郭雷鳴，丁高峰，徐文才，陳淅涓，蔣月，陸寓非

人S100A8和S100A9原核載體的構(gòu)建、鑒定及蛋白純化

郭雷鳴，丁高峰，徐文才，陳淅涓，蔣月，陸寓非

目的分別構(gòu)建人 S100A8（hS100A8）和 S100A9（hS100A9）的 PET-28a 原核表達載體，并純化 hS100A8和 hS100A9 蛋白，為進一步研究 hS100A8 和 hS100A9蛋白的分子生物學(xué)功能奠定實驗基礎(chǔ)。

方法用帶酶切位點的引物從 hS100A8 和 hS100A9 的真核表達載體擴增 hS100A8 和 hS100A9 基因片段，用相同的限制性內(nèi)切酶雙酶切 PCR 產(chǎn)物和 pET-28a 質(zhì)粒。將兩者用 T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞 DH5α，提取質(zhì)粒進行鑒定。將構(gòu)建成功的 pET28a-hS100A8 和pET28a-hS100A9 分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 BL21，誘導(dǎo)蛋白表達，將等量純化蛋白在一定鈣離子濃度下室溫孵育 30 min，通過 SDS-PAGE 和 Western blot 驗證異源二聚體是否形成。

結(jié)果正確擴增出 hS100A8 和 hS100A9 基因，重組質(zhì)粒pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9 構(gòu)建成功，純化后在室溫孵育后可形成異源二聚體。

結(jié)論hS100A8 和 hS100A9 蛋白可以在體外形成異源二聚體，為探討其生物學(xué)作用奠定理論基礎(chǔ)。

鈣粒蛋白 A； 鈣粒蛋白 B； 基因表達

hS100A8 和 hS100A9 屬于 S100 家族的成員，是細胞內(nèi)小分子量鈣結(jié)合蛋白，在細胞內(nèi)/外發(fā)揮多種生物學(xué)功能，在炎癥相關(guān)癌變研究領(lǐng)域中作用機制多有研究，它們在癌變的起始、促進和演變的每一階段均發(fā)揮著重要作用[1]。hS100A8 和hS100A9 在細胞內(nèi)的表達具有組織特異性[2]，是髓系細胞分化過程中表達的具有免疫原性的蛋白質(zhì)[3]，在粒細胞和單核細胞中的表達量較高，主要定位在胞漿，兩者常以鈣離子依賴方式形成異源二聚體hS100A8/A9[4]。hS100A8/A9 是細胞內(nèi)發(fā)揮作用的主要形式[5]，起著促進細胞趨化反應(yīng)、抗菌、抑制多種正常細胞（成纖維細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等）和腫瘤細胞（白血病細胞、淋巴瘤細胞、乳腺癌細胞等）生長的作用[6]。hS100A8/A9 作為重要的致炎介質(zhì)參與急性、慢性炎癥反應(yīng)，在多種腫瘤細胞和浸潤的免疫細胞中均有表達，具有致炎因子作用[7]。同時，可與多不飽和脂肪酸花生四烯酸（arachidonic acid，AA）特異性結(jié)合形成hS100A8/A9-AA復(fù)合體，并作為轉(zhuǎn)運蛋白將 AA轉(zhuǎn)運至靶細胞，參與 AA 細胞代謝通路[8]，hS100A8/A9 的異常表達在慢性炎癥相關(guān)的腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用[9]。

hS100A8 和 hS100A9 即是免疫細胞產(chǎn)生的炎性因子，也是促凋亡因子，其作用機制十分復(fù)雜。盡管有關(guān) hS100A8 和 hS100A9 研究較多，但它們潛在的生理和病理意義還不甚明確。因此，我們構(gòu)建 hS100A8 和 hS100A9 原核表達載體，旨在制備純化的 hS100A8 和 hS100A9 蛋白，為進一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒 大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3）、質(zhì)粒 pET28a 由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微免教研室提供；真核載體 pcDNA3.1-hS100A8-Myc和 pcDNA3.1-hS100A9-Flag 由德國癌癥研究中心Mayer 教授饋贈。

