姚利娜，郝心愿，王璐，李娜娜，曾建明，楊亞軍，王新超

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心，農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

茶樹Copine家族基因CsBON3的克隆與表達分析

姚利娜，郝心愿，王璐，李娜娜，曾建明，楊亞軍*，王新超*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心，農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

Copine蛋白是一類包含2個C2（N端）和1個vWA（C端）保守域的Ca2+依賴蛋白或磷脂結(jié)合蛋白，在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用?；谛蛄邢嗨菩苑治?，從茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出1條與Copine家族基因高度同源的EST序列。經(jīng)測序驗證該序列包含1 746 bp的完整ORF，編碼581個氨基酸。同源比對顯示該基因與擬南芥AtBON3序列相似度最高（65%），將其命名為CsBON3（GenBank登錄號為 KY435900）。生物信息學(xué)分析顯示，CsBON3蛋白分子量為63.66 kD，理論等電點為5.48；具有Copine家族蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域；屬親水性蛋白，無信號肽位點，非分泌性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)域。表達分析表明，CsBON3在茶樹花和根系中表達量最高，莖干和成熟葉中表達量最低。低溫（4℃）處理茶樹 1 d后，其表達被顯著上調(diào)；在生長階段，該基因表達量高于休眠階段；同時在接種炭疽菌的茶樹葉片中，該基因也被快速上調(diào)，表明該基因可能與茶樹低溫、生長發(fā)育及抗病相關(guān)。

茶樹；Copine家族；BON基因；逆境脅迫響應(yīng)；休眠；表達分析

Copine蛋白在1998年首次從草履蟲中分離得到，是一種高度保守具有重要功能的蛋白[1]。隨后，該蛋白在哺乳動物、植物、線蟲中也相繼被發(fā)現(xiàn)。Copine蛋白家族共有兩種保守結(jié)構(gòu)域，氨基端2個C2結(jié)構(gòu)域（C2A和C2B），羧基端1個von Willebrand factor A（vWA）結(jié)構(gòu)域[1]。C2結(jié)構(gòu)域具有鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白的功能，即在 Ca2+的作用下，和磷脂結(jié)合使該蛋白定位在膜上[2]，如蛋白激酶 C、磷脂酶 C[2-3]等具有囊泡運輸功能的蛋白中均有C2結(jié)構(gòu)域。vWA結(jié)構(gòu)域與整合蛋白的結(jié)構(gòu)域同源，整合蛋白具有介導(dǎo)細胞和細胞之間，以及細胞和細胞外基質(zhì)之間的相互識別作用[4-6]。

Copine蛋白家族在哺乳動物中研究較深入，發(fā)現(xiàn)該蛋白家族具有許多重要的功能，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜轉(zhuǎn)運、離子通道等。至目前研究為止，在哺乳動物中Copine蛋白共有8個家族成員，被命名為Copine I～Copine VIII，每個家族都具有不同的功能。然而，植物中Copine蛋白研究較少，植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Copine基因成員只有 1～3個，如擬南芥、楊樹、棉花等物種中僅有3個基因成員（BON1、BON2、BON3），馬鈴薯、大豆、水稻、玉米等物種中僅有2個基因成員（BON1和BON3），而北美云杉、互葉梅、卷柏等物種中僅發(fā)現(xiàn)1個基因成員（BON1）[7]。目前只有擬南芥中的 Copine家族基因的功能被鑒定，認(rèn)為具有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和抗病的作用[8]。

茶樹作為多年生常綠經(jīng)濟作物，其生長周期內(nèi)會受多種逆境的脅迫。近年來，隨著全球氣候變化的影響，各種生物與非生物逆境如病害、低溫脅迫等對茶樹生長和品質(zhì)的影響越來越頻繁，嚴(yán)重影響了茶葉生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。如何提高茶樹的抗性也成為茶學(xué)研究的主要研究課題。筆者在實驗室前期的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到了 1條與擬南芥AtBON3同源的EST片段，該基因在不同冷馴化樣品之間表達有差異[9]。為進一步了解茶樹BON基因的功能，筆者克隆了CsBON3基因，并對該基因進行了全面的生物信息學(xué)分析和表達檢測，以期深入揭示BON基因在茶樹抗性和生長發(fā)育調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗材料為國家級茶樹品種龍井 43，種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所內(nèi)試驗基地。組織表達特異性取樣方法參照岳川等[10]所述，低溫脅迫取樣方法參照曹紅利[11]等所述。在越冬龍井43茶樹進入休眠時期，即從2015年10月初到2016年3月底，每隔1個月左右取 1次頂芽進行CsBON3的表達分析。以 3年生茶樹品種龍井43為材料，人工氣候室正常培養(yǎng)（25℃，16 h光照/8 h黑暗，濕度65%），對照組用噴壺均勻向整株茶苗噴清水，處理組用噴壺均勻向整株茶苗噴炭疽菌；在接種0、12、24、48、72、96 h后取茶樹葉片進行CsBON3基因表達分析。以上取樣及處理均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，取樣后立即放入液氮，置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

