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·綜述·

布魯氏菌IV型分泌蛋白及其參與免疫應(yīng)答的研究進展

肖啟程1，田一男1，彭廣能1，李平2，魏斌1，涂蕊1，但佳明1，任志華1，鐘志軍1

布魯氏菌是一種胞內(nèi)致病菌，主要寄生于宿主的滋養(yǎng)層細胞和巨噬細胞，能感染人、家畜和野生動物。動物感染后引起母畜的流產(chǎn)和公畜的睪丸炎等癥狀，而人感染后則引起關(guān)節(jié)疼痛、乏力、發(fā)熱及肝脾腫大等癥狀。布魯氏菌在與宿主的對抗中依賴免疫逃避機制，幫助布魯氏菌“偽裝”起來逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別，進而在細胞內(nèi)大量繁殖，引起機體的持續(xù)感染。由于該機制的存在，使得目前對布魯氏菌病的治療存在諸多困難。IV型分泌系統(tǒng)(T4SS)是布魯氏菌的一種關(guān)鍵毒力因子，其所分泌的效應(yīng)蛋白幫助調(diào)節(jié)布魯氏菌在胞內(nèi)的生存以及感染時的免疫應(yīng)答。本文中，我們對布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白及其參與免疫應(yīng)答的研究進行綜述，尤其對VirB操縱子所介導(dǎo)的IV型分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的分泌效應(yīng)蛋白與宿主免疫之間的關(guān)系進行詳細闡述。

布魯氏菌；分泌蛋白；免疫應(yīng)答

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種自然疫源性、人獸共患傳染性疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為波浪熱，可引發(fā)心包炎、腦膜炎，懷孕母畜出現(xiàn)流產(chǎn)，公畜出現(xiàn)睪丸炎等[1]。大多數(shù)病原菌會在先天免疫系統(tǒng)的監(jiān)視下被阻止，與其他細菌感染相比較，動物感染布魯氏菌后，可通過免疫逃避機制躲避宿主的識別，從而引起更低的免疫反應(yīng)[2]。研究表明體液免疫應(yīng)答在免疫后期下降的情況下，疫苗的免疫保護力仍然保持恒定不變[3]，表明細胞免疫是布魯氏菌免疫應(yīng)答的主要方式。Mariana X Byndloss等[4]研究發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)布魯氏菌感染胚胎滋養(yǎng)層細胞時，IV型分泌系統(tǒng)(T4SS)的調(diào)理作用引起滋養(yǎng)層細胞發(fā)生非折疊蛋白應(yīng)答，導(dǎo)致調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)的細胞死亡并釋放損傷相關(guān)分子模式，使吞噬細胞聚集在細胞周圍并釋放流產(chǎn)布魯氏菌。表明非折疊蛋白應(yīng)答與布魯氏菌在宿主細胞內(nèi)生存存在密切聯(lián)系。

布魯氏菌感染宿主細胞經(jīng)歷以下階段： 1)布魯氏菌首先侵入宿主細胞中形成布氏小體； 2)晚期胞內(nèi)體和溶酶體與布氏小體的融合受布魯氏菌的抑制，其中約10%的布氏小體未被降解得以存活； 3)未降解的布氏小體經(jīng)轉(zhuǎn)運到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并建立復(fù)制點進行復(fù)制； 4)布魯氏菌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)復(fù)制結(jié)束后，形成自體吞噬泡最終脫離宿主細胞進而到達其他細胞而持續(xù)感染傳播。研究表明，布魯氏菌在宿主細胞復(fù)制過程中，T4SS在晚期胞內(nèi)體與溶菌酶的標記，識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記并作用于分泌途徑，識別自噬體的標記，抵御苛刻的胞內(nèi)環(huán)境和調(diào)控免疫途徑的激活等一系列過程中發(fā)揮重要作用[2]。因此對T4SS進行研究對于理解布魯氏菌的感染有重要意義。