1.1.2 主要試劑 PCR 所用試劑、DNA 連接試劑盒、DNA marker 和限制性內(nèi)切酶BamH I 和XhoI 購自 Fermentas 公司；膠回收和 DNA 純化回收試劑盒購自北京 TransGen 公司；抗 hS100A8抗體 Calgranulin A（C-19）、抗 hS100A9 抗體Calgranulin B（C-19）、抗 hS100A8/A9 抗體Calgranulin A/B（27E10）均購自美國 Santa Cruz Biotechnology 公司；羧芐青霉素和卡那霉素、Ni-NTA His Bind 樹脂購自德國 Novagen 公司；IPTG 購自美國 Sigma 公司；DAB 顯色試劑盒購自北京博士德生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 hS100A8 和 hS100A9 原核表達載體構(gòu)建1.2.1.1 PCR 擴增 hS100A8 和 hS100A9 基因片段 將真核表達載體 pcDNA3.1-hS100A8 和pcDNA3.1-hS100A9 分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞大腸桿菌 DH5α，接種于含 60 μg/ml 羧芐青霉素的 LB平板，37 ℃ 過夜培養(yǎng)，挑選單個菌落，用 10 ml LB細菌培養(yǎng)基，加入羧芐青霉素（終質(zhì)量濃度是60 μg/ml），37 ℃、270 r/min 于空氣浴搖床過夜后提取質(zhì)粒，測取質(zhì)粒濃度后，-20 ℃ 保存待用。

以質(zhì)粒 pcDNA3.1-hS100A8 為模板設(shè)計含BamH I/XhoI 酶切位點的引物：上游引物：5' TCA GGATCC ATGTTGACCGAGCTGGAGAAAGCCT 3'（下劃線為BamH I 酶切位點），針對 hS100A8 片段的起始密碼區(qū)；下游引物：5' CCGCTCGAG AG ACTCTTTGTGGCTTTCTTCA 3'（下劃線為XhoI酶切位點），針對載體的 56 ～ 334 bp 片段。以質(zhì)粒pcDNA3.1-hS100A9 為模板設(shè)計含BamH I/XhoI酶切位點的引物：上游引物 5' TCAGGATCC A TGACTTGCAAAATGTCGCAGCTGG 3'（下劃線為BamH I 酶切位點），針對 hS100A9 片段的起始密碼區(qū)；下游引物：5' CCGCTCGAG TCCGGGG

GTGCCCTCCCCGAG 3'（下劃線為XhoI 酶切位點），針對載體的 46 ～ 387 bp 片段。引物由上海生工公司合成。以提取的純化質(zhì)粒為模板，PCR擴增 hS100A8 和 hS100A9 目的片段，具有hS100A8 和 hS100A9 基因片段和BamH I 及XhoI 兩個酶切位點，產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA 回收試劑盒回收 hS100A8 和hS100A9 片段。

1.2.1.2 原 核 載 體 pET28a-hS100A8 和pET28a-hS100A9 的構(gòu)建 用BamH I 和XhoI分別雙酶切 hS100A8 和 hS100A9 片段及 pET28a質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后用 DNA 連接試劑盒將hS100A8 和 hS100A9 片段分別與 pET28a 連接，構(gòu)建成原核表達載體，命名為 pET28a-hS100A8 和pET28a-hS100A9。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞大腸桿菌 DH5α，接種于含 50 μg/ml 卡那霉素的 LB平板，37 ℃ 過夜培養(yǎng)，挑選單菌落，再次涂布在含50 μg/ml 卡那霉素的 LB 平板進行分區(qū)二次抗生素篩選，37 ℃ 過夜培養(yǎng)，分別挑選 pET28a-hS100A8和 pET28a-hS100A9 的 20 個生長良好的菌落進行熱裂解提取質(zhì)粒，并將提取的質(zhì)粒做 PCR 鑒定，挑取擴增出目的條帶的菌落，加入 10 ml 含 50 μg/ml卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基，37 ℃、280 r/min 搖床培養(yǎng)過夜后，用堿裂解法提取質(zhì)粒，并用BamH I 和XhoI 進行雙酶切鑒定，同時送北京鼎國生物公司進行測序。

