦感染此病，未及時發(fā)現(xiàn)治療，即可能導致全池魚死亡，造成不可估量的損失，所以應積極采取行之有效的措施進行防治。藥物防治和免疫預防是魚病防治的主要方法。由于魚體本身的生活環(huán)境導致患病個體及時發(fā)現(xiàn)難、治療難，而且當前沒有研發(fā)出該病毒的特效藥物，濫用藥物則導致藥物殘留，產(chǎn)生耐藥性或危害人類食用安全，因此應該科學的使用魚類疫苗提高魚體免疫力進行免疫防病。

草魚出血病疫苗的研究始于20世紀60年代的組織勻漿滅活疫苗，由于組織勻漿疫苗免疫效果不穩(wěn)定，之后通過病毒的細胞培養(yǎng)并滅活后制備滅活疫苗，病毒傳代培養(yǎng)獲取弱毒毒株，以制備減毒活疫苗，均取得了較好效果，在漁業(yè)生產(chǎn)中推廣使用，具有良好的經(jīng)濟和社會效益。隨著現(xiàn)代分子生物學和基因工程技術的發(fā)展，漁用疫苗的研究熱點轉向亞單位疫苗以及基因工程疫苗等。

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗是指利用化學或物理方法使病原失去致病力而保留抗原的免疫原性的一類疫苗。草魚呼腸孤病毒目前發(fā)現(xiàn)有3種基因型，免疫原性有一定差別，針對不同的病原選擇合適的滅活方式，同時也可以添加佐劑增強疫苗的穩(wěn)定性和免疫效力，確保疫苗高效穩(wěn)定。我國最早使用的“土疫苗”就是組織勻漿滅活疫苗，操作簡單，廣泛應用于疾病防控，但是常由于滅活不完全，導致病原毒力未完全失去，從而免疫效果不穩(wěn)定，引起健康魚感染。 至20 世紀80年代初，楊先樂等[29-33]進行了草魚出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的研究，克服了“土疫苗”的缺點。針對毒株854、836-w制備疫苗，對其滅活條件、最佳免疫劑量、佐劑使用、穩(wěn)定性等方面進行了評價，并進行了中試試驗及大規(guī)模的實際運用，結果表明，細胞滅活疫苗免疫保護率高(約85%)，在4～5 d引起魚體產(chǎn)生免疫力，保護力可持續(xù)到60 d以上，疫苗性能穩(wěn)定、安全可靠、免疫保護力高, 保護時效長，同時大規(guī)模生產(chǎn)工藝使疫苗推廣應用產(chǎn)生不錯的經(jīng)濟效益和社會效益。近年來，一些學者從基因水平對滅活疫苗注射后產(chǎn)生的非特異性免疫和特異性免疫應答進行研究，為該疫苗的推廣提供理論依據(jù)。Yi等[34]探究了草魚出血病滅活疫苗對草魚脾臟中免疫球蛋白M、主要組織相容性復合體Ⅰ、Ⅰ型干擾素、補體3、白細胞介素1β、內(nèi)凝集素相關基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)凝集素、主要組織相容性復合體Ⅰ、白細胞介素1β、補體3基因的相對表達量隨時間變化先上調(diào)后下調(diào)，Ⅰ型干擾素相對表達量在6 h后達到峰值，之后降至正常水平，免疫球蛋白M相對表達量在72 h內(nèi)持續(xù)上調(diào)。滅活疫苗誘導草魚的特異性免疫應答中可能增強了機體呈遞抗原的能力，同時激活了補體系統(tǒng)。

2.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是病原體經(jīng)過物理或化學方法處理后毒性亞單位結構改變，毒力減弱或消失，仍保留很好的免疫原性，可以正常繁殖感染機體的疫苗。減毒活疫苗較滅活疫苗有以下優(yōu)點，由于毒性減弱不能引起疾病，通過自然感染途徑接種，可以誘導出黏膜免疫，使機體獲得廣泛的免疫保護。同時病毒可以自我復制增殖、水平傳播，誘導魚體及整個群體產(chǎn)生較強的免疫效果。但是減毒活疫苗可能出現(xiàn)毒力返祖，存在致病風險。1986年以來，許淑英等[35-36]對草魚出血病弱毒疫苗進行研制和免疫效果觀察，并在此基礎上對弱毒疫苗的最小免疫量，免疫產(chǎn)生期，免疫保護(持久)期和保存期進行了測定，并發(fā)現(xiàn)桉液是良好的減毒劑。從20世紀90年代開始對研制的草魚出血病凍干細胞弱毒疫苗進行近二十年的中試和推廣，直至2011年初農(nóng)業(yè)部批準草魚出血病活疫苗的生產(chǎn)使用[農(nóng)業(yè)部公告1525號]，國內(nèi)外首個草魚出血病活疫苗成功問世[37]。傳統(tǒng)方法篩選減毒疫苗，遺傳背景不清楚，可能存在不確定的威脅。目前基因重組技術發(fā)展成熟，運用基因缺失技術使病原的毒力基因缺失或者使病原代謝關鍵基因缺失制備弱毒疫苗，這種策略基因背景清楚、減毒機制明確，同時定點或多片段突變?yōu)椴豢赡嫱蛔儯拘院茈y恢復。因病毒變異快基因型多，病毒性疫苗中應用較少，而多應用于細菌性疾病疫苗生產(chǎn)。Min等[38]構建了G基因缺失重組病毒性出血性敗血癥病毒，免疫褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼魚后取得較好的免疫效果，并且該疫苗自然狀態(tài)下因缺少G基因不能進行復制增殖，致病風險低，可作為預防性疫苗。

