許雪梅，劉建

體外腫瘤細胞遷移和侵襲定量方法的建立

許雪梅，劉建

侵襲是惡性腫瘤最重要的特征之一。腫瘤細胞由其原發(fā)部位侵入淋巴管、血管或體腔，部分細胞被血液、淋巴液帶到另一部位或器官繼續(xù)生長，形成與原發(fā)瘤同樣類型的腫瘤，這一過程即為腫瘤的遷移和侵襲[1]。在腫瘤研究中，腫瘤細胞遷移和侵襲實驗是研究腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)特性的重要方法[2-3]，也是抗腫瘤藥物篩選的常用手段[4-6]。建立合適的腫瘤細胞遷移和侵襲模型，并建立簡便、準確的定量方法，對于腫瘤研究具有重要的意義[7]。

傳統(tǒng)的定量方法是將遷移或侵襲的細胞用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下對幾個代表性視野中的染色細胞進行拍照和計數(shù)[8-9]，耗時長、通量低、準確度差。本研究中，我們在傳統(tǒng)的模型基礎(chǔ)上，建立了一種結(jié)晶紫染色后進行醋酸脫色、酶標儀讀取吸光度值的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人纖維肉瘤細胞 HT-1080、小鼠成纖維細胞 NIH/3T3以及人乳腺癌細胞 MCF-7 均購自美國 ATCC；MEM 和DMEM 細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS、matrigel、transwell 細胞培養(yǎng)小室（8 μm 孔徑 PET 膜）、T-25 細胞培養(yǎng)瓶、96 孔透明板等均為康寧公司產(chǎn)品；結(jié)晶紫染料購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；醋酸購自國藥集團；SpectraMax M4 多功能酶標儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HT-1080 細胞用添加 10% 胎牛血清的MEM 進行常規(guī)培養(yǎng)。MCF-7 細胞用添加 10% 胎牛血清及 0.01 mg/ml 的人重組胰島素的 MEM 進行培養(yǎng)。NIH/3T3細胞用添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)。細胞每隔 2 ～3 天換液，在達到 80% ～ 90% 匯合度時進行傳代。

1.2.2 細胞遷移和侵襲實驗 matrigel 使用前置于冰上，于 4 ℃ 冰箱融化過夜。所有接觸 matrigel 的試劑、耗材、器皿等都置于冰上預(yù)冷。將 matrigel 用無血清培養(yǎng)液稀釋至 200 μg/ml，上下吹打混勻。取 100 μl 稀釋后的 matrigel包被溶液，小心加入到侵襲組的 transwell 細胞培養(yǎng)小室中間。將包被 matrigel 的 transwell 置于 37 ℃ 孵育 1 h 以上。遷移組的小室不用包被 matrigel。HT-1080、NIH/3T3 和MCF-7 細胞用胰酶消化，離心收集，用不含 FBS 的培養(yǎng)液重懸。細胞計數(shù)，并用無血清培養(yǎng)液稀釋至 5 × 105個/ml。取出包被好 matrigel 的 transwell 小室，吸棄上層殘留的液體。遷移組和侵襲組均接種 150 μl 細胞懸液至 transwell 小室內(nèi)，細胞終密度為 75 000/孔。實驗組向下室中加入 800 μl含血清的培養(yǎng)液，對照組中加入 800 μl 不含血清的培養(yǎng)液。每組 4 個復(fù)孔。置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出 transwell 小室，PBS 洗 2 次，用棉簽輕輕擦除上室膜上的細胞。將小室置于結(jié)晶紫染料中室溫染色 10 min，用 PBS 洗滌 2 ～ 3 次，直至洗滌液不再有顏色為止，晾干。

1.2.3 手動計數(shù)法定量細胞遷移和侵襲率 顯微鏡下對遷移和侵襲的細胞進行觀察并拍照，隨機選取 5 個視野，計數(shù)一定面積下結(jié)晶紫染色的細胞。將單個視野下計數(shù)細胞的平均值除以單個視野的面積，再乘以 transwell 小室的總生長面積，即得到遷移或侵襲的總細胞數(shù)。用遷移或侵襲的總細胞數(shù)除以接種的初始細胞數(shù)，即得到遷移率和侵襲率。