1.2.2 hS100A8 和 hS100A9 蛋白純化及鑒定

1.2.2.1 誘導(dǎo) hS100A8 和 hS100A9 蛋白的表達 將原核表達載體 pET28a-hS100A8 和pET28a-hS100A9 分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21 菌株，涂含卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基平板 37 ℃過夜，挑取分隔良好的單個菌落，加入 8 ml 含50 μg/ml 卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基，37 ℃、280 r/min搖床過夜，第 2 天取新?lián)u菌管，加入含同樣抗生素的 LB 培養(yǎng)基 100 ml，37 ℃、280 r/min 空氣搖床振搖培養(yǎng) 2 ～ 3 h，直至細菌達到對數(shù)生長期即菌液OD600= 0.6 ～ 0.7 時開始，分成 3 組，分別用0.4、0.7、1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)，每組 3 支，分別于 16、24、37 ℃ 空氣浴搖床振搖，選擇最佳培養(yǎng)條件。按照 1 mmol/L IPTG、16 ℃ 誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h 的最佳培養(yǎng)條件，大規(guī)模誘導(dǎo)細菌表達后，取2 ml 菌液，4 ℃、4 000 r/min 離心 10 min，棄上清，用預(yù)冷的 40 μl 細菌裂解液進行重懸，并用超聲裂解細菌，再于 0 ℃、12 000 r/min 離心 30 s，取 40 μl 上清，加入 5 × SDS 加樣緩沖液 10 μl，沉淀部分加入 5 × SDS 加樣緩沖液 10 μl，100 ℃煮沸 10 min。分別取 30 μl 進行 SDS-PAGE 電泳分析目的蛋白，鑒定兩種蛋白是否以可溶形式表達。

1.2.2.2 純化 hS100A8 和 hS100A9 蛋白 收集經(jīng)擴增的菌體，加入裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，0.2 % SDS，0.1%溴酚藍，10% 甘油），待菌體裂解后，收集菌液，4 ℃、12 000 r/min 離心 20 min 后，收集上清液，經(jīng) His 親和層析柱純化，最后一次洗脫前每毫克融合蛋白加入 10 U 凝血酶，收集流出液，進行SDS-PAGE 電泳鑒定。將 100 μl 苯甲脒瓊脂糖凝膠試劑加入純化的 hS100A8和 hS100A9 中除去凝血酶，反應(yīng) 20 min 后離心，已純化蛋白透析分裝后冷凍干燥，放于 -80 ℃ 冰箱備用。

1.2.2.3 hS100A8/hS100A9 鑒定 用含1.3 mmol/L 鈣離子的 Hanks-Hepes 液溶解蛋白，使用增強型 BCA 蛋白測定試劑盒檢測每種樣品的蛋白質(zhì)濃度后，取等量的 hS100A8、hS100A9 蛋白（各 20 μg）溶解混合，室溫放置 30 min，分別加入適量的 5 × loading buffer，經(jīng) 10% SDS-PAGE電泳進行分離，然后按標(biāo)準電泳方法轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上[10]。用 5% 牛血清白蛋白（BSA）在 PBS 緩沖液中封閉 2 h 后，用 1 × TBST 溶液搖床清洗3 次，10 min/次。將膜浸泡于 TBST 稀釋的一抗溶液中（anti-β，anti-S100A8，anti-S100A9，anti-S100A8/A9 1∶1000），4 ℃ 過夜，再次 TBST溶液搖床清洗 3 次，10 min/次。將膜與 TBST 稀釋的二抗溶液中（1∶2000），室溫下孵育 2 h，TBST清洗 5 次，5 min/次，最終采用 DAB 顯色法進行分析。

2 結(jié)果

2.1 hS100A8 和 hS100A9 基因擴增產(chǎn)物的鑒定

用帶酶切位點的引物 PCR 從真核表達載體pcDNA3.1-hS100A8 和 pcDNA3.1-hS100A9 成功擴增出 hS100A8 和 hS100A9 片段（圖 1），目的片段 hS100A8 約 280 bp，hS100A9 約 340 bp。

圖 1 hS100A8 和 hS100A9 PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoretic profile of PCR product of hS100A8 gene and hS100A9 gene

圖 2 pET28a-hS100A8（A）和 pET28a-hS100A9（B）重組質(zhì)粒測序報告圖Figure 2 pET28a-hS100A8(A) and pET28a-hS100A9 (B) recombinant plasmid sequencing report

圖 3 pET28a-hS100A8（A）和 pET28a-hS100A9（B）質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定Figure 3 Identification of pET28a-hS100A8 (A) and pET28a-hS100A9 (B) by agarose gel electrophoresis

2.2 原核載體 pET28a-hS100A8 和 pET28ahS100A9 的構(gòu)建

pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9 重組質(zhì)粒測序結(jié)果如圖 2 所示。