2.3 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗是通過基因重組技術將病原的相關免疫基因體外表達并純化獲得只包含病原體抗原的一類蛋白制劑。這類疫苗不包括毒力因子、安全性高、穩(wěn)定性好、已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，但是重組亞單位疫苗免疫效率低，同時在使用過程中需多次免疫并添加佐劑提高免疫效果。目前研究的重組亞單位疫苗主要分為病毒類疫苗、細菌類疫苗、激素類疫苗。由于大部分感染水產(chǎn)動物的病毒基因組已經(jīng)破譯，對編碼具有免疫原性的抗原蛋白的基因信息也有一定的了解，因此，當前重組亞單位疫苗研究主要集中在病毒性疫苗。草魚呼腸孤病毒常見毒株的基因組與編碼對應蛋白的功能分析取得一定進展，因此，草魚呼腸孤病毒的重組亞單位疫苗的研究也大量開展。VP5和VP7是草魚呼腸孤病毒主要的外衣殼蛋白，研究者對VP5和VP7都進行了大量的免疫原性分析，并評估重組蛋白是否能作為疫苗使用[39-40]。Lu等[41]制備了草魚呼腸孤病毒VP5和VP7重組蛋白疫苗，混合口服免疫草魚，產(chǎn)生良好的保護作用，積累死亡率低于10%。田園園等[42]對草魚呼腸孤病毒GD108的外衣殼蛋白VP4的基因序列進行比對分析、免疫原性分析，推測VP4蛋白有多個B淋巴細胞識別的抗原表位，通過原核表達獲得重組VP4蛋白(rVP4)，進行體外中和試驗發(fā)現(xiàn)，rVP4的多克隆抗體可以有效的中和病毒。之后進行免疫保護試驗，發(fā)現(xiàn)劑量為3 μg/g的rVP4保護率達到82%，同時檢測到魚體內(nèi)免疫球蛋白M含量顯著增加，VP4蛋白可作為草魚呼腸孤病毒亞單位疫苗新的候選蛋白。草魚呼腸孤病毒該類疫苗在國內(nèi)研究仍停留在實驗室階段，如實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，仍需進一步了解編碼蛋白的基因信息，選擇合適的表達載體高效表達蛋白產(chǎn)物，添加合適的佐劑提高疫苗的免疫保護效果。

2.4 DNA疫苗(核酸疫苗)

DNA疫苗(核酸疫苗)指將某一種或多種編碼抗原蛋白的外源基因克隆到真核表達系統(tǒng)的質(zhì)粒上, 然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi), 質(zhì)粒能夠在其體內(nèi)復制、轉錄、翻譯成相應的抗原蛋白，誘導宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應答, 以達到預防和治療疾病的目的。截至目前，全世界只有針對魚感染性胰腺壞死病毒的DNA 疫苗在加拿大獲得許可并投入商業(yè)化使用[43]。研究較多的DNA疫苗多是針對抗原組成簡單的病毒，如出血性敗血病毒和傳染性造血組織壞死病毒的DNA 疫苗，都取得良好的免疫保護效果[44-45]。在草魚呼腸孤病毒DNA疫苗的研究中主要是對病毒的VP6、VP7基因構建重組質(zhì)粒并使抗原蛋白在宿主細胞表達量增加，同時評估重組質(zhì)粒的免疫保護效果[46-49]。劉林等[50]將草魚呼腸孤病毒的VP6 基因克隆進桿狀病毒表達系統(tǒng)，獲得核酸疫苗載體pFastBac-FA-VP6-ph-VP6，并通過抗體水平測定和免疫保護檢測，評估了該核酸疫苗的免疫保護效果高達95%。2014年，李珍[51]構建了雙啟動子控制雙結構基因的蛋白—核酸疫苗表達載體pFastTMDua-VP7-VP6-β-actin，并獲得重組桿狀病毒Bacmid-VP7-VP6-β-actin。重組病毒感染家蠶卵巢細胞和蠶蛹120 h后檢測到成功表達VP7蛋白，然后將感染重組桿狀病毒120 h的蠶蛹冷凍干燥制成粉狀添入飼料口服免疫魚體，通過RT-PCR和免疫組化法驗證重組桿狀病毒Bacmid-VP7-VP6-β-actin能夠成功的進入魚體，并表達抗原基因VP6，該研究預示蠶體表達的蛋白可作為口服蛋白疫苗，同時也預示該重組病毒可作為核酸疫苗。