1.2.4 標準曲線的繪制 取 HT-1080、NIH/3T3 和MCF-7 細胞，消化、計數(shù)，分別用培養(yǎng)液稀釋成一系列密度，接種至 96 孔板中，每個密度 4 個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜。細胞用結(jié)晶紫室溫染色 10 min 后，PBS 洗滌 2 ～ 3 次。醋酸用雙蒸水稀釋至 33%（v/v）。取 200 μl 33% 醋酸加入到 96 孔板中，室溫振蕩 10 min，使染色的細胞充分脫色。洗脫液用酶標儀讀取 590 nm 處吸光度值。原始數(shù)據(jù)扣除空白組（不含細胞、同樣處理）后，與對應(yīng)的細胞接種數(shù)進行線性回歸，繪制細胞數(shù)和吸光度的標準曲線，并得到針對該細胞系的回歸直線方程。

1.2.5 光吸收法定量細胞遷移和侵襲率 將結(jié)晶紫染色后的 transwell 小室置于 24 孔板中，每孔加入 400 μl 33%醋酸溶液，室溫振蕩 10 min，充分洗脫與細胞結(jié)合的結(jié)晶紫。轉(zhuǎn)移 200 μl 洗脫液至 96 孔透明板中，用酶標儀讀取590 nm 處的吸光度值。將遷移和侵襲實驗組的吸光度值減去空白組后，根據(jù)標準曲線的回歸直線方程換算成細胞數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù) 2，得到遷移或侵襲的總細胞數(shù)。用遷移或侵襲的總細胞數(shù)除以接種的初始細胞數(shù)，即得到遷移率和侵襲率。

2 結(jié)果

2.1 不同細胞的遷移和侵襲特性

3 種不同的細胞株 HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 進行細胞遷移和侵襲實驗，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察結(jié)果如圖 1 所示。在 10% FBS 的誘導(dǎo)下，HT-1080 細胞能夠降解 matrigel 并穿透膜上的孔進入到 transwell 下室，具有很強的侵襲能力。NIH/3T3 細胞在無 matrigel 時能夠遷移到下室，而在有 matrigel 作為屏障時不能穿透，表明該細胞具有很強的遷移能力，但侵襲能力弱。MCF-7 在有無matrigel 時均不能穿透到下室，表明該細胞遷移力很弱。在沒有 FBS 誘導(dǎo)時，3 種細胞均不遷移或侵襲。空白組上的黑色小點為顯微鏡下觀察到的 transwell 上的微孔。

圖 1 顯微鏡下 HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 細胞的遷移和侵襲染色結(jié)果（比例尺：200 μm）

圖 2 手動計數(shù)法選取的一個隨機視野

2.2 手動計數(shù)法定量細胞遷移和侵襲率

本次實驗采用的 transwell 小室的生長面積為 0.33 cm2。計數(shù)所選取的視野為邊長 200 μm 的正方形，單個視野的面積為 0.0004 cm2，如圖 2 所示的白色線框所選范圍。當細胞數(shù)量較多時，計數(shù)工作量大，同時細胞和細胞之間形成交叉重疊，計數(shù)時較難分辨。手動計數(shù)通過將單個視野的細胞數(shù)換算成一個 transwell 小室的總細胞數(shù)后，除以接種細胞數(shù)，得到細胞遷移率和侵襲率，如圖 3 所示，結(jié)果與顯微鏡下觀察到的遷移和侵襲染色結(jié)果所反映的不同細胞遷移和侵襲特性一致。

圖 3 手動計數(shù)法的 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）細胞遷移率和侵襲率（***P ＜ 0.001）

2.3 結(jié)晶紫標準曲線

通過不同細胞數(shù)對應(yīng)的醋酸洗脫液OD590nm數(shù)值，進行線性回歸，繪制得到標準曲線（圖 4）。HT-1080 細胞的回歸方程：y = 1.207 × 10-5x + 0.007287（r2= 0.9925）；NIH/3T3 細胞的回歸方程：y = 0.8613 × 10-5x - 0.00307（r2= 0.9989）；MCF-7 細胞的回歸方程：y = 0.9383 × 10-5x -0.004072（r2= 0.9943）。

2.4 光吸收法定量細胞遷移和侵襲率

HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 遷移和侵襲細胞，結(jié)晶紫染色后脫色，醋酸洗脫液呈現(xiàn)出與細胞染色結(jié)果一致的藍紫色（圖 5），而細胞上不再顯現(xiàn)顏色。洗脫液測定 590 nm吸光度值，扣除空白組后，將吸光度值根據(jù)對應(yīng)細胞的線性回歸方程換算成細胞數(shù)。由于 24 孔板侵襲實驗洗脫液體積是 96 孔板標準曲線洗脫液的兩倍，細胞數(shù)乘以稀釋倍數(shù)2，即得到遷移或侵襲的總細胞數(shù)，再除以接種的起始細胞數(shù)，即得到細胞遷移率和侵襲率（圖 6），結(jié)果與手動計數(shù)法的結(jié)果及顯微鏡下觀察結(jié)果一致。

