葉雯霞 杜蕾蕾 段志敏 劉彩霞 李岷 高宇

325000溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科［葉雯霞（現(xiàn)在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院麗水市人民醫(yī)院皮膚科，323000）、高宇］；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院真菌科（杜蕾蕾、段志敏、劉彩霞、李岷）

兩性霉素B對(duì)人THP-1細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素8及p38MAPK活化的影響

葉雯霞 杜蕾蕾 段志敏 劉彩霞 李岷 高宇

325000溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科［葉雯霞（現(xiàn)在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院麗水市人民醫(yī)院皮膚科，323000）、高宇］；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院真菌科（杜蕾蕾、段志敏、劉彩霞、李岷）

目的 探討兩性霉素B對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞系分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素8（IL-8）以及p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活化的影響。方法 將THP-1細(xì)胞分為空白對(duì)照組、兩性霉素B組（分別加入2、4、8 mg/L兩性霉素B處理）；陽性對(duì)照組（用100 μg/L β葡聚糖或者100 mg/L脂多糖處理）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同刺激物和THP-1細(xì)胞作用一定時(shí)間后TNF-α、IL-8 mRNA表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測8 mg/L兩性霉素B刺激THP-1細(xì)胞24 h后上清液中TNF-α分泌量。Western印跡檢測8 mg/L兩性霉素B作用THP-1細(xì)胞后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。結(jié)果 2、4、8 mg/L兩性霉素B刺激6 h，TNF-α mRNA水平分別為7.55±1.17、19.47±2.91、57.22±0.65，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、0.001、0.001）。IL-8 mRNA水平分別為2.98± 0.04、5.22±1.35、11.82±1.66，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01、0.001、0.001）。8 mg/L兩性霉素B刺激THP-1細(xì)胞1、3、6 h后TNF-α mRNA水平分別為8.61±0.30、10.75±0.08、56.98±2.43，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05、0.01、0.001）。IL-8 mRNA水平分別為2.63±0.28、5.35±0.98、11.73±1.18，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、0.01、0.001）。8 mg/L兩性霉素B刺激THP-1細(xì)胞24 h上清液中TNF-α蛋白水平為（4 039.06±223.87）ng/L，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)論兩性霉素B體外可促進(jìn)人THP-1細(xì)胞p38MAPK蛋白磷酸化及TNF-α和IL-8分泌，具有免疫調(diào)節(jié)作用。

兩性霉素B；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素8；p38絲裂原活化蛋白激酶類；單核細(xì)胞THP-1

兩性霉素B是經(jīng)典的多烯類抗真菌藥物，抗菌譜廣，可用于治療念珠菌、曲霉、隱球菌引起的系統(tǒng)感染，是重癥真菌感染治療的基石［1］。近年研究顯示，兩性霉素B除了對(duì)真菌有直接殺滅作用外，還對(duì)宿主免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用［2-4］。本研究旨在探討兩性霉素B在調(diào)節(jié)固有免疫中的作用。

材料與方法

1.細(xì)胞和主要試劑：人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株（THP-1細(xì)胞株）來自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。兩性霉素B為美國Sigma公司產(chǎn)品，用二甲基亞砜（DMSO）配制成不同濃度待用。兔抗人p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷酸化p38 MAPK抗體（美國Cell Signaling Technology公司），iTaq Universal SYBR Green Supermix（美國Bio-rad公司），PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（日本TaKaRa公司）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代人THP-1細(xì)胞。制備1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔2 ml）及12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1 ml），加入100 μg/L PMA刺激48 h后，將THP-1細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組，不加任何刺激物，僅用培養(yǎng)基處理；兩性霉素B組，分別用2、4、8 mg/L（實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)）或僅用8 mg/L［酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和Western印跡試驗(yàn)］兩性霉素B處理；陽性對(duì)照組：用100 μg/L β葡聚糖（PCR試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)）或者100 mg/L脂多糖處理（Western印跡試驗(yàn)）。

3.實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測TNF-α和白細(xì)胞介素（IL）8 mRNA表達(dá)：THP-1細(xì)胞經(jīng)上述處理 1、3、6 h后，TRIzol法抽提空白對(duì)照組，兩性霉素B組及β葡聚糖細(xì)胞總RNA，按Prime Script RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實(shí)時(shí)定量PCR儀，用Syber green法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照。TNF-α、IL-8及β肌動(dòng)蛋白引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TNF-α引物序列：正向引物5′-CGAGTGACAAGCCTGTAGC-3′，反向引物 5′-GGTGTGGGTGAGGAGCACAT-3′；IL-8引物：正向引物5′-GGTGCAGAGGGTTGTGGAGAA-3′，反向引物5′-GCAGACTAGGGTTGCCAGATT-3′；β 肌動(dòng)蛋白引物：正向引物 5′-TCTGGCACCACACCTTCTA-3′，反向引物5′-AGGCATACAGGGACAGCAC-3′。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)40。采用2-△△Ct法對(duì)目的基因變化水平進(jìn)行計(jì)算，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參照Ct值；樣品ΔΔCt=樣品ΔCt-對(duì)照組ΔCt。以對(duì)照組目的基因表達(dá)量為1，2-△△Ct值即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測TNF-α含量：不同刺激物與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，離心收集上清液，按試劑盒說明書檢測上清液中TNF-α含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

