劉亞芹，田坤紅，孫琪璐，潘鋮，李葉云，蔣家月，江昌俊,2*

1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥，230036；2. 信陽師范學(xué)院河南省茶樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽，464000

茶樹miR156a靶基因SPL6和SPL9的克隆及表達(dá)分析

劉亞芹1，田坤紅1，孫琪璐1，潘鋮1，李葉云1，蔣家月1，江昌俊1,2*

1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥，230036；2. 信陽師范學(xué)院河南省茶樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽，464000

MicroRNA156a-SQUAMOSA promoter binding-like protein（miR156a-SPLs）參與植物生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變、葉片形態(tài)建成和逆境脅迫等復(fù)雜的生理過程?；诓铇滢D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從茶樹中克隆出 2個(gè) SPL家族成員——CsSPL6和CsSPL9。CsSPL6cDNA全長(zhǎng)2 318 bp，ORF框長(zhǎng)1 668 bp，編碼555個(gè)氨基酸；CsSPL9cDNA全長(zhǎng)1 954 bp，ORF框長(zhǎng)1 116 bp，編碼371個(gè)氨基酸；CsSPL6和CsSPL9都有典型SBP結(jié)構(gòu)域和Csn-miR156a識(shí)別位點(diǎn)。時(shí)空表達(dá)特性分析表明，Csn-miR156a在芽中表達(dá)量最高，第 7葉中最低，與CsSPL6和CsSPL9呈負(fù)調(diào)控關(guān)系；不同品種（系）表達(dá)特性分析表明，Csn-miR156a的表達(dá)模式與新梢生長(zhǎng)量、光合指標(biāo)結(jié)果一致，與CsSPL6和CsSPL9表達(dá)模式相反，說明 Csn-miR156a、CsSPL6和CsSPL9參與茶樹生長(zhǎng)過程，Csn-miR156a和CsSPLs可作為初步判斷品種生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱的分子手段；高溫處理4個(gè)品種（系）表達(dá)特性表明Csn-miR156a與CsSPL9呈負(fù)相關(guān)，推斷茶樹在高溫脅迫下Csn-miR156a可能通過負(fù)調(diào)控CsSPL9來增加耐高溫性。Csn-miR156a負(fù)調(diào)控CsSPLs在茶樹生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫中發(fā)揮作用，為茶樹生長(zhǎng)和抗逆機(jī)制提供理論依據(jù)。

茶樹；生長(zhǎng)勢(shì)；高溫；miR156a；SPL

SQUAMOSA 啟動(dòng)子結(jié)合蛋白（SQUAMOSA promoter binding protein-like，SPL）是植物特有和保守的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，最先在金魚草[1]中分離。研究發(fā)現(xiàn)，miR156通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制擬南芥 SPL轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)從而調(diào)控植株生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、花青素積累、孢囊發(fā)育、赤霉素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及脅迫響應(yīng)等生理過程[2-7]。目前在擬南芥中已鑒定出 17個(gè) SPL家族成員，其中11個(gè)成員——SPL2、SPL3、SPL4、SPL5、SPL6、SPL9、SPL10、SPL11、SPL13a/b和SPL15具有miR156識(shí)別位點(diǎn)[8-10]，并且受其負(fù)調(diào)控。不同的SPL成員在擬南芥生長(zhǎng)階段發(fā)揮著不同的作用，ATSPL3、ATSPL4、ATSPL5調(diào)控階段轉(zhuǎn)變和開花[3,10]；ATSPL8參與花藥發(fā)育和赤霉素合成[11]；AtSPL9和AtSPL15調(diào)控葉原基長(zhǎng)度、器官大小、芽葉成熟[5,12]；ATSPL2、ATSPL10、ATSPL11在生殖生長(zhǎng)階段調(diào)控芽葉生長(zhǎng)[13]。

在逆境脅迫下，Cui等認(rèn)為miR156可被作為信號(hào)分子，通過miR156-SPL9-DFR的途徑參與植物生長(zhǎng)和非生物脅迫[14]。擬南芥在響應(yīng)高溫脅迫時(shí)，miR156表達(dá)量會(huì)急劇增加，SPL2和SPL11則表現(xiàn)降低趨勢(shì)[15]。苜蓿[16]在干旱脅迫下，miR156的過表達(dá)使其有更強(qiáng)的耐旱性，miR156通過下調(diào)SPL13的表達(dá)來提高抗旱性。對(duì)棉花進(jìn)行鹽脅迫和干旱脅迫發(fā)現(xiàn)，miR156通過負(fù)調(diào)控SPL2來提高耐受力[17]。磷酸鹽脅迫下，擬南芥的根際酸化能力與 miR156呈正調(diào)控關(guān)系，與SPL3呈負(fù)調(diào)控關(guān)系[18]。