按照 CTAB法提取不同處理樣品的總RNA，用NanoDrop ND2000微量核酸蛋白測定儀測定RNA濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA質(zhì)量，參照 Prime Script RT Reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于基因克隆和表達分析。

1.3 CsBON3基因克隆

以龍井43芽的cDNA為模板，依據(jù)EST序列設(shè)計引物進行RT-PCR驗證。PCR反應(yīng)體系采用 KOD-Plus-Neo酶（TOYOBO, Osaka,Japan），退火溫度為 55℃。PCR反應(yīng)后，再加入rTaq 聚合酶（TakaRa, 大連）于72℃反應(yīng)20 min進行加尾。終產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)條帶回收純化后，連接到pMD18-T載體，經(jīng)大腸桿菌（DH5α）轉(zhuǎn)化獲得陽性單克隆并測序。引物合成和基因測序均由上海華津生物有限公司完成，本研究所涉及到的引物序列見表1。

1.4 CsBON3的表達分析

以茶樹PTB為內(nèi)參基因[12]，熒光定量反應(yīng)體系SYBR Mix (Roche, Basel, Switzerland)5.0 μL、cDNA 2 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，加水至終體積10 μL。充分混勻，短暫離心后，于LightCycler 480 II實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增，反應(yīng)程序為95℃5 min；95℃ 10 s，56℃ 15 s，12℃ 12 s進行45個循環(huán)后增加溶解曲線。每個反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，最后采用 2–ΔΔCT或2-ΔCT法[13]分析結(jié)果。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用 DNASTAR 軟件包中的 Editseq 進行ORF查詢；在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別用Blastn和 Blastx進行核酸和蛋白質(zhì)序列的同源性比對分析；在 ClustalX2.0中進行多序列比對和排序后，利用DNAMAN和MEGA6.0輸出同源比對和進化樹構(gòu)建結(jié)果[14]。用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam分析程序預(yù)測蛋白分子量、等電點、氨基酸組分等[15]，ProtScale程序分析該蛋白的疏水和親水性，SignalP分析程序進行信號肽的預(yù)測[16]，TargetP分析程序預(yù)測CsBON3蛋白的亞細胞定位，NetPhos分析程序預(yù)測蛋白磷酸化位點[17]，GOR分析程序預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)組成[18]。

表1 RT-PCR和qRT-PCR引物信息Table 1 RT-PCR and qRT-PCR primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 CsBON3的cDNA克隆

通過1%瓊脂糖凝膠電泳對RT-PCR引物進行序列驗證，獲得1.9 kbp左右的單一條帶（圖 1）。

測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該條帶長1 987 bp。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的 ORF Find查找該序列的開放閱讀框（ORF），然后進行Blastx比對，發(fā)現(xiàn)該序列包含完整的ORF，全長為1 746 bp，編碼581個氨基酸。與擬南芥的AtBON3序列相似度最高（65%），命名為CsBON3，提交GenBank，登錄號為KY435900。

圖1 茶樹Copines蛋白家族基因CsBON3 RT-PCR電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis results of Copines family CsBON3 in tea plant

2.2 同源性和進化樹分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對CsBON3的氨基酸序列進行Blastx比對，結(jié)果顯示它與葡萄中預(yù)測的VvBON1（XP_002280913.1）氨基酸序列相似性最高，達80%，與黃胡蘿卜（XP_017214747.1）、大豆（XP_003553742.1）的BON相似性分別是78%、77%。用相鄰連接法構(gòu)建進化樹顯示與葡萄的 VvBON1親緣關(guān)系最近（圖2）。

