吳燕 孔健 袁海龍 張福成

(空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142)

·論著·

復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠抗皮膚癬菌感染的組織病理學(xué)療效觀察

吳燕 孔健 袁海龍 張福成

(空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142)

目的通過(guò)病理學(xué)研究評(píng)估外用抗真菌藥-復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠對(duì)常見(jiàn)皮膚癬菌的抗炎和抗真菌療效。方法采用須癬毛癬菌感染豚鼠皮膚，建立動(dòng)物模型，用4種皮膚外用制劑治療，通過(guò)考察豚鼠病變皮膚的恢復(fù)情況，比較復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠的治療效果。結(jié)果在治療須癬毛癬菌感染豚鼠的皮膚真菌病方面，復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠的療效優(yōu)于鹽酸特比萘芬凝膠 (P＜0.05)、曲安奈德益康唑乳膏 (P＜0.01)和糠酸莫米松凝膠 (P＜0.01)。結(jié)論復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠對(duì)豚鼠皮膚須癬毛癬菌感染的治療和預(yù)防復(fù)發(fā)效果較好。

須癬毛癬菌；病理；復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠

鹽酸特比萘芬屬于丙烯胺類藥物，具有廣譜抗真菌活性。它能特異地干擾真菌麥角固醇的早期生物合成，高選擇性抑制真菌麥角鯊烯環(huán)氧化酶，使真菌細(xì)胞膜形成過(guò)程中麥角鯊烯環(huán)氧化反應(yīng)受阻，從而達(dá)到殺滅或抑制真菌的作用[1-2]。糠酸莫米松是一種合成的中效糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、止癢、抗過(guò)敏的作用[3]。皮膚淺部和皮下真菌感染影響皮膚、毛發(fā)、甲和黏膜組織，其中皮膚癬菌致全球數(shù)百萬(wàn)人感染，導(dǎo)致頭癬、股癬、手足癬、體癬和甲真菌病并伴隨炎癥反應(yīng)[4]。治療皮膚癬菌感染時(shí)，通常局部外用抗真菌藥物，目前市售的藥品中大多都未注重炎癥的消退，并且都是基于臨床的觀察，并未進(jìn)行病理的研究。筆者自制了含有抗炎、抗過(guò)敏和抗真菌的復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠，并采用須癬毛癬菌感染豚鼠皮膚構(gòu)建動(dòng)物模型，用4種皮膚外用制劑給藥治療，考察模型豚鼠病變皮膚的恢復(fù)情況，比較藥物的療效。

1 材料和方法

1.1 菌株

須癬毛癬菌 (Trichophytonmentagrophytes)1株 (71896)由臨床最新分離，引自北京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科真菌室。其又稱石膏樣毛癬菌，屬于毛癬菌屬，可侵犯皮膚、指 (趾)甲和毛發(fā)，引起的體癬皮疹表現(xiàn)為環(huán)狀或不規(guī)則形，局部炎癥明顯，周圍可有丘疹和水皰，愈后不留色素沉著[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Hartley豚鼠 (36只)，白色，雌雄各半，體重 (250±50) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)條件：溫度22～28℃，相對(duì)濕度50%～60%，每籠1只，以防止互相吃舔藥物。喂豚鼠塊料，自由飲食、飲水。人工照明12 h。

1.3 藥物

復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠 (每克含鹽酸特比萘芬10 mg，糠酸莫米松0.5 mg，批號(hào)：20150501，空軍總醫(yī)院)，鹽酸特比萘芬凝膠 (每克含鹽酸特比萘芬10 mg，批號(hào)：20150815，空軍總醫(yī)院)，醋酸曲安奈德益康唑乳膏 (每克含硝酸益康唑10 mg，曲安奈德1 mg，批號(hào)：150715242，西安楊森制藥有限公司)，糠酸莫米松凝膠 (每克含糠酸莫米松0.5 mg，批號(hào)：150728，空軍總醫(yī)院)。

1.4 建立豚鼠真菌感染模型

菌懸液制備 將受試菌株接種在沙氏瓊脂培養(yǎng)斜面或培養(yǎng)皿上，28℃培養(yǎng)7～14 d后，用生理鹽水沖洗菌落，過(guò)濾，制成菌懸液，并將濃度調(diào)節(jié)至 (1～2)×108CFU/mL，備用。

動(dòng)物模型構(gòu)建 豚鼠真菌感染模型建立的方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用剃須刀刮去受試動(dòng)物背部的毛，刮毛區(qū)面積為4 cm×4 cm，將其中心部位用記號(hào)筆標(biāo)記成2.5 cm×2.5 cm正方形，再用無(wú)菌砂紙打磨，以點(diǎn)狀出血為宜。用75%乙醇消毒，待干燥后取上述菌懸液100 μL，均勻涂布于皮膚破損面[6]。