2.3 原核載體 pET28a-hS100A8 和 pET28ahS100A9 的鑒定

用BamH I 和XhoI 分別雙酶切原核載體pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9，進行 2%瓊脂糖凝膠電泳，可以看到兩條帶，大小分別為4900 bp 與 282 bp（圖 3），與預(yù)期大小一致。pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9 由北京鼎國生物公司送至上海生工公司進行測序，將測序結(jié)果與 GenBank 中 S100A8 基因序列（GenBank acc.no.NM-002964.3）和 S100A9 基 因 序列（GenBank acc.no.NM-002965.2）進行對比。結(jié)果表明，S100A8 基因從 170 ～ 450 bp 完全相同，長度約 280 bp；S100A9 基因從 165 ～ 510 bp 完全相同，長度約 345 bp；說明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 hS100A8 和 hS100A9 蛋白的體外純化

Western blot 分析顯示 hS100A8 和 hS100A9的原核表達轉(zhuǎn)化的菌體表達了蛋白（圖 4），而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體則無此條帶出現(xiàn)，說明 S100A8 和S100A9 蛋白兩者能夠在體外表達；且經(jīng)SDS-PAGE 電泳及 Western blot 檢測到特異的hS100A8/A9 的條帶，說明 hS100A8 和 hS100A9形成異源二聚體。

圖 4 Western blot 分析原核載體表達的 hS100A8 和hS100A9 蛋白Figure 4 Western blot analysis the prokaryotic vector expression protein of hS100A8 and hS100A9

3 討論

S100 蛋白家族是鈣結(jié)合蛋白家族中最大的亞類，能夠與鈣離子結(jié)合，通過鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細胞增殖、分化及細胞凋亡中發(fā)揮重要生物學(xué)作用[11]。目前慢性炎癥與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系逐漸受到關(guān)注，hS100A8/A9 既是一種炎性介質(zhì)，在腫瘤中又有促進癌細胞凋亡的作用。本課題組前期研究結(jié)果表明：hS100A8 和 hS100A9 在食管鱗癌組織中表達下調(diào)[12]，且低分化細胞下調(diào)更明顯，甚至不表達[13]；另一方面，將真核載體 pcDNA3.1/MychS100A8-His 和 pcDNA3.1-hS100A9-Flag 轉(zhuǎn)染食管癌細胞株有少量的蛋白表達，對細胞的影響不甚明顯，需要用大量的 hS100A8/A9 蛋白刺激細胞株來觀測細胞發(fā)生的變化。因此，體外形成其異源二聚體對進一步研究 hS100A8/A9 的功能及其對腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響具有重要意義。

為了制備純化的 hS100A8/A9 蛋白，本研究中選用 pET28a 作為表達載體，該載體含有 T7 啟動子，是一個強啟動子，可以使目的基因高效率地表達。同時將 pET28a 的 6·His-Tag 作為純化標(biāo)記，將其加入到蛋白的 N-末端，使表達的融合蛋白只經(jīng)親和層析一步即可純化，不僅簡化了純化蛋白的步驟，而且蛋白 N-末端組氨酸不會改變目的蛋白的活性。另利用 6·His-Tag 采用 Ni-NTA 柱親和層析法純化目的蛋白，并對其蛋白質(zhì)性質(zhì)進行初步研究，確定了 hS100A8 和 hS100A9 純化時所需最佳培養(yǎng)條件：1 mmol/L IPTG、16 ℃、16 h。以上表明 pET28a-hS100A8 和 pET28a-hS100A9 重組表達載體能使 hS100A8 和 hS100A9 基因和原核載體 pET28a 充分發(fā)揮各自的優(yōu)良特性，大大提高了hS100A8 和 hS100A9 蛋白的純化率。重組人hS100A8 和 hS100A9 原核表達與純化實驗技術(shù)的建立，將為進一步研究 hS100A8 和 hS100A9蛋白在胞外信號傳遞以及腫瘤發(fā)生，增殖和轉(zhuǎn)移方面生物學(xué)調(diào)控提供必要的實驗基礎(chǔ)。S100 家族蛋白有很多相似的特征，例如分子量都是 10 ～12 kD，在中性溶液中都是酸性蛋白。因此，本實驗技術(shù)可以對純化 S100 家族其他蛋白具有重要的參考意義。

