胡澤斌，曲守方，孫彬裕，楊振，黃杰

人巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測試劑盒國家監(jiān)督抽驗(yàn)質(zhì)量評價(jià)

胡澤斌，曲守方，孫彬裕，楊振，黃杰

人類巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，CMV），屬皰疹病毒科，乙組皰疹亞科，分子量為 150 × 106D，是直徑為 200 nm 的線狀雙鏈 DNA 病毒，人是其唯一的宿主。巨細(xì)胞病毒的主要感染途徑是與被感染病人接觸，包括接觸被感染病人的唾液、生殖器分泌物、尿液和乳汁，同時(shí)也可通過胎盤傳播或發(fā)生醫(yī)源性傳染[1-3]。CMV 是新生兒先天性致畸的重要病原微生物之一，它對胎兒的危害比風(fēng)疹病毒要大，最易引起胎兒、新生兒、嬰兒的急性、慢性感染和遲發(fā)后遺癥。原發(fā)性孕期感染 CMV 的胎兒 80% 可出現(xiàn)智力低下，視力受損，聽力喪失等癥狀，特別是引起嬰兒的巨細(xì)胞包涵體?。–I），可致患兒多個(gè)系統(tǒng)、多個(gè)器官受損，病死率為 10% ～ 20%[4]。我國孕期婦女原發(fā)感染 CMV 的比例為 3% ～ 4%，而原發(fā)感染導(dǎo)致胎兒受到影響的幾率為 50%，我國每年出生上千萬嬰兒，因此及早檢測 CMV 感染對我國優(yōu)生優(yōu)育政策的實(shí)施具有重要意義[5-7]。

目前國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的人巨細(xì)胞病毒IgG 抗體檢測試劑盒主要是基于酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法和免疫層析法，還包括電化學(xué)發(fā)光法、時(shí)間分辨免疫熒光法和多重微珠流式免疫熒光法。該類試劑盒數(shù)量繁雜，且生產(chǎn)廠商眾多，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，為查找巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體檢測試劑盒的監(jiān)督隱患，全面了解此類產(chǎn)品的質(zhì)量現(xiàn)狀，切實(shí)加強(qiáng)對此類產(chǎn)品的監(jiān)管，根據(jù)《食品藥品監(jiān)管總局辦公廳關(guān)于印發(fā)體外診斷試劑抽驗(yàn)工作方案的通知》（食藥監(jiān)辦械監(jiān)[2015]63 號）開展了監(jiān)督抽驗(yàn)工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 M2 SpectraMax 酶標(biāo)儀購自 Molecular Devices 公司；DEM-3 洗板機(jī)購自北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司；BK-L96C 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司產(chǎn)品；JETLIA-962 發(fā)光免疫分析儀為北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司產(chǎn)品；Maglumi 2000 Plus 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測定儀為深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 參考品 人巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體國家參考品（批號：36004-201101）由 19 份樣品組成，分別是：10 份陽性參考品 P1-P10；5 份陰性參考品 N1-N5；1 份重復(fù)性參考品 R 和 3 份最低檢測限參考品 L1-L3，由中國食品藥品檢定研究院提供；企業(yè)參考品均由各自企業(yè)提供。

1.1.3 樣品 按照國家監(jiān)督抽驗(yàn)工作統(tǒng)籌安排，各?。ɑ蚴?、區(qū)）食品藥品監(jiān)管部門組織實(shí)施其行政區(qū)域內(nèi)的診斷試劑的抽樣、樣品寄送和信息錄入等工作。本次抽驗(yàn)共收到巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體檢測試劑盒 15 批次，涉及 15 家生產(chǎn)企業(yè)，全部為國產(chǎn)試劑。試劑盒全部抽自生產(chǎn)企業(yè)。15 批次試劑盒中，酶聯(lián)免疫法 11 批次，化學(xué)發(fā)光法 4 批次；符合抽樣規(guī)定的試劑盒 15 批次，退樣 0 批次，抽樣產(chǎn)品信息詳細(xì)數(shù)據(jù)見表 1。