豚鼠真菌感染模型成功的判斷：動(dòng)物皮膚感染1周后，皮損局部出現(xiàn)紅斑、脫屑、糜爛、結(jié)痂，皮損取材直接鏡檢可見(jiàn)菌絲和孢子，皮損取材真菌培養(yǎng)出源感染菌；皮損組織病理學(xué)HE染色檢查可見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，PAS染色顯示在角質(zhì)層或在毛囊周圍可見(jiàn)真菌菌絲和孢子。

分組及給藥 須癬毛癬菌感染豚鼠隨機(jī)分組，每組9只：復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠治療組 (a組)，鹽酸特比萘芬凝膠治療組 (b組)，曲安奈德益康唑乳膏治療組 (c組)，糠酸莫米松凝膠治療組 (d組)，分別外涂相應(yīng)藥物進(jìn)行治療，每感染區(qū)用藥0.2 mL (0.2 g)，2次/d，連續(xù)給藥3周，停藥1周。每周取豚鼠背部皮膚，做病理切片，觀察其恢復(fù)情況。

病理試驗(yàn)方法 病理取材時(shí)把病變部位分為4個(gè)象限，在治療第7、14、21 d和停藥7 d，依次取豚鼠感染區(qū)不同象限的皮膚組織 (每次各組取相同象限的皮膚組織)，用10%甲醇溶液固定，采用常規(guī)石蠟包埋，切片，經(jīng)HE和PAS染色，顯微鏡下進(jìn)行炎性評(píng)價(jià)和病理真菌檢查。

1.5 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

炎性評(píng)分以角質(zhì)層增厚、棘細(xì)胞層增厚、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、水腫情況作為評(píng)分指標(biāo)，病理真菌檢查以角質(zhì)層是否存在真菌及菌量情況、棘細(xì)胞層是否存在真菌及菌量情況、毛囊周圍是否存在真菌及菌量情況作為評(píng)分指標(biāo)，每項(xiàng)均為正常 (-)、輕度 (+)、中度 (++)、重度 (+++)，分別以0、1、2、3計(jì)分，以此兩項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)分之和對(duì)每組的治愈率進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)釆用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。組間比較釆用Two-Independent-Samples檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料釆用Chi-Squaretest檢驗(yàn) (χ2檢驗(yàn))。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 真菌感染豚鼠皮膚模型皮損結(jié)果 (見(jiàn)圖1)

2.2 真菌感染豚鼠皮膚組織病理學(xué)結(jié)果

真菌感染7 d后，皮損肉眼觀察可見(jiàn)每組均有紅斑、大量白色鱗屑、結(jié)痂等癥狀；組織病理切片觀察，HE染色中炎癥反應(yīng)明顯，均表現(xiàn)出角質(zhì)層、棘細(xì)胞層增厚，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血等癥狀，且PAS染色檢出真菌，在角質(zhì)層，棘細(xì)胞層和毛囊周圍可見(jiàn)大量菌絲和孢子，表明真菌模型構(gòu)建成功。見(jiàn)圖2。

2.3 各組治療周期內(nèi)的療效評(píng)價(jià)

分別在給藥第7天、第14天、第21天和停藥7 d取皮膚病理組織進(jìn)行觀察評(píng)分，復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠組 (a組)與各組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)，見(jiàn)表1和表2，病理結(jié)果見(jiàn)圖3～圖8。

在治療周期內(nèi)，通過(guò)HE染色觀察炎性癥狀的恢復(fù)時(shí)，復(fù)方特比萘芬凝膠組恢復(fù)較快，鹽酸特比萘芬凝膠對(duì)照組，因不具有抗炎藥物成分，炎性癥狀較明顯，豚鼠皮膚真皮層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，其中角質(zhì)層和棘層增厚情況、真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張，充血情況明顯。曲安奈德益康唑乳膏對(duì)照組在給藥期間其對(duì)豚鼠皮膚的刺激性較大，豚鼠反應(yīng)較強(qiáng)烈，療效與實(shí)驗(yàn)組相比，效果較差。糠酸莫米松組因只含抗炎成分，不含抗菌藥物，炎性癥狀較反復(fù)，提示真菌感染往往伴隨炎癥的發(fā)生。PAS染色觀察真菌菌量情況時(shí)，通過(guò)治愈率的比較，各組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)各組真菌感染豚鼠皮膚模型皮損結(jié)果

圖2真菌感染7 d豚鼠皮膚組織病理學(xué)觀察 (未給藥；1、2、3為HE染色結(jié)果×100、×200、×400，4、5、6為PAS染色結(jié)果×100、×200、×400；箭頭A.角質(zhì)層增厚，B.棘細(xì)胞層增厚，C.淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，D.毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，E.須癬毛癬菌菌絲)