結(jié)合聚合進化樹分析，從中挑選與CsBON3相似性較高的氨基酸序列進行同源性比對（圖3）。所有的 BON氨基酸序列長度為 576～596個氨基酸，都有 Copine家族特有的結(jié)構(gòu)域C2A、C2B、vWA。所有的 BON氨基酸序列在C2結(jié)構(gòu)域中具有高度保守的與鈣依賴磷脂結(jié)合作用有關(guān)的天冬氨酸殘基；在vWA結(jié)構(gòu)域中具有如蛋白激酶相似的 ATP結(jié)合甘氨酸環(huán)激酶序列和推測的賴氨酸催化位點（圖3）。

圖2 CsBON3的進化樹分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequence of CsBON3

圖3 茶樹與其他植物BON氨基酸序列比對Fig. 3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of CsBON with BON proteins from other plants

2.3 蛋白質(zhì)序列基本性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，CsBON3蛋白分子量為63.66 kD，理論等電點（Theoretical pI）為 5.48，不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index, II）為30.22，根據(jù)Guruprasad法判斷該蛋白穩(wěn)定。CsBON3親水性和疏水性值在－2.167～2.600之間，表明該蛋白為親水性蛋白。SignalP信號肽組成分析程序預(yù)測 CsBON3蛋白不包含信號肽，屬于非分泌蛋白；亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表示該蛋白定位在質(zhì)膜、細胞質(zhì)可能性最大。NetPhos分析程序?qū)sBON3蛋白的磷酸化位點預(yù)測顯示，該蛋白在翻譯后可能存在48個磷酸化位點，其中包含18個絲氨酸（Ser,S）位點，7個蘇氨酸（Thr, T）位點和23個絡(luò)氨酸（Tyr, Y）位點。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，CsBON3蛋白由 25.3% α-螺旋、22.55%的延伸鏈和 52.15%的無規(guī)則卷曲組成。蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測結(jié)果顯示，CsBON3蛋白氨基酸序列在 53～162 位、200～299 位、343～540 位之間高度保守，具有 Copine蛋白家族中共有的典型結(jié)構(gòu)域——C2A、C2B、VWA結(jié)構(gòu)域。

2.4 CsBON3基因的表達模式分析

2.4.1 組織表達差異性

CsBON3基因在花和根系中的表達要明顯高于莖和成熟葉中的表達，芽中的表達量較花和根系中的表達量都要低，但明顯比莖和成熟葉中高（圖 4），這表明CsBON3基因具有組織表達特異性。

2.4.2 低溫脅迫下的表達模式

低溫條件下，CsBON3基因在茶樹成熟葉片中的表達與低溫脅迫時間相關(guān)，低溫處理前期表達量變化不顯著，但在處理 24 h后，表達量迅速升高，以后隨著處理時間的延長表達量維持較高的水平，處理4 d后表達量為處理前的 2.98倍，表明CsBON3基因受低溫誘導(dǎo)（圖 5）。

圖4 同一品種不同組織器官中CsBON3的表達分析Fig. 4 Expression analysis of CsBON3 in different organs of a tea plant

2.4.3 CsBON3在茶樹越冬芽休眠中的表達分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析了CsBON3基因從秋季茶樹頂芽開始休眠到春季萌發(fā)期間不同時間點的相對表達情況。可以看出，10月至 11月初，茶芽仍處于發(fā)育階段，CsBON3基因表達上調(diào)，而進入11月以后，隨著外界光照和溫度的變化，茶芽進入休眠階段，生長相對停滯，該基因表達量降低，在整個休眠階段，該基因維持在較低表達水平。進入春季以后，日照時間增加，溫度提高，茶芽逐漸打破休眠，恢復(fù)生長，該基因又上調(diào)表達，至 3月初茶芽萌動時表達量最高（圖6）。

2.4.4 炭疽菌接種后CsBON3的表達分析

茶樹炭疽菌接種 12 h后CsBON3基因表達量達到最大值，其表達量為未處理前的 2.3倍。隨后表達逐漸下調(diào)，接種 48 h后表達量和未處理前一致，表明接種炭疽菌后短期內(nèi)能誘導(dǎo)CsBON3基因的表達（圖7）。

圖5 CsBON3在低溫脅迫下的表達分析Fig. 5 Expression analysis of CsBON3 under cold stress

圖7 CsBON3接種炭疽菌后的表達分析Fig. 7 Expression analysis of CsBON3 inoculated with colletotrichum spores