1.2 方法

法定檢驗(yàn)：依據(jù)企業(yè)產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)，采用注冊標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的企業(yè)參考品或國家參考品對各自試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括陽性符合率、陰性符合率、檢出限和重復(fù)性，4 個(gè)項(xiàng)目全部符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定判定為合格，如有任意項(xiàng)判定不合格，本次抽驗(yàn)綜合結(jié)論為不合格。各項(xiàng)目要求參見各自的產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按各待測的試劑盒說明書進(jìn)行。如果企業(yè)產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定使用企業(yè)參考品或國家參考品進(jìn)行檢測，則根據(jù)國家參考品的檢測結(jié)果進(jìn)行是否合格的判定。

探索性研究：依據(jù) YY/T1236-2014《巨細(xì)胞病毒IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）》的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，采用人巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體國家參考品（批號：36004-201101）對各試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目和判定標(biāo)準(zhǔn)同法定檢驗(yàn)。各項(xiàng)目要求如：待檢試劑盒檢測 10 份陽性參考品，應(yīng)不得出現(xiàn)假陰性（準(zhǔn)確性/陽性符合率）；檢測 5 份陰性參考品，應(yīng)不得出現(xiàn)假陽性（特異性/陰性符合率）；3 份最低檢測限參考品，應(yīng)均能檢出（檢測限/檢出限/靈敏度）；批內(nèi)精密度變異系數(shù)（CV%）不大于 15.0%（重復(fù)性/精密性）。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按各待測試劑盒的說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 法定檢驗(yàn)

按照企業(yè)產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，如果企業(yè)產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了使用企業(yè)參考品或國家參考品，則依據(jù)國家參考品的檢驗(yàn)結(jié)果判定是否合格。本次抽驗(yàn) 15 批次試劑中有13 批次的注冊標(biāo)準(zhǔn)要求使用企業(yè)參考品，這 13 批次巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體檢測試劑盒檢測合格，其余 2 批次的注冊標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)國家參考品的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定的，2 批次試劑不合格。本次法定檢驗(yàn)的合格率為 86.7%（13/15）；2 批次試劑不合格試劑中，一家試劑盒的不合格項(xiàng)目是“國家陰性參考品符合率”不符合規(guī)定（有部分參考品檢出陽性），以及“國家陽性參考品符合率”也不符合規(guī)定（有部分參考品檢出陰性）；另一家試劑盒的不合格項(xiàng)目是“國家陰性參考品符合率”不符合規(guī)定（有部分參考品檢出陽性）。

表 1 抽樣的人巨細(xì)胞病毒（HCMV）IgG 抗體檢測試劑盒

2.2 探索性研究

使用巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體國家參考品，按照巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體檢測試劑（盒）行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) YY/T1236-2014 對15 個(gè)廠家的 15 個(gè)批次的試劑盒進(jìn)行檢測，所有項(xiàng)目均合格的試劑有 10 批次，合格率僅為 66.7%（10/15），不合格的產(chǎn)品有 5 個(gè)廠家的 5 批次，不合格率達(dá)到了 33.3%。探索性研究不合格項(xiàng)目的具體情況見表 2。

表 2 抽樣試劑盒進(jìn)行探索性研究結(jié)果不合格項(xiàng)列表

3 討論

巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體檢測試劑屬于三類高風(fēng)險(xiǎn)的體外診斷試劑，在臨床應(yīng)用中其準(zhǔn)確性（陽性符合率）、特異性（陰性符合率）、檢測限（靈敏度）、重復(fù)性都是該類試劑盒的質(zhì)量控制關(guān)鍵指標(biāo)。準(zhǔn)確性或陽性符合率、特異性或陰性符合率項(xiàng)目，是在進(jìn)行性能評價(jià)時(shí)，檢測出的陰陽性結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的一致性程度，反映了試劑的基本特性。檢測限或靈敏度是重要的分析性能之一，反映試劑可檢測的最低分析濃度。重復(fù)性是對樣品做多次測定，通過這些測定值的精密度，得到試劑測定能力是否具有重現(xiàn)性。