5.Western印跡檢測p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平：THP-1細(xì)胞經(jīng)上述處理30 min后，裂解細(xì)胞、提取總蛋白。將蛋白（40 μg）樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。5%牛血清白蛋白（BSA）封閉1.5 h，加入兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST液（Tris-Buffered Saline Tween-20）洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG反應(yīng)1.5 h，TBST液洗膜，Supersignal試劑顯色發(fā)光，檢測p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示。各組間mRNA表達(dá)水平、上清液TNF-α含量差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Pearson相關(guān)性分析檢測兩性霉素B作用濃度和時(shí)間與TNF-α和IL-8 mRNA水平之間的關(guān)系。

結(jié) 果

1.兩性霉素B對(duì)TNF-α及IL-8 mRNA水平的影響：刺激6 h，不同濃度兩性霉素B組、陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間TNF-α mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=4，F(xiàn)=195.33，P ＜ 0.001），IL-8 mRNA表達(dá)水平差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=4，F(xiàn)=111.63，P＜0.001），見表1。濃度為8mg/L兩性霉素B刺激后不同時(shí)間點(diǎn)之間TNF-α及IL-8 mRNA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。兩性霉素B對(duì)TNF-α和IL-8 mRNA水平升高呈濃度（r值分別為0.827和0.813，均P＜0.05）和時(shí)間依賴性（r值分別為0.819和0.806，均P ＜ 0.05）。

表1 不同濃度兩性霉素B對(duì)THP-1細(xì)胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素8（IL-8）mRNA表達(dá)水平的影響（±s）

表1 不同濃度兩性霉素B對(duì)THP-1細(xì)胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素8（IL-8）mRNA表達(dá)水平的影響（±s）

注：n=3。a與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陽性對(duì)照組比較，P＜0.05

表2 8 mg/L兩性霉素B刺激不同時(shí)間對(duì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素8（IL-8）mRNA水平的影響（±s）

表2 8 mg/L兩性霉素B刺激不同時(shí)間對(duì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素8（IL-8）mRNA水平的影響（±s）

注：n=3。a與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陽性對(duì)照組比較，P＜0.05

2.兩性霉素B對(duì)TNF-α蛋白分泌的影響：刺激24 h后，兩性霉素B組、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組上清液中TNF-α蛋白濃度分別為（4 039.06±223.87）、（5 253.29± 124.60）、（96.31± 0.26）ng/L，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.35，P ＜0.01），兩性霉素B組、陽性對(duì)照組TNF-α蛋白分泌量均高于空白對(duì)照組（P＜0.001）。

3.兩性霉素B對(duì)THP-1細(xì)胞p38MAPK激活的影響：加兩性霉素B刺激30 min后，THP-1細(xì)胞磷酸化p38MAPK蛋白水平明顯高于空白對(duì)照組，與脂多糖組相比相似；而p38MAPK蛋白水平在刺激30 min后各組間沒有明顯差異。見圖1。

圖1 Western印跡分析兩性霉素B對(duì)THP-1細(xì)胞p38MAPK激活的影響 1：空白對(duì)照組；2：8 mg/L兩性霉素B刺激30 min；3：100 mg/L脂多糖刺激30 min

討 論

體外研究顯示，兩性霉素B除殺傷真菌細(xì)胞外，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用，如刺激細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子、前列腺素等免疫因子并上調(diào)參與血管生成的基因表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)表明，兩性霉素B能增強(qiáng)多核中性粒細(xì)胞抗真菌活性，刺激巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-1，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力提高對(duì)真菌的抵抗力［5］。本研究旨在探討兩性霉素B對(duì)人THP-1細(xì)胞p38 MAPK活化以及TNF-α和IL-8分泌等的影響，從而研究抗真菌藥物對(duì)人體的免疫調(diào)節(jié)作用。

TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的前炎癥細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)證明，TNF-α可促進(jìn)IL-12、γ干擾素（IFN-γ）的產(chǎn)生，并介導(dǎo)樹突細(xì)胞向炎癥部位遷移，有助于清除新型隱球菌感染［6］，而IL-8也能有效促進(jìn)多形核白細(xì)胞抑制白念珠菌生長。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度兩性霉素B作用THP-1細(xì)胞后，TNF-α和IL-8 mRNA水平呈濃度依賴性升高；同時(shí)TNF-α和IL-8 mRNA水平在兩性霉素B刺激1 h后出現(xiàn)上升，3 h持續(xù)升高，6 h達(dá)到高峰，呈時(shí)間依賴性。本研究采用β葡聚糖（真菌細(xì)胞膜上dectin-1受體的配體）作為激活THP-1細(xì)胞的陽性對(duì)照物，其也能誘導(dǎo)出相同的時(shí)間依賴效應(yīng)。