根據(jù)文獻[10]報道，大腸桿菌表達系統(tǒng)表達純化出的 hS100A8 和 hS100A9 蛋白均為可溶形式。本研究于天然條件下純化得到了目的蛋白，保持了蛋白的生物活性，并在體外成功構(gòu)建了異源二聚體 hS100A8/A9。由于異源二聚體 hS100A8/A9的相對分子質(zhì)量與 hS100A9/A9 同源二聚體的相對分子質(zhì)量接近，因此僅從 SDS-PAGE 電泳無法明確該條帶是否為 hS100A8/A9。為進一步確定，我們采用 Western blot 法用抗 hS100A8/A9 的抗體孵育，此抗體特異性識別異源二聚體hS100A8/A9，而對同源二聚體 hS100A9/A9 不能識別。由 hS100A8/A9 抗體檢測到的在相對分子質(zhì)量 27 kD 處出現(xiàn)的特異條帶應(yīng)為 hS100A8/A9，說明 hS100A8 和 hS100A9 經(jīng)上述處理后，可形成異源二聚體。為下一步研究 hS100A8/A9 的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn) hS100A8/A9 異源二聚體比組成該二聚體的每個亞基的活性都高[14]，hS100A8/A9 是免疫細胞產(chǎn)生的有效的炎性因子，也是有力的促凋亡因子。因此有關(guān) hS100A8/A9 功能的研究是該領(lǐng)域的一個焦點。其作用機制十分復(fù)雜，雖已取得部分進展，還有待進一步深入研究。本實驗研究結(jié)果表明 hS100A8/A9 蛋白可以在體外表達并純化，但是兩者在腫瘤性疾病中存在差異表達且功能多樣。在食管鱗癌癌變不同時期的組織中，hS100A8/A9的表達水平隨病變程度的加重而逐漸降低[15]，并與腫瘤的臨床病理分級之間存在顯著的相關(guān)性。hS100A8/A9 的表達下調(diào)常伴隨著核漿轉(zhuǎn)位現(xiàn)象的出現(xiàn)，表明它們的下調(diào)是食管鱗癌發(fā)生和發(fā)展過程中一個普遍事件，hS100A8/A9 將可能作為食管鱗癌發(fā)生和發(fā)展過程中較為理想的分子標(biāo)志物用于今后的診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測。下一步打算用體外純化的不同濃度的 hS100A8/A9 蛋白去刺激不同分化程度的食管鱗癌細胞株，用 SDS-PAGE 電泳和 Western blot 檢測下游通路的蛋白變化，初步討論 hS100A8/A9 在慢性食管炎相關(guān)食管鱗癌形成過程中的作用機制，為進一步探討慢性炎癥與食管鱗癌發(fā)生的關(guān)系，為食管鱗癌的有效的早期防治、降低發(fā)病率提供重要的實驗依據(jù)。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(6):520-525

Construction, identification and purification of recombinant prokaryotic expression vector expressing human S100A8 and S100A9

GUO Lei-ming, DING Gao-feng, XU Wen-cai, CHEN Xi-juan, JIANG Yue, LU Yu-fei

ObjectiveTo construct recombinant prokaryotic expression vector expressing human S100A8 (hS100A8) and human S100A9 (hS100A9), then purified recombinant hS100A8 and hS100A9 proteins, for further studying human its molecular biology effects.

MethodsUse the same restriction endonuclease double enzyme digestion PCR products and pET-28a plasmid, both connected with T4 ligase, then transformed into competent cell DH5α, extraction of plasmid for identification. The recombinant plasmid pET28a-hS100A8 and pET28a-hS100A9 was confirmed by restriction endonuclease digestion, PCR and gene sequencing, then the resultant vectors respectively transformed into competent cell BL21. Induced the protein expression then isometric purified protein on calcium ion concentration must incubate for 30 min, by SDS-PAGE and Western blot methods validation of heterologous dimer formation.

ResultshS100A8 and hS100A9 gene was amplified accurately. Prokaryotic expression vector pET28a-hS100A8 and pET28a-hS100A9 were constructed successfully, and expressed in competent cell fromEscherichia coliBL21, after purified at room temperature can be formed after incubation heterologous dimers.

ConclusionThe recombinant prokaryotic expression vectors expressing hS100A8 and hS100A9 was successfully constructed, and can form the heterologous dimersin vitro. These will be used to investigate the biological role of hS100A8 and hS100A9.

Calgranulin A; Calgranulin B; Gene expression

Author Affiliation:Department of Radiotherapy, Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University/Henan Cancer Hospital, 450001 Zhengzhou, China

LU Yu-fei, Email： lyf890@sina.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.005

河南省科技攻關(guān)計劃項目（201503187）；國家自然科學(xué)基金（81372436）；河南省衛(wèi)生廳省部共建項目（201201009）

450001 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科

陸寓非，Email：lyf890@sina.com

2017-09-27

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(6):520-525