1 布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)與VirB操縱子

布魯氏菌的IV型分泌系統(tǒng)是II型染色體中的12個基因在細菌細胞膜上組成(VirB1-12)的多蛋白復(fù)合物，通過VirB操縱子編碼，參與布魯氏菌的胞內(nèi)活動。一旦細菌的T4SS組裝完成，布魯氏菌就可以通過該系統(tǒng)分泌效應(yīng)蛋白感染宿主細胞。布魯氏菌T4SS與其他細菌T4SS的組分相似，比如農(nóng)桿菌和百日咳桿菌[5]。T4SS系統(tǒng)主要分為以下5部分：1)由VirB2組成的伸長區(qū)；2)由VirB7、VirB9和VirB10組成的中心區(qū)和外膜區(qū)；3)由VirB5和VirB10的片段組成連接區(qū)；4)由VirB3、VirB4、VirB6、VirB8和VirB10的N端組成的內(nèi)膜區(qū)；5)由VirB4和VirB11組成的ATP酶能量區(qū)[2]。VirB作為布魯氏菌的毒力基因，它在宿主細胞的表達可影響布魯氏菌的胞內(nèi)生存與復(fù)制[6]。VirB操縱子的12種基因所具有的功能不盡相同，目前關(guān)于12個VirB基因?qū)Σ剪斒暇玖Φ挠绊?，主要集中在對牛種、羊種、豬種和綿羊附睪種布魯氏菌的研究(表1)。表1顯示了每個基因缺失后對牛種、羊種、豬種和綿羊附睪種布魯氏菌毒力的影響。VirB最初在豬種布魯氏菌中首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在所有布魯氏菌種中都發(fā)現(xiàn)了高度保守的VirB基因序列，表明了該操縱子在布魯氏菌中有著重要的作用[7]。研究表明，牛種布魯氏菌VirB1突變體在人的宮頸癌細胞中不能復(fù)制，論證了VirB操縱子影響牛種布魯氏菌的胞內(nèi)生存[8]。另一研究表明，牛種布魯氏菌VirB1突變株在小鼠巨噬細胞中生存能力也降低，進一步表明VirB1缺失后布魯氏菌的毒力受到抑制[9]。Andreas B. den Hartigh等[9]研究表明，牛種布魯氏菌VirB1突變株在巨噬細胞中的生存能力下降，而牛種布魯氏菌VirB2基因突變株在巨噬細胞和小鼠器官中的生存能力都下降，但VirB12對牛種布魯氏菌的毒力無影響。Yao-Hui Sun等[10]研究表明VirB12對牛種、羊種和豬種布魯氏菌的毒力同樣也無影響。Joicy C. Sa等[11]研究表明，綿羊附睪種布魯氏菌可以在脾臟中繁殖，而其VirB2突變株不能在巨噬細胞中生存和繁殖，證明了VirB2的缺失同樣使綿羊附睪種布魯氏菌的毒力減弱。R.-M. Delrue等[12]采樣免疫熒光法檢測羊種布魯氏菌16M菌株VirB2、VirB4和VirB9突變體在人宮頸癌細胞內(nèi)的生存能力，結(jié)果表明，3種VirB突變體在人宮頸癌細胞的生存能力都明顯低于羊種布魯氏菌16M菌株。Nicolas Sprynski等[13]構(gòu)建了豬種布魯氏菌VirB5突變株，巨噬細胞試驗表明，缺失VirB5降低了豬種布魯氏菌的毒力。David等[7]對VirB5和VirB9進行突變，巨噬細胞試驗顯示，豬種布魯氏菌VirB5和VirB9突變體的感染能力明顯下降，表明豬種布魯氏菌VirB5和VirB9突變株的毒力也受到影響。牛種布魯氏菌的VirB3～VirB11缺失突變株在小鼠巨噬細胞中的生存能力都有所下降，可能是由于VirB操縱子缺失所致，表明VirB操縱子對布魯氏菌的胞內(nèi)生存具有重要作用。以上試驗都表明，T4SS可以調(diào)節(jié)布魯氏菌的胞內(nèi)生存能力。同時有研究表明，T4SS參與引起細菌的炎癥反應(yīng)和影響宿主感染時的免疫應(yīng)答。試驗表明，在細菌中突變T4SS后，野生型菌株可以在宿主內(nèi)引起比突變株更強的免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此可推論T4SS對抑制宿主的免疫應(yīng)答起重要作用[14-15]。在人的宮頸癌細胞和外周血單核細胞(THP1)培養(yǎng)布魯氏菌T4SS突變體試驗中，通過對布魯氏菌突變體在細胞內(nèi)增殖能力的檢測，發(fā)現(xiàn)破壞T4SS能阻止布魯氏菌在細胞內(nèi)的生存[12,16]，從而論證了T4SS對布魯氏菌胞內(nèi)存活的重要性。