圖 4 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）細胞結(jié)晶紫染色標準曲線

圖 5 遷移和侵襲細胞結(jié)晶紫染色的醋酸洗脫液

圖 6 結(jié)晶紫洗脫液光吸收法的 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）細胞遷移率和侵襲率（***P ＜ 0.001，**P ＜ 0.005）

2.5 遷移和侵襲定量實驗流程的建立

圖 7 細胞侵襲實驗結(jié)晶紫光吸收法定量流程

采用 transwell 細胞培養(yǎng)小室成功地建立了一種新的基于結(jié)晶紫光吸收的遷移和侵襲定量實驗流程（圖 7）。transwell 包被（不包被）matrigel 之后，用無血清培養(yǎng)液接種細胞至上室，在下室中用 10% FBS 誘導(dǎo)。無 matrigel 包被時，遷移性的細胞穿透 transwell 上的多孔膜進入下室；有 matrigel 包被時，侵襲性的細胞降解 matrigel 后進入下室。下室細胞用結(jié)晶紫染色后，可采用傳統(tǒng)手動計數(shù)的方法進行定量，也可采用醋酸對染色細胞進行脫色，洗脫液用酶標儀讀取 590 nm 處的吸光度值，即可對遷移和侵襲的細胞進行定量。

3 討論

在腫瘤侵襲機制研究以及抗腫瘤藥物篩選中，細胞遷移和侵襲實驗都是應(yīng)用非常廣泛的體外模型。遷移是指細胞在遷移信號或物質(zhì)濃度梯度的作用下從一個位置到另一個位置的運動。而侵襲則需要細胞首先通過酶促降解細胞外基質(zhì)而通過這一屏障[10]。

康寧 transwell 小室是一種常用的研究腫瘤細胞遷移和侵襲的工具[11]。Transwell 小室上的多孔膜將細胞生長的空間分成兩個部分，膜上面的空間稱為上室，膜下面稱為下室。將細胞接種到上室內(nèi)，由于多孔膜的通透性，在下室培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分會誘導(dǎo)上室細胞穿過多孔膜進入下室，從而可以很方便地研究細胞的遷移。而侵襲可通過在transwell 上包被一層康寧 matrigel 進行。Matrigel 是從小鼠肉瘤中提取的可溶性基質(zhì)蛋白，可以模擬細胞侵襲中的細胞外基質(zhì)屏障[12-13]。細胞需要首先分泌基質(zhì)金屬蛋白酶來消化屏障，然后才能通過多孔膜運動到下室，這一過程即為侵襲。在遷移和侵襲實驗中，細胞接種密度、誘導(dǎo)物濃度、遷移和侵襲時間、屏障濃度等是實驗中至關(guān)重要的因素，需根據(jù)不同的實驗進行優(yōu)化[14]。

本研究采用 3 種不同類型的細胞驗證了實驗的有效性。低遷移性的 MCF-7 細胞表明無自發(fā)性的細胞遷移發(fā)生；低侵襲性的 NIH/3T3 細胞驗證了 matrigel 模擬組織屏障阻止侵襲的有效性；侵襲性的 HT-1080 細胞驗證了侵襲實驗的有效性。

細胞結(jié)晶紫染色是廣泛應(yīng)用于遷移和侵襲的檢測方法，該方法的定量通常是在顯微鏡下對幾個代表性的視野中被染色的細胞進行拍照和計數(shù)，但手工計數(shù)耗時長、通量低、工作量大，隨機選取的幾個視野不能準確地反映所有的情況，同時細胞密度大時的交叉重疊會造成計數(shù)的不準確，使得該方法的應(yīng)用受到限制。

在本研究的細胞遷移和侵襲實驗中，我們在傳統(tǒng)的結(jié)晶紫染色后，采用 33% 醋酸將細胞結(jié)合的結(jié)晶紫染料洗脫下來，通過測量洗脫液的吸光度值，可以對細胞遷移和侵襲進行定量。結(jié)合細胞數(shù)-吸光度值標準曲線，可以計算出細胞遷移和侵襲的百分率。該方法可以很方便地在常規(guī)結(jié)晶紫染色后進行，將細胞的手動計數(shù)轉(zhuǎn)換成均質(zhì)溶液吸光度值的測量，消除了人為判斷的不準確性，免除了繁瑣乏味的手工計數(shù)步驟，簡便易行，結(jié)果與手工計數(shù)方法具有一致性，是一種有效的細胞遷移和侵襲實驗的定量方法。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.013

201206 上海，康寧生命科學亞洲技術(shù)中心

劉建，Email：liuj11@corning.com

2017-08-30