我們用ELISA法檢測8 mg/L濃度的兩性霉素B作用THP-1細(xì)胞24 h后，上清液中TNF-α含量高于空白對(duì)照組。表明兩性霉素B不僅上調(diào)THP-1細(xì)胞TNF-α轉(zhuǎn)錄水平，而且促進(jìn)該因子蛋白分泌。

研究顯示，兩性霉素B主要通過Toll樣受體（TLR），CD14、MyD88活化下游的MAPK，主要包括p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）及細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（ERK）幾個(gè)亞族［7］。p38MAPK可將胞外信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。p38MAPK被激活后可以活化一些轉(zhuǎn)錄因子如轉(zhuǎn)錄活化因子1（ATF-1）、ATF-2及轉(zhuǎn)錄因子1（AP-1），從而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，影響細(xì)胞因子產(chǎn)生，共同調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［8］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩性霉素B刺激30 min后，THP-1細(xì)胞出現(xiàn)p38MAPK蛋白磷酸化及TNF-α和IL-8 mRNA、蛋白表達(dá)水平的升高，且TNF-α和IL-8 mRNA水平升高在一定程度內(nèi)呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性，表明兩性霉素B在抗真菌的同時(shí)，可與免疫細(xì)胞相互作用，參與機(jī)體固有免疫反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)作用。

［1］吳婷,王敏,蘇欣,等.抗真菌藥物與Toll樣受體在固有免疫應(yīng)答中的作用［J］.中國感染與化療雜志,2015,（5）:501-504.DOI:10.3969/j.issn.1009-7708.2015.05.032.

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Effect of amphotericin B on the production of tumor necrosis factor-α and interleukin-8 and activation of signaling molecule p38MAPK in human THP-1 cells

Ye Wenxia,Du Leilei,Duan Zhimin,Liu Caixia,Li Min,Gao Yu
Department of Dermatology,The 2nd Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,Zhejiang,China（Ye WX［current affiliation:Department of Dermatology,Lishui People′s Hospital,The Sixth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Lishui 323000,Zhejiang,China］,Gao Y）;Department of Mycology,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Du LL,Duan ZM,Liu CX,Li M）

s:Gao Yu,Email:gaoyu@medmail.com.cn;Li Min,Email:drlimin@sina.com

Objective To evaluate the effect of amphotericin B on the production of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-8（IL-8）and activation of p38 mitogen-activated protein kinases（p38MAPK）in a human acute monocytic leukemia cell line（THP-1）.Methods Cultured THP-1 cells were divided into several groups:blank control group receiving no treatment,amphotericin B groups treated with 2,4 and 8 mg/L amphotericin B separately,positive control group treated with 100 μg/L β -glucosan or 100 mg/L lipopolysaccharide.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was performed to determine the mRNA expression of TNF-α and IL-8 after the THP-1 cells were treated with different stimuli for some durations.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect the level of TNF-α in the culture supernatant of THP-1 cells after 24-hour treatment with 8 mg/L amphotericin B,and Western blot analysis to measure the levels of p38MAPK and phosphorylated p38MAPK after 30-minute treatment with 8 mg/L amphotericin B.Results After 6-hour treatment with 2,4 and 8 mg/L amphotericin B separately,the mRNA levels of TNF-α in THP-1 cells（7.55 ± 1.17,19.47 ± 2.91,57.22 ± 0.65）and IL-8（2.98±0.04,5.22±1.35,11.82±1.66）were all significantly higher than those in the blank control group（TNF-α:1.00±0.07,P＜0.01,0.001,0.001 respectively;IL-8:1.01±0.23,P＜0.01,0.001,0.001 respectively）.After the treatment with 8 mg/L amphotericin B for 1,3,6 hours,the mRNA levels of TNF-α（8.61±0.30,10.75±0.08,56.98±2.43）and IL-8（2.63±0.28,5.35±0.98,11.73±1.18）in THP-1 cells were all significantly higher than those in the blank control group（TNF-α:1.18±0.17,P ＜0.05,0.01,0.001;IL-8:1.23±0.11,P＜0.05,0.01,0.001）.After 24-hour treatment with 8 mg/L amphotericin B,the level of TNF-α in the culture supernatant of THP-1 cells was significantly higher than that in the blank control group（4 039.06±223.87 ng/L vs.96.31±0.26 ng/L,P＜0.001）.Conclusion Amphotericin B can promote the p38MAPK phosphorylation and increase the levels of TNF-α and IL-8 in human THP-1 cells in vitro,suggesting its immunomodulatory effects.

Amphotericin B;Tumor necrosis factor-alpha;Interleukin-8;p38 Mitogen-activated protein kinases;THP-1 monocytes

高宇，Email：gaoyu@medmail.com.cn；李岷，Email：drlimin@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.008

國家自然科學(xué)基金（81371750）、國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃973計(jì)劃（2013CB536005）、江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”項(xiàng)目，江蘇省“六大人才高峰”項(xiàng)目（2013-WSW-039、2013-WSW-090）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81371750）;National Basic Research Program（973 Program）of China（2013CB536005）;333 High-level Talents Training Project of Jiangsu Province（2013-WSW-039）;Six Talents Peak Project of Jiangsu Province（2013-WSW-090）

2016-11-22）

（本文編輯：尚淑賢）