不同細菌T4SS的組成較保守，但也存在一定的差異。布魯氏菌T4SS的結(jié)構(gòu)沒有完全一致性，多數(shù)特征與農(nóng)桿菌屬和幽門螺桿菌的T4SS結(jié)構(gòu)相似。胞質(zhì)和內(nèi)膜是由VirB6和VirB8與ATP酶VirB4，VirB11和VirD4而組成。VirB7、VirB9和VirB10相互作用形成一個可跨越內(nèi)膜和外膜的T4SS復(fù)合體核心。VirB2和VirB5能組成纖毛。VirB3可能與纖毛的形成有關(guān)。而農(nóng)桿菌屬VirB1屬于一肽聚糖降解的轉(zhuǎn)糖激酶，可以調(diào)節(jié)周質(zhì)的分泌系統(tǒng)[17]。研究報道，對幽門螺桿菌的Virb11同系物進行分析，結(jié)果表明該同系物是一種具有緊密、均勻?qū)ΨQ的動態(tài)蛋白質(zhì)。而當組成virB11同系物的核苷酸結(jié)合時可以調(diào)節(jié)空間結(jié)構(gòu)使T4SS進行組裝。雖然幽門螺桿菌和VirB10同系物都有中央鞘包裹，但是大多數(shù)T4SS的修飾物質(zhì)是VirB5。農(nóng)桿菌屬VirB5以那些短小、無結(jié)構(gòu)的羧基端蛋白質(zhì)為目標對纖毛進行修飾。VirB5出現(xiàn)在細菌表面，表明它可能與宿主蛋白發(fā)生反應(yīng)[18]。

農(nóng)桿菌屬和布魯氏菌T4SS間最重要的差異是后者VirB操縱子中存在一個額外的基因VirB12，可編碼一個外膜脂蛋白，同時布魯氏菌T4SS缺乏一個編碼VirD4耦合蛋白同系物的基因。VirD4耦合蛋白在T4SS發(fā)揮功能中扮演了重要的角色，即為轉(zhuǎn)運招募蛋白質(zhì)底物。如農(nóng)桿菌屬利用雙分子熒光互補技術(shù)和免疫熒光顯微技術(shù)證明了VirD4與VirE2效應(yīng)子蛋白之間的兩極定位與相互作用[18]。

表1 VirB操縱子的12個基因及其在牛種、羊種、豬種及綿羊附睪種布魯氏菌中的作用
Tab.1 The 12 genes of VirB operon and their respective function in B. abortus, B. melitensis, B. suis and B. ovis

操縱子Operon缺失后毒力是否減弱Whetherornotthevirulencedecreasesafterdeletion牛種布魯氏菌羊種布魯氏菌豬種布魯氏菌綿羊附睪種布魯氏菌功能FunctionVirB1是未知未知未知溶解糖基轉(zhuǎn)移酶，從而使T4SS更易裝配和集合[19]VirB2是是未知是參與機體的免疫保護作用，影響免疫保護力的產(chǎn)生[20]VirB3是未知未知未知細菌跨膜蛋白信號的傳送[21]VirB4是是未知未知運輸物質(zhì)，可有效阻止布氏小體與溶酶體融合VirB5是未知是未知調(diào)節(jié)布魯氏菌的胞內(nèi)運輸和吞噬[22]VirB6是未知未知未知細菌跨膜蛋白信號的傳送VirB7是未知未知未知細菌跨膜蛋白信號的傳送VirB8是未知未知未知調(diào)節(jié)布魯氏菌的胞內(nèi)運輸和吞噬VirB9是是未知未知作為布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)細菌外膜的組成部分，可刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應(yīng)[23]VirB10是未知未知未知細菌跨膜蛋白信號的傳送VirB11是未知未知未知為布魯氏菌的分泌過程提供能量[24]VirB12無影響未知免疫性抗原[25]