中國食品藥品檢定研究院在 2011 年研制了巨細(xì)胞病毒 IgG 抗體國家參考品[8]（批號：36004-201101），我院起草的《巨細(xì)胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）》的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，已在 2014 年 6 月份通過國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)并頒布，標(biāo)準(zhǔn)編號為：YY/T 1236-2014。該標(biāo)準(zhǔn)于 2015年 7 月 1 日正式實(shí)施，適用于定性檢測人體血清/血漿中巨細(xì)胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）（酶聯(lián)免疫法）、巨細(xì)胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）（化學(xué)發(fā)光法）、巨細(xì)胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）（免疫熒光法）、巨細(xì)胞病毒 IgG/IgM 抗體檢測試劑（盒）（免疫印跡法）等，其技術(shù)條款的設(shè)計(jì)基本上也是參考國家參考品的情況，包括外觀、準(zhǔn)確性（陽性符合率）、特異性（陰性符合率）、重復(fù)性（精密度）、檢測限。

通常在無行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國家參考品情況下，企業(yè)產(chǎn)品注冊檢驗(yàn)只能采用企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)；如果有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國家參考品，則檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)主動(dòng)采用它們進(jìn)行注冊檢驗(yàn)，通過一把尺子來評判試劑質(zhì)量更為公正和公平。但是由于此產(chǎn)品的國家參考品及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)遲于大部分企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，故大部分企業(yè)在產(chǎn)品注冊檢驗(yàn)時(shí)并未采用國家參考品進(jìn)行檢驗(yàn)[9]。

此次監(jiān)督抽驗(yàn)，采用企業(yè)參考品檢測，試劑合格率達(dá)100.0%（15/15），而采用國家參考品檢測，合格率下降了33.3%，僅為 66.7%（10/15）。這就意味著企業(yè)參考品控制產(chǎn)品質(zhì)量的有效性值得商榷。通常，企業(yè)參考品信息通過提供資料證明，檢測機(jī)構(gòu)無法核實(shí)企業(yè)參考品是否屬實(shí)，因此按照企業(yè)注冊產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，在判斷產(chǎn)品合格存在著一定的風(fēng)險(xiǎn)。

國家參考品“陰性參考品符合率”項(xiàng)目不符合規(guī)定即假陽性，假陽性產(chǎn)生原因可能是：①樣本中存在干擾物質(zhì)造成，如 RF 因子等；②其他類型抗體如 IgM、不同亞型的IgG 以及同種屬病原體的交叉反應(yīng)等；③分析性能研究中正常參考人群的選擇出現(xiàn)偏差，其閾值設(shè)定不合理；④生產(chǎn)工藝存在缺陷，比如原材料抗體篩選不嚴(yán)格，親和力以及抗體反應(yīng)性、特異性未充分驗(yàn)證，包被和封閉等工藝需要改進(jìn)等，標(biāo)記抗體的濃度篩選需要改進(jìn)等；⑤包被抗原的因素：如果包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含有表達(dá)載體的一些序列，有可能與血清中其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生假陽性。另外抗原的純度對特異性也有影響，目前抗原多是經(jīng)過大規(guī)模表達(dá)后需要經(jīng)過破碎細(xì)胞、鹽析、粒子交換等分離純化步驟才能達(dá)到一定純度。如抗原中混有其他雜蛋白，血清中的抗體可能與這些雜蛋白反應(yīng)產(chǎn)生假陽性。國家參考品“陽性參考品符合率”項(xiàng)目不符合規(guī)定即是漏檢/假陰性結(jié)果，假陰性產(chǎn)生的主要原因可能是：①分析性能研究中正常參考人群的選擇出現(xiàn)偏差，其閾值設(shè)定不合理，設(shè)定閾值較高，使弱陽性樣本檢測為陰性；②肝素或者 EDTA 等抗凝處理對樣本的影響，EDTA、酶抑制劑可以抑制辣根過氧化物酶的活性，造成假陰性。重復(fù)性參考品實(shí)際為陽性樣本，出現(xiàn)假陰性的原因同“陽性參考品符合率項(xiàng)目不符合規(guī)定的原因”，CV值偏高不符合規(guī)定可能由于企業(yè)生產(chǎn)工藝的某些環(huán)節(jié)如分裝、混勻步驟不很穩(wěn)定，造成同一批次的試劑盒的均一性較差。