3 討論

3.1 CsBON3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特征

本研究從龍井43茶樹中獲得了1條BON基因，具有已報道的該基因的特征。CsBON3的序列長度、分子質(zhì)量及等電點等均與其他物種的 BON相近；預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)與其他的BON高度相似，具有C2結(jié)構(gòu)域特有的氨基酸殘基（天冬氨酸）和vWA結(jié)構(gòu)域特有的ATP結(jié)合甘氨酸環(huán)及推測的賴氨酸催化位點[19]；所有的氨基酸序列的第2個氨基酸為甘氨酸，具有獨特的肉豆蔻?；揎?，與BON蛋白定位在質(zhì)膜上密切相關(guān)[20]。

研究表明，BON蛋白氨基酸序列上C2結(jié)構(gòu)域上有3～4個保守的天冬氨酸，是結(jié)合鈣必不可少的殘基位點。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，與鈣離子結(jié)合作用相關(guān)的天冬氨酸，在CsBON3序列中大部分都存在，相當(dāng)于AtBON1在C2A結(jié)構(gòu)域中的D63、D69、D122和D124位點，C2B結(jié)構(gòu)域的D209、D215和D269位點（圖3中箭頭所示）。CsBON3氨基酸序列的 C2B結(jié)構(gòu)域中的第3個天冬氨酸D發(fā)生突變，被N取代，由此推測 CsBON3蛋白都具有同AtBON1的鈣依賴磷脂結(jié)合作用，具體的結(jié)合特性可能略有不同。Copine蛋白的von Willebrand factor A （vWA）結(jié)構(gòu)域功能與蛋白激酶相似，蛋白激酶具有保守的激酶基序包括 ATP結(jié)合甘氨酸環(huán)（AtBON1在 Ala350,Gly353）和推測的賴氨酸催化位點（AtBON1在Lys391）[21]（圖3中方框所示）。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)CsBON3在vWA結(jié)構(gòu)域具有保守的“ASNG”基序和賴氨酸催化位點，可以推測 CsBON3蛋白具有同 AtBON1蛋白相同的磷酸化的活性和 ATP酶活性。CsBON3氨基酸序列的vWA結(jié)構(gòu)域中具有如整合蛋白中結(jié)合鎂相關(guān)活性的保守殘基，同AtBON1的vWA結(jié)構(gòu)域D347、T349、S351、T445和D447位點（圖3中加號所示）。vWA結(jié)構(gòu)域的生化活性及功能調(diào)節(jié)需要我們后期進行更深入的研究才能確定。目前植物中擬南芥已驗證有 3條BON序列，水稻已驗證有2條BON序列，因此茶樹BON基因很可能是多基因家族，新的BON基因有待繼續(xù)發(fā)掘。

3.2 CsBON3 基因的表達

目前哺乳動物中的 Copine蛋白相關(guān)家族研究較多，植物中除擬南芥外，Copine蛋白在其他植物上的研究結(jié)果較少。擬南芥中有3條Copine基因，分別命名為AtBON1、AtBON2、AtBON3，它們在功能上具有冗余且具有組織表達差異性，過表達BON3基因可以回復(fù)bon1-1單突變體的表型[8]。GUS染色表明AtBON1、AtBON2、AtBON3在擬南芥生長發(fā)育過程中具有組織表達特異性，AtBON1主要在幼嫩的組織中表達如根尖、伸展的葉[22]；AtBON2的表達模式與AtBON1相似，與AtBON1不同的是AtBON2在保衛(wèi)細胞中表達量很高；而AtBON3在不同的組織中表達量都極低[8]。Zou等[7]研究表明，半定量 RT-PCR顯示水稻OsBON1的各個組織表達都比OsBON3要低，如根系、莖、嫩葉、成熟葉、節(jié)點和花序；且OsBON1在葉、節(jié)點和花序中表達相對較高，在莖和根系中表達較低，而OsBON3在莖和節(jié)點中表達較高，在成熟葉中表達較低。本研究結(jié)果表明CsBON3具有明顯的組織表達特異性，CsBON3基因在花和根系中的表達要明顯高于莖和成熟葉中的表達，芽中的表達量較花和根系中表達量都要低，但明顯比莖和成熟葉中高（圖4）。