2 目前已發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)蛋白

目前，我們對布魯氏菌T4SS的效應(yīng)蛋白了解的還比較少，僅有部分效應(yīng)蛋白的功能得到初步鑒定。表2中為目前在布魯氏菌T4SS中發(fā)現(xiàn)的15種效應(yīng)蛋白。

2.1效應(yīng)蛋白VceA和VceC 在T4SS分泌的效應(yīng)蛋白質(zhì)中，VirB調(diào)控的效應(yīng)物A(VceA)和效應(yīng)物C(VceC)是研究人員最早識別的兩個T4SS效應(yīng)蛋白。通過半乳糖苷酶結(jié)合和β-半乳糖苷酶活性檢測顯示，在流產(chǎn)布魯氏菌VjbR突變體中，VceC和VirB的表達下調(diào)，表明它們受相同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[26]。VceC的C端含20種氨基酸，包含T4SS進行轉(zhuǎn)運識別的序列，主要參與VceC轉(zhuǎn)移到宿主細胞過程中；N端是由38種氨基酸形成的疏水跨膜區(qū)，主要與VceC的定位和干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的作用有關(guān)[26-27]。免疫共沉淀結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶蛋白Bip/Grp78可以結(jié)合到VceC脯氨酸含量高的區(qū)域[27]，此區(qū)域為VceC的特征域。與VceC的定位和對其有相互作用的宿主細胞進行識別相一致，VceC可激活非折疊蛋白應(yīng)答，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行蛋白質(zhì)的折疊和修飾，同時還能在感染期間誘導(dǎo)脯氨酸的炎性反應(yīng)。

2.2效應(yīng)蛋白RicA RicA是IV型分泌系統(tǒng)分泌的重要蛋白之一,主要參與布魯氏菌的胞內(nèi)運輸[28]。RicA不僅可以與小GTP結(jié)合蛋白Rab2相互作用，還與蛋白質(zhì)的折疊有關(guān)[29]。此外，Xavier de Bolle等發(fā)現(xiàn)Rab2與布魯氏菌RicA蛋白相互作用可以調(diào)控布氏小體的成熟，從而間接影響牛種布魯氏菌和宿主細胞的活動。布魯氏菌RicA的抗原決定簇較多，主要存在于N端，且試驗結(jié)果表明該蛋白具有較強的免疫原性，因此宿主細胞會產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)[26]。研究發(fā)現(xiàn)RicA的晶體結(jié)構(gòu)和γ-碳酸酐酶類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)高度相似，這些蛋白質(zhì)都含有鋅離子，但卻沒有碳酸酐酶的作用，說明RicA有一種尚未清楚的獨特功能[30]。RicA可以與機體內(nèi)、外游離的鳥苷二磷酸(GDP)與結(jié)合GDP反應(yīng)形成Rab2，但不能與結(jié)合GTP反應(yīng)，說明RicA并不是一種激活GTP酶的蛋白質(zhì)[30-31]。進一步的試驗表明，RicA不是Rab2的鳥嘌呤核苷酸的交換因子，因此它無法激活GTP酶。RicA缺失突變株在小鼠細胞和人宮頸癌細胞中毒力并未減弱，而且其細胞內(nèi)化和胞內(nèi)生存能力也沒有變化，但與野生型布魯氏菌相比,RicA突變株消耗了宿主細胞內(nèi)大量的溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1，表明RicA缺失突變株可以逃離晚期胞內(nèi)體到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并迅速建立復(fù)制點[31]。有研究表明，在牛種布魯氏菌感染過程中，布魯氏菌會將RicA蛋白轉(zhuǎn)運至巨噬細胞中，但RicA并不能在VirB缺失株感染細胞時進行轉(zhuǎn)運，而且經(jīng)檢測在VirB缺失株的培養(yǎng)基中也發(fā)現(xiàn)了RicA。說明RicA是依賴于VirB的存在進行轉(zhuǎn)運，但其分泌卻不受VirB的影響[31]。