Fig.3Histopathological observation of guinea pig skin after 7 days of fungal infection (1,2,3 for HE staining results ×100,×200,×400;4,5,6 for PAS staining results ×100,×200,×400;A.Stratum corneum thickening;B.Prickle cell layer thickening;C.Lymphocyte and Neutrophil infiltration;D.Telangiectasia,congestion;E.Trichophyton mentagrophytes mycelium)

通過(guò)4種制劑對(duì)須癬毛癬菌感染豚鼠模型治療7 d、治療14 d、治療21 d和停藥7 d的皮膚組織病理觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠兼具抗炎和抗真菌的療效，豚鼠病變皮膚病情恢復(fù)的較為迅速，且治愈后停藥1個(gè)月無(wú)復(fù)發(fā)，連續(xù)真菌培養(yǎng)均為陰性，比曲安奈德益康唑乳膏、鹽酸特比萘芬凝膠和糠酸莫米松凝膠具有更好的療效。

表1 各組給藥后治愈率

Tab.2Comparison of pathological results of four drugs in treating guinea pigs treated byTrichophytonmentagrophytes

組別給藥7d給藥14d給藥21d停藥7da組4．83±0．413．50±0．550．83±0．410．83±0．41b組5．83±0．41?4．33±0．52?1．33±0．521．16±0．41c組6．83±0．75??5．00±0．63??3．00±0．89??3．83±0．98??d組7．17±1．17??5．33±0．82??3．83±0．41??3．67±0．52??

注：a組.復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠組,b組.鹽酸特比萘芬凝膠組,c組.曲安奈德益康唑乳膏組,d組.糠酸莫米松凝膠組;各組分別與a組相比，*表示兩組病理結(jié)果評(píng)分比較，具有顯著性差異，P＜0.05；**表示兩組病理結(jié)果評(píng)分比較，具有極顯著性差異，P＜0.01

由此可知，在治療須癬毛癬菌感染豚鼠的皮膚真菌病方面，復(fù)方鹽酸特比萘芬的療效優(yōu)于鹽酸特比萘芬凝膠 (P＜0.05)、曲安奈德益康唑乳膏 (P＜0.01)和糠酸莫米松 (P＜0.01)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用磨砂法構(gòu)建動(dòng)物感染真菌模型，能夠更好的對(duì)接種的菌量進(jìn)行控制，隨機(jī)分組，盡可能減小實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間感染程度不同的誤差。同類復(fù)方制劑中，無(wú)上市銷售的凝膠劑，在綜合考慮復(fù)方成分比例和抗菌療效后，選用臨床療效較好的進(jìn)口藥曲安奈德益康唑乳膏作為陽(yáng)性對(duì)照藥，乳膏和凝膠所用基質(zhì)均未有抗炎和抑菌作用的報(bào)道，空白組結(jié)果顯示空白基質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)影響 (見(jiàn)圖1)。本制劑中糖皮質(zhì)激素的配伍選用糠酸莫米松，本品具有抗炎、抗過(guò)敏的作用，其特點(diǎn)為作用強(qiáng)度增加而副作用不成比例增加，且外用生物利用度小于0.1%，全身性不良反應(yīng)小[7]；與其他局部用糖皮質(zhì)激素相比，本品具有較高療效，且不易引起皮膚萎縮或腎上腺功能抑制等作用[8]。

圖3給藥7 d豚鼠皮膚組織病理學(xué)觀察 (HE染色結(jié)果，×100)：a組相較b、c、d 3組炎性癥狀消退明顯；b、c、d 3組均存在角質(zhì)層增厚、棘細(xì)胞層增厚和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)圖4給藥7 d豚鼠皮膚組織病理學(xué)觀察 (PAS染色結(jié)果，×100)：a、b組抗菌效果較好；c組角質(zhì)層和毛囊周圍仍存在有菌絲；d組鏡下可見(jiàn)大量菌絲圖5給藥14 d豚鼠皮膚組織病理學(xué)觀察 (HE染色結(jié)果，×100)：a組炎性癥狀基本消退；b、c組相較a組存在棘細(xì)胞層增厚和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象；d組存在角質(zhì)層增厚、棘細(xì)胞層增厚和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)圖6給藥14 d豚鼠皮膚組織病理學(xué)觀察 (PAS染色結(jié)果，×100)：a組全部治愈；b組基本痊愈；c組仍有部分毛囊周圍存在菌絲；d組毛囊周圍菌絲明顯圖7停藥7 d豚鼠皮膚組織病理學(xué)觀察 (HE染色結(jié)果，×100)：a組恢復(fù)正常；b、c組有輕微棘細(xì)胞層增厚和少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；d組因不具有抗菌成分炎性癥狀較反復(fù)，伴有角質(zhì)層增厚、棘細(xì)胞層增厚和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)圖8停藥7 d豚鼠皮膚組織病理學(xué)觀察 (PAS染色結(jié)果，×100)：a、b組未復(fù)發(fā)；c組仍有部分毛囊周圍存在菌絲；d組毛囊周圍存在菌絲 (a.復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠組，b.鹽酸特比萘芬凝膠組，c.曲安奈德益康唑乳膏組，d.糠酸莫米松凝膠組)