DNA疫苗制備過程簡便，且效率較高，一次肌肉注射可以達到持久免疫保護效果。同時也有研究表明，口服DNA疫苗也能起到較好的免疫效果。但目前DNA疫苗的安全性存在很大的爭議，質(zhì)粒在魚體內(nèi)持續(xù)表達的時間長短，長時間表達對機體是否有其他副作用，質(zhì)粒外源基因能否整合到宿主細胞染色體上等。由于質(zhì)粒在宿主體內(nèi)不可控，出于安全性考慮，國內(nèi)限制DNA疫苗的應用。

表2 不同類型草魚呼腸孤病毒疫苗制備、接種及優(yōu)缺點比較

3 展 望

我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖種類豐富，產(chǎn)量穩(wěn)步增長，滿足國內(nèi)生產(chǎn)需求的同時對國外市場貢獻顯著。隨著水產(chǎn)品出口比例增加，我國農(nóng)業(yè)部提出無公害水產(chǎn)品養(yǎng)殖，對漁藥進行明確規(guī)范，抗生素和化學藥物的殘留監(jiān)控體系逐步建立，漁用疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預防中不僅具有實用的學術價值，而且有廣泛的應用前景。我國目前在草魚呼腸孤病毒的疫苗研發(fā)和應用中都已具備了一定的基礎，相關的滅活疫苗和減毒活疫苗都取得較好的免疫效果，目前生產(chǎn)上應用較廣泛的為滅活疫苗。但隨著草魚集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和新型病毒的出現(xiàn)，現(xiàn)有的傳統(tǒng)疫苗不能滿足草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，與此同時隨著DNA重組技術的發(fā)展和完善，以基因工程為手段研發(fā)的基因工程疫苗，如一些亞單位疫苗、病毒活載體疫苗和利用反向遺傳學技術構建的基因缺失疫苗迅速發(fā)展，雖然目前大多處于實驗室研發(fā)階段，但是具有非常廣闊的發(fā)展前景和應用價值。

我國研究生產(chǎn)推廣漁用疫苗中大多遇到以下困難，如接種方式多采取注射，不僅耗時耗力，而且接種對象一般是是幼魚，漁民在使用時操作不當會對魚體造成傷害或引發(fā)其他病原的感染；疫苗成本高、不易保存、或針對單一病原，大多數(shù)漁民不會首選疫苗進行防??；疫苗大規(guī)模生產(chǎn)工藝、疫苗推廣體系不成熟，大多數(shù)研究成果只在實驗室應用無法走進養(yǎng)殖場。為了解決這些問題，可采用碳納米管、海藻酸鈉等新興生物材料包埋疫苗，通過口服免疫魚體或采用超聲波輔助浸泡免疫等高效導入技術；運用基因工程技術研發(fā)多價多聯(lián)疫苗預防多種病原菌感染；跟緊國際前沿結合我國生產(chǎn)實際，開創(chuàng)獨特的生產(chǎn)工藝，將實驗室研制轉向工廠化生產(chǎn)，進而在漁業(yè)養(yǎng)殖中應用和推廣，以實現(xiàn)漁業(yè)疫苗產(chǎn)業(yè)化及生產(chǎn)應用。

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AReviewofResearchandDevelopmentofVaccineagainstGrassCarpReovirus

GAO Yan，PEI Chao，ZHANG Chao，LI Zheng，KONG Xianghui

( College of Fisheries，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China )

grass carp reovirus；vaccine development；immunological prevention

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.023

2016-04-14；

2016-05-21.

河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃項目(15IRTSTHN018)；河南省國際合作項目(144300510017)；河南省水產(chǎn)學重點學科項目(201209).

高巖(1993—), 女, 碩士研究生；研究方向：魚類免疫和疾病控制.E-mail:13569883402@163.com.通訊作者：孔祥會(1968—), 男,教授,博士；研究方向:水產(chǎn)動物免疫與疾病控制. E-mail: xhkong@htu.cn.

S917

C

1003-1111(2017)02-0237-06