2.3效應(yīng)蛋白BtpA和BtpB BtpA和BtpB是T4SS分泌的產(chǎn)生毒力的必要蛋白質(zhì)，能抑制樹突細胞的成熟，但是它們在活化NF-kB時卻有著截然相反的作用，BtpA有抑制作用而BtpB則引起NF-kB的活化[32]。它們在哺乳動物中存在一個保守的TIR區(qū)域，負責(zé)在先天免疫識別過程中調(diào)節(jié)信號級聯(lián)放大效應(yīng)[33]。這兩種蛋白通過CyaA試驗確認可以轉(zhuǎn)運到宿主細胞中，但TEM-1內(nèi)酰胺酶的試驗中發(fā)現(xiàn)BtpB的轉(zhuǎn)運效率明顯低于其他效應(yīng)蛋白質(zhì)。為了調(diào)節(jié)宿主細胞Toll樣受體信號通路，細菌可以將BtpA轉(zhuǎn)運至細胞，而存在于細胞中的T4SS很可能是實現(xiàn)這種轉(zhuǎn)運最有效的機制之一。此外，BtpA和BtpB屬于同一類細菌蛋白質(zhì)。它們都具有Toll受體結(jié)構(gòu)域，Toll樣受體結(jié)構(gòu)域存在于真核生物的Toll樣蛋白及其下游的Toll樣銜接蛋白，當這二者相互作用時會產(chǎn)生級聯(lián)信號引起核轉(zhuǎn)錄因子kB的核移位、促炎性細胞因子和I型干擾素的產(chǎn)生[34]。

2.4其他效應(yīng)蛋白 BspC，BspE，BPE123, BPE005，BPE275和BPE043是另一部分由T4SS分泌的效應(yīng)蛋白，具有高度的保守性,但目前對它們作用機制與功能的研究知之甚少。有研究表明，BspC和BspE存在于細胞核周圍，其中BspC存在于高爾基體，BspE則會形成囊泡[35]。BspC的N端有依賴于Sec的信號肽，在不影響蛋白質(zhì)分泌的情況下能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)。BPE005，BPE275和BPE043發(fā)現(xiàn)于其他細菌，而BPE123只存在于幾種細菌中，包括桿菌狀巴爾通體，蒼白桿菌等[36]。BPE123是B型流產(chǎn)布魯氏菌通過VirB轉(zhuǎn)運的一種效應(yīng)蛋白。María I. Marchesin等通過液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS-MS)鑒別出了人的α-烯醇酶并用免疫共沉淀證明其可以與BPE123相互作用。α-烯醇酶的降解能阻礙牛種布魯氏菌在人宮頸癌細胞中的增殖，表明α-烯醇酶在布魯氏菌感染細胞的過程中起作用[37]。此外，BPE123和α-烯醇酶可以在布魯氏菌的胞內(nèi)生存階段相互作用，且α-烯醇酶的活性很大程度上取決于BPE123的空間結(jié)構(gòu)[37]。由此可推測，BPE123和宿主細胞α-烯醇酶相互作用有利于牛種布魯氏菌的胞內(nèi)生存。布魯氏菌感染期間，BPE123存在于布氏小體的表面，它的N端含有25個氨基酸，可能是一種將其自身轉(zhuǎn)運至宿主細胞的信號肽。在幾種類型的細胞和小鼠模型中都發(fā)現(xiàn)BPE123缺失株和野生菌株的增殖能力并沒有明顯變化[36]。

表2 布魯氏菌T4SS分泌的15種效應(yīng)蛋白
Tab.2 The 15 effectors secreted by Brucella through T4SS