擬南芥在較大的溫度范圍內(nèi)都會維持相似的大小和形態(tài)，Hua等[22]研究發(fā)現(xiàn)，bon1-1突變體在22℃時生長的形態(tài)與野生型（Col-0）表型有很大的差異，bon1-1突變體植株具有矮小、葉片卷曲、莖細且短等表型；bon1-1突變體在28℃時的表型與野生型（Col-0）基本一致，表明BON1基因和BAP1在低溫下可能與細胞分裂和細胞擴增有關(guān)。本研究表明在4℃處理1 d后CsBON3表達量在成熟葉中顯著升高，且隨著處理時間的延長表達量一直維持較高的水平，表明在低溫處理下CsBON3基因可能參與茶樹葉片的低溫響應(yīng)。

Yang等[8]通過雙突變和三突變的組合發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtBON1/2/3基因在植物的生長發(fā)育過程中具有功能重疊的作用，雙突變bon1-1bon2-2和bon1-1bon3-3還會引起細胞發(fā)生程序性死亡。本研究發(fā)現(xiàn)茶樹越冬芽休眠過程中，CsBON3在深休眠期間（次年1月）表達量最低，隨著休眠解除，CsBON3表達量逐漸上調(diào)，并在茶芽萌動期達到最大值（圖6），表明CsBON3基因可能參與茶樹芽的生長發(fā)育。

在擬南芥中，AtBON1在植物免疫中具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)AtBON1可以負(fù)調(diào)節(jié)抗病性基因SNC1[23]；AtBON2、AtBON3單突變后對植物的免疫性作用并未有較大作用，但可以和AtBON1單突變體協(xié)同提高植物的免疫性[8]。Zou等[7]研究表明，在接種使水稻可產(chǎn)生稻瘟病的病菌后，OsBON1在接種12 h后顯著上調(diào)持續(xù)到48 h，OsBON3表達量并未明顯變化，可以推測OsBON1主要與植物抗病性相關(guān)，OsBON3主要參與植物的生長發(fā)育。本研究表明在龍井 43茶樹接種炭疽菌 12 h后，CsBON3的表達量達到最大值，隨后表達逐漸下調(diào)并和未處理前表達量一致，說明接種炭疽菌能短期內(nèi)誘導(dǎo)CsBON3基因的表達，推測該基因可能與OsBON1一樣，參與茶樹的抗病反應(yīng)。

鑒于BON基因在植物上的研究較少，且大多數(shù)的功能未知，而筆者在茶樹上初步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsBON3基因?qū)Φ蜏?、病菌侵染具有一定程度的響?yīng)，而且還參與茶樹芽的休眠與萌發(fā)過程，因此，推測與其他植物一樣，茶樹的BON基因可能也參與茶樹的生長發(fā)育及抗逆過程。其具體的功能有待下一步通過功能基因組學(xué)的方法進行鑒定明確。

[1]Creutz C E, Tomsig J L, Snyder S L, et a1. The copines, a novel class of C2 domain-containing, calcium-dependent,phospholipid-binding proteins conserved from Paramecium to humans [J]. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(3):1393-1402.

[2]Rizo J, Südhof T C. C2-domains, structure and function of a universal Ca2+-binding domain [J]. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(26): 15879-15882.

[3]Nalefski E A, Falke J J. The C2 domain calciumbinding motif: structural and functional diversity [J]. Protein Science,1996, 5(12): 2375-2390.

[4]Tomsig J L, Creutz C E. Copines: a ubiquitous family of Ca2+-dependent phospholipid-binding proteins [J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2002, 59(9): 1467-1477.

[5]Tomsig J L, Snyder S L, Creutz C E. Identification of targets for calcium signaling through the copine family of proteins.Characterization of a coiled-coil copine-binding motif [J].Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(12):10048-10054.

[6]Williams S C, Hinshelwood J, Perkins S J, et al. Production and functional activity of a recombinant von Willebrand factor-A domain from human complement factor B [J].Biochemical Journal, 1999, 342(3): 625-632.

[7]Zou B, Hong X, Ding Y, et al. Identification and analysis of copine/BONZAI proteins among evolutionarily diverse plant specie [J]. Genome, 2016, 59(8): 565-573.

[8]Yang S,Yang H, Grisafi P, et al. TheBON/CPNgene family represses cell death and promotes cell growth inArabidopsis[J]. Plant Journal, 2006, 45(2): 166-179.