Fig.3Tissue pathology of guinea pig skin after 7-day treatment (HE staining results,×100):compared b,c,d three groups,inflammatory symptoms of a group subsided significantly;b,c,d three groups were stratified thickening,spine cell layer thickening and inflammatory cell infiltrationFig.4Tissue pathology of guinea pig skin after 7-day treatment (PAS staining results,×100):a,b groups antibacterial effect was better;there were still hyphae around the stratum corneum and hair follicles in c group;d group of microscopic visible myceliumFig.5Tissue pathology of guinea pig skin after 14-day treatment (HE staining results,×100):a group of inflammatory symptoms subsided;b,c group compared with a group of spine cell layer thickening and inflammatory cell infiltration and so on;d group there was stratum corneum thickening,spine cell layer thickening and inflammatory cell infiltrationFig.6Tissue pathology of guinea pig skin after 14-day treatment (PAS staining results,×100):a group all cured;b group basically recovered;group c part of the hair follicle was around the hyphae;d group hair follicle was around the hyphaeFig.7Histopathological observation of guinea pig skin 7 days after withdrawal (HE staining results,×100):a group returned to normal;b,c groups with mild spine cell layer thickening and a small amount of inflammatory cell infiltration;group d was not allergic to antibacterial components,with stratum corneum thickening,spine cell layer thickening and inflammatory cell infiltrationFig.8Histopathological observation of guinea pig skin 7 days after withdrawal (PAS staining results,×100):a,b groups without recurrence;group c was part of the hair follicle was still around the hyphae;d group hyphae around the hair follicle (a.Compound terbinafine hydrochloride gel;b.Terbinafine hydrochloride gel;c.Triamcinolone acetonide,Econazole nitrate cream;d.Mometasone furoate gel)

復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠組相比曲安奈德益康唑乳膏組 (P＜0.01)，見(jiàn)效快，治愈率高，且復(fù)發(fā)率低；相比鹽酸特比萘芬凝膠組 (P＜0.05)，在治療前1周炎癥反應(yīng)消退明顯，紅斑、鱗屑消退快，表現(xiàn)為瘙癢感減退；相比糠酸莫米松凝膠組 (P＜0.01)，起效快，療效顯著。鹽酸特比萘芬與糠酸莫米松復(fù)配形成的復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠均充分地發(fā)揮了其效力，故該制劑治療淺部真菌病療效更優(yōu)。通過(guò)本研究，表明復(fù)方鹽酸特比萘芬凝膠可提高須癬毛癬菌感染的治愈率，并能減少?gòu)?fù)發(fā)，且抗炎效果較好。

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Histopathologicalobservationofterbinafinehydrochloridegelagainstdermatophytesinfection

WU Yan,KONG Jian,YUAN Hai-long,ZHANG Fu-cheng

(1.TheGeneralHospitalDepartmentofPharmacyofAirForce，Beijing100142)

ObjectiveTo assess the anti-inflammatory and anti-fungal efficacy of compound terbinafine hydrochloride gel as a topical antifungal drug for common dermatophytosis by pathological methods.MethodsGuinea pig skin was infected byTrichophytonmentagrophytesto establish animal model.Treated them with four topical preparations and then investigated the recovery of their affected skin,comparing the therapeutic effect of compound terbinafine hydrochloride gel with other three formulations.ResultsIn terms of curing guinea pig skin infected byTrichophytonmentagrophytes,compound terbinafine hydrochloride gel was more effective than terbinafine hydrochloride gel (P＜0.05),triamcinolone acetonide,econazole nitrate cream (P＜0.01) and mometasone furoate gel (P＜0.01).ConclusionsCompound terbinafine hydrochloride gel had better effect in the treatment and relapse prevention of guinea pig skin infection ofTrichophytonmentagrophytes.

Trichophytonmentagrophytes;pathology;compound terbinafine hydrochloride gel

[Chin J Mycol，2017，12(5):283-287]

R 978.5

A

1673-3827(2017)12-0283-05

吳燕，女 (漢族)，博士，副主任藥師.E-mail:Wuyan2001@163.com

張福成,E-mail:yanjiushi1010@126.com

2017-05-01

[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