效應(yīng)蛋白Effectproteins氨基酸數(shù)目No．ofaminoacids保守區(qū)Conserveddomains宿主中的靶位點Targetswithinhosts功能FunctionsVceA105無未知未知VceC418脯氨酸含量高的區(qū)域Bip/Grp78激活非折疊蛋白應(yīng)答；誘導(dǎo)脯氨酸的炎性反應(yīng)RicA175碳酸酐酶區(qū)域Rab2調(diào)控囊泡的轉(zhuǎn)運；引起宿主細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)BtpA250Toll樣受體結(jié)構(gòu)域未知抑制Toll樣受體信號通路BtpB292Toll樣受體結(jié)構(gòu)域未知抑制Toll樣受體信號通路BspA191DUF2062區(qū)未知抑制宿主細胞分泌蛋白質(zhì)BspB187蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類結(jié)構(gòu)域未知抑制宿主細胞分泌蛋白質(zhì)BspF428GNAT家族的乙酰轉(zhuǎn)移酶區(qū)未知抑制宿主細胞分泌蛋白質(zhì)SepA130無未知抑制布氏小體與溶酶體的融合BspC137預(yù)測的依賴于Sec的信號肽區(qū)域未知未知BspE117卷曲螺旋區(qū)和TM區(qū)未知未知BPE123153載脂蛋白區(qū)未知未知BPE005153卷曲螺旋區(qū)未知未知BPE275253類Rhomboid區(qū)未知未知BPE0431553環(huán)核苷酸區(qū)未知未知

3 部分效應(yīng)蛋白參與的免疫應(yīng)答反應(yīng)

VceC是布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)分泌的重要效應(yīng)蛋白之一，可通過T4SS進入到宿主細胞內(nèi)發(fā)揮作用。但是VceC在宿主細胞內(nèi)參與免疫應(yīng)答的機制尚未清楚。張沾等[9]通過對VceC功能的初步研究，發(fā)現(xiàn)VceC能夠使細胞分泌NO，NO再與O2-形成活性氮對蛋白進行修飾，造成免疫細胞的毒性反應(yīng)。由此可推知，VceC可能引起了免疫細胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)，進而使宿主的免疫作用降低或喪失。

RicA的存在對布魯氏菌的增殖有阻礙作用，可參與布魯氏菌的胞內(nèi)運輸過程，但其他作用還有待研究。韓玉霞等[28]通過免疫印跡試驗證明了RicA的免疫原性很強。這也就不難理解RicA的免疫原性增強，導(dǎo)致宿主產(chǎn)生大量的抗體或引起致敏T淋巴細胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)進而干擾布魯氏菌的胞內(nèi)生存。

目前，很多細菌都存在含有TIR域的蛋白質(zhì)，比如大腸桿菌中的TcpC，沙門氏菌中的TlpA，這些蛋白具有抑制toll樣受體信號通路的作用[38-44]。研究表明，Btp1含有TIR域,且可以干擾人先天性免疫相關(guān)蛋白TLR-2和TLR-4信號通路，從而抑制樹突狀細胞的成熟。當敲除Btp1后樹突狀細胞表面的MHCII和CD80的表達會升高，進而布魯氏菌的免疫逃避受到破壞[32,45]，提示TIR域在布魯氏菌的免疫逃避中發(fā)揮了重要作用。

此外，孫志華等[46]構(gòu)建了BPE123的原核表達載體，并檢測出BPE123具有免疫原性，表明BPE123可刺激機體產(chǎn)生抗體或進行細胞免疫。劉來珍等[47]構(gòu)建了BMEI1069的原核表達載體，Western-blot檢測出其具有免疫原性，同時還發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-10和TNF-α的含量在加入BMEI1069蛋白后均升高，而當細菌在感染期中存在較高水平的復(fù)制時會引起TNF-α的含量減少，表明BMEI1069可能在細菌感染后期行使功能。Zhan Y等[48]研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌病的發(fā)生與小鼠體內(nèi)的TNF-α被抑制有關(guān)，而BEMI1069引起了TNF-α含量升高會抑制布魯氏菌內(nèi)吞小泡的形成，布魯氏菌受到溶菌酶和核內(nèi)體的殺傷后會阻礙其感染宿主細胞，表明BEMI1069可以干擾布魯氏菌對宿主細胞的侵入。

4 展 望

目前，我們對布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白發(fā)揮的免疫作用了解得比較少，因此對布魯氏菌效應(yīng)蛋白功能的鑒定有利于闡明T4SS的功能和作用機制。迄今為止，已鑒定的布魯氏菌T4SS分泌的效應(yīng)蛋白有15種，其中大多數(shù)效應(yīng)蛋白在布魯氏菌的致病機制尚不清楚。不同細菌T4SS分泌的效應(yīng)蛋白雖然序列相似，但其結(jié)構(gòu)、功能和作用機制、致病機理卻不盡相同。布魯氏菌是一種典型的胞內(nèi)致病菌，研究布魯氏菌T4SS的作用機制和其效應(yīng)蛋白有助于闡明胞內(nèi)菌的致病機理。