[9]Wang X, Zhao Q, Ma C, et al. Global transcriptome profiles ofCamellia sinensisduring cold acclimation [J]. BMC Genomics, 2013, 14(1): 415.

[10]岳川, 曹紅利, 周艷華, 等. 茶樹谷胱甘肽還原酶基因CsGRs的克隆與表達分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(16):3277-3289.

[11]曹紅利, 岳川, 郝心愿, 等. 茶樹膽堿單加氧酶CsCMO的克隆及甜菜堿合成關(guān)鍵基因的表達分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(15): 3087-3096.

[12]Hao X, Horvath D, Chao W, et al. Identification and evaluation of reliable reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea plant (Camellia sinensis(L.) O.Kuntze) [J]. International Journal of Molecular Sciences,2014, 15(12): 22155-22172.

[13]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-delta delta C(T)) method [J]. Methods, 2001, 25(4):402-408.

[14]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J].Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.

[15]Gastegier E, Hoogland C, Gattuker A, et al. The proteomics protocols handbook [M]. Biochemistry, 2005: 571-607.

[16]Petersen T N, Brunak S, von Heijne G, et al. SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods, 2011, 8(10): 785-786.

[17]Zhou X, Lu P, Wulf G, et al. Phosphorylation-dependent prolyl isomerization: a novel signaling regulatory mechanism [J]. Cellular and Molecular Life Sciences , 1999,56(9/10): 788-806.

[18]Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence [J]. Journal of Molecular Biology, 2000,300(4): 1005-1016.

[19]Hardie G, Hanks S. The protein kinase factsbook [M].London: Academic, 1995: 402-404

[20]Thompson G A, Okuyama H. Lipid-linked proteins of plants[J]. Progress in Lipid Research, 2000, 39(1): 19-39.

[21]Li Y, Gou M, Sun Q, et al. Requirement of calcium binding,myristoylation, and protein–protein interaction for the CopineBON1function inArabidopsis[J]. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(39): 29884-29891.

[22]Hua J, Grisafi P, Cheng S H, et al. Plant growth homeostasis is controlled by theArabidopsisBON1andBAP1genes [J].Genes Development, 2001,17(15): 2263-2272.

[23]Yang S, Hua J. A haplotype-specific resistance gene regulated byBONZAI1mediates temperature-dependent growth control inArabidopsis[J]. Plant Cell, 2004, 16(4): 1060-1071.

Cloning and Expression Analysis of CsBON3 from Copine Gene Family in Tea Plant (Camellia sinensis)

YAO Lina, HAO Xinyuan, WANG Lu, LI Nana, ZENG Jianming, YANG Yajun*, WANG Xinchao*

Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Copine protein, a kind of Ca2+-dependent protein or phospholipid-binding protein containing two C2(N-terminal) and one vWA (C-terminal) conserved domain, plays an important role in intracellular signal transduction. Based on the sequence identity analysis, an EST sequence showing high homology to Copine family genes was selected from our previous tea plant transcriptome database. The sequence was verified to contain 1 746 bp complete ORF, encoding 581 amino acids. Homologous alignment showed that the gene had the highest similarity withArabidopsisAtBON3(65%) and was named asCsBON3(GenBank accession number: KY435900).Bioinformatic analysis showed that the molecular weight of CsBON3 protein was 63.66 kD and the theoretical isoelectric point was 5.48. It possesses the conserved domain unique to Copine family protein, which is a hydrophilic protein, no signal peptide site, non-secretory protein and no transmembrane domain. Expression analysis showed thatCsBON3had the highest expression levels in tea flowers and roots, and the lowest in stems and mature leaves. It was significantly up-regulated in tea plants treated with low temperature (4℃) for one day, and its expression was suppressed at dormant stage and up-regulated at growth stage. It was also up-regulated rapidly in the leaves with inoculation ofColletotrichum fructicola. The results indicated that theCsBON3plays important roles in tea plant growth in response to low temperature and disease resistance.

tea plant, Copine family, BON gene, stress response, dormancy, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2017)06-565-10

2017-01-18

2017-04-23

國家自然科學(xué)基金（31370690）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）資助

姚利娜，女，碩士研究生，主要從事茶樹種質(zhì)資源和育種研究。*通訊作者