此次抽驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)企業(yè)提供的資料存在以下問題：①缺項(xiàng)問題。由于各企業(yè)產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)不一樣，各檢測機(jī)構(gòu)對于該產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的理解不一樣，因此在檢測項(xiàng)目的要求方面也不一樣。例如，有 1 家企業(yè)在產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn)中沒有檢測限的要求而只有分析靈敏度檢測，即測定零點(diǎn)校準(zhǔn)品 20 次，然后測定分析靈敏度。我們認(rèn)為該試劑盒是定性試劑盒，不適合通過做分析靈敏度體現(xiàn)檢測限，所以建議在企業(yè)參考品中提供相應(yīng)的檢測限參考品。②注冊標(biāo)準(zhǔn)要求與說明書不一致。有 1 家企業(yè)在產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中將“OD 值”明確要求如下：“試劑盒中的校正液檢測 OD 值應(yīng)在規(guī)定范圍。陰性校正液 OD 不高于 0.250，臨界校正液 OD 值為 0.600 ～1.300，陽性校正液 1#的 OD 值應(yīng)在臨界校正液和陽性校正液 2#之間，陽性校正液 2#的 OD 值不低于 1.300”，但是說明書中僅僅在“檢驗(yàn)結(jié)果的解釋”中提到“陰性對照的檢測結(jié)果須為陰性，陽性對照的檢測結(jié)果須為陽性，陽性校正液 1#的 OD 值須介于臨界校正液與陽性校正液2#之間，否則檢測結(jié)果不可靠，不應(yīng)出具檢測報(bào)告”。顯然技術(shù)對 OD 值的要求明顯嚴(yán)格于說明書，那么到底哪個(gè)是實(shí)驗(yàn)成立的前提呢？OD 值界定的意義何在？③說明書表述不盡規(guī)范。有 2 家在說明書的“檢驗(yàn)方法”中預(yù)留空白孔/空白對照，讀值時(shí)單波長測定 OD 值，但是并沒有說明空白孔調(diào)零；另有 4 家在說明書中未說明應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)終止后多長時(shí)間內(nèi)讀取 OD 值；還有 1 家企業(yè)說明書中的檢驗(yàn)方法未寫明陽性對照及臨界對照是加單孔還是復(fù)孔，但計(jì)算實(shí)例中是按照復(fù)孔求平均值。

實(shí)行醫(yī)療器械監(jiān)督抽驗(yàn)是器械執(zhí)法的一項(xiàng)重要技術(shù)活動(dòng)，其目的是確保人民群眾用械質(zhì)量安全、可靠、有效；有利于促進(jìn)企業(yè)整改達(dá)標(biāo)，完善管理，提高產(chǎn)品質(zhì)量，其意義在于提高全社會(huì)對醫(yī)療器械質(zhì)量實(shí)行科學(xué)監(jiān)督抽驗(yàn)重要性的認(rèn)識(shí)。本次監(jiān)督抽驗(yàn)設(shè)計(jì)的抽樣企業(yè)數(shù)量不多，也沒有進(jìn)口企業(yè)，而且僅僅從生產(chǎn)企業(yè)這一個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了抽樣，建議今后加大抽驗(yàn)力度，完善和優(yōu)化抽驗(yàn)?zāi)Ｊ?，使抽?yàn)結(jié)果更能反映產(chǎn)品的真實(shí)質(zhì)量狀況。針對本次監(jiān)督抽驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問題，筆者建議將體外診斷試劑監(jiān)督抽驗(yàn)工作持續(xù)深入進(jìn)行下去，持續(xù)監(jiān)測產(chǎn)品的性能，深入分析產(chǎn)品問題原因，繼續(xù)探討使用國家參考品作為統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，督促企業(yè)不斷改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量，為公眾用械安全保駕護(hù)航。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.014

國家自然科學(xué)基金（81472396）

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所

黃杰，Email：jhuang5522@126.com

2017-08-17