和其他細菌相比，目前對布魯氏菌T4SS以及其效應(yīng)蛋白的研究仍相對較少。根據(jù)目前的研究結(jié)果，未來以下研究可能是今后研究布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)以及相關(guān)分泌蛋白的重點方向： 1)對效應(yīng)蛋白的生化特性研究，包括定位其在宿主細胞的靶標部位以及與靶部位間作用的生化機制。研究效應(yīng)蛋白是否具有特征性的結(jié)構(gòu)域以及是否具有相關(guān)酶的活性，如激酶或磷酸酶活性等； 2)效應(yīng)蛋白的細胞生物學(xué)特性研究，包括他們對細菌在胞內(nèi)持續(xù)生存、細胞膜之間的對接、與宿主間的相關(guān)信號通路以及對布魯氏菌內(nèi)吞小泡轉(zhuǎn)運的調(diào)控等； 3)闡明效應(yīng)蛋白對布魯氏菌在宿主體內(nèi)毒力的影響，包括他們的必要性，在慢性感染中所扮演的角色，引起的炎癥反應(yīng)及這些效應(yīng)物是否能解釋布魯氏菌典型的胞內(nèi)生存方式等。研究這些效應(yīng)蛋白不僅有利于我們了解細菌的致病機理，而且對研究真核生物宿主細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)極為重要。由于缺乏適當?shù)拿庖邞?yīng)答反應(yīng)，宿主細胞無法抑制布魯氏菌的感染[49-50]。因此，研究布魯氏菌的效應(yīng)蛋白將有助于我們理解胞內(nèi)細菌抑制宿主免疫系統(tǒng)信號通路的機制。認清這些機制才能幫助科研人員進一步改進布病的治療方法以及為今后疫苗研制提供理論依據(jù)。

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ResearchadvanceonBrucellaIVsecretionsystemproteinsanditsimmuneresponse

XIAO Qi-cheng1, TIAN Yi-nan1, PENG Guang-neng1, LI Ping2, WEI Bin1, TU Rui1, DAN Jia-ming1, REN Zhi-hua1, ZHONG Zhi-jun1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;2.QionglaiAgricultureandForestryBureau,Qionglai611530,China)

Brucellais a facultative intracellular pathogen that causes infection in domestic animal and humans, mainly parasitizing in cells and macrophages of hosts.Brucellacan lead to abortion and sterility in animals. Meanwhile, it also causes arthralgia, weakness, undulat fever, hepatosplenomegaly and other symptoms in humans.Brucellarelies on immune escape mechanism in the confrontation with the host. It can helpBrucella"camouflage" to evade the identification of the immune system of the hosts and replicate within cells to persist to establish a long-term infection in the host. As a result of the existence of this mechanism, the treatment ofBrucellainfection is quite difficult. Type IV secretion system (T4SS) is a key virulence factor and it is essential forBrucellato survive in host cells. The effector proteins secreted by T4SS can help regulate the immune response againstBrucella. In this article, we reviewed the studies on related proteins of the type IV secretion system ofBrucellaand its immune response, especially the relationship between the secretions of effector proteins mediated by VirB operon and immunity of the host.

Brucella; secretory protein; immune response

Zhong Zhi-jun, Email: zhongzhijun488@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.015

國家重點研發(fā)計劃(No.2016YFD0501009)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No.31000548)；成都大熊貓繁育研究基金會項目(No.CPF2015-4)聯(lián)合資助

鐘志軍，Email:zhongzhijun488@126.com

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130；

2.邛崍市農(nóng)業(yè)和林業(yè)局，邛崍 611530

R378.5

A

1002-2694(2017)11-1029-07

Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0501009), the National Natural Science Foundation of China (No. 31000548) and the Chengdu Giant Panda Breeding Research Foundation (No. CPF2015-4)

2017-02-28編輯王曉歡