近年來，SPL轉(zhuǎn)錄因子在越來越多的物種如枳[19]、水稻[8,20]、花生[21]、陸地棉[22]、草莓[23]等植物中被克隆。miR156-SPLs的功能與分子機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)，越來越多的功能被挖掘。然而目前研究的植物大多是草本植物，對(duì)于茶樹這樣的木本植物研究較少。本研究基于茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）方法克隆出CsSPL6和CsSPL9的基因全長(zhǎng)，檢測(cè) Csn-miR156a和CsSPLs在茶樹不同葉位、不同品種（系）和高溫脅迫中的表達(dá)量，為揭示 Csn-miR156a-CsSPLs在茶樹生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

植物材料選取生長(zhǎng)勢(shì)不同的東北抗、黃山白茶1號(hào)（C. sinensiscv. Huangshanbaicha）、舒茶早（C. sinensiscv. Shuchazao）、特香早（C.sinensiscv. Texiangzao）4個(gè)茶樹品種（系）。茶樹新株系東北抗是本課題組從祁門櫧葉群體種中篩選的優(yōu)良單株，通過多年觀察，發(fā)現(xiàn)該株系具有生長(zhǎng)旺盛、速度快和耐高溫的特性。

不同葉位：選取芽、第1葉、第3葉、第5葉、第7葉。高溫脅迫處理參數(shù)：溫度為38℃/28℃，相對(duì)濕度為80%/70%，平均光強(qiáng)為600 μmol·m-2·s-1，光周期為14 h/10 h。以處理0、1、2、3、4 d時(shí)間點(diǎn)的芽下第2葉為材料。每個(gè)樣品均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品采集后立即投入液氮處理，冷凍后–80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 茶樹生長(zhǎng)勢(shì)特性測(cè)定

新梢生長(zhǎng)量測(cè)定：腋芽萌發(fā)時(shí)選取生育期基本一致的進(jìn)行掛牌，每個(gè)品種（系）10株，每隔3 d測(cè)定芽葉生長(zhǎng)量[24]。

光合作用的測(cè)定：取芽下第3葉為測(cè)試材料，采用LI-COR 6400便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)分析儀（LI-COR，美國(guó)）在光強(qiáng)1 200 μmol·m-2·s-1，氣體流速500 μmol·s-1，CO2濃度 500 μmol·mol-1，葉溫(25±1)℃，空氣濕度(70±5)%條件下測(cè)定凈光合速率Pn、蒸騰速率Tr、氣孔導(dǎo)度Gs。

1.3 總RNA提取及cDNA的合成

實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)液氮研磨后，使用 RNAiso Plus提取試劑盒及Fruit-mate for RNA Purification（TaKaRa，大連）提取 RNA。用核酸定量?jī)x（Thermo Electron，美國(guó)）測(cè)定總RNA樣品的濃度、純度，用1.2%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，－80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，大連）試劑盒。

1.4 CsSPL6和CsSPL9基因全長(zhǎng)克隆

從茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得2個(gè)SPL轉(zhuǎn)錄因子序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物（表1），驗(yàn)證片段后通過 SMART-RACE-PCR技術(shù)對(duì)CsSPL6和CsSPL9的 3′和 5′端進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增以SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，美國(guó)）合成 3′和5′cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增體系為50 μL：10×LATaqbufferⅡ（Mg2+plus）5 μL，UPM（ 10 μmol·L-1） 5 μL ， dNTP Mixure (2.5 mmol·L-1) 4 μL ， RACE GSP primer（ 10 μmol·L-1）1 μL，cDNA 1 μL，LA Taq（5 U·μL-1）0.3 μL，ddH2O 33.7 μL。PCR 擴(kuò)增參數(shù)為：94℃3 min；94℃ 30 s、72℃ 2 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃30 s、70℃ 30 s、72℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃30 s、65℃ 30 s、72℃ 2 min，25 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。第二輪擴(kuò)增以第一輪稀釋 50倍的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系同第一輪擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)：94℃ 3 min，94℃ 45 s，67℃ 45 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。產(chǎn)物用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen，美國(guó)）試劑盒進(jìn)行回收，連接pMD 19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR挑選陽性克?。ㄖ辽?個(gè)重復(fù)），測(cè)序由上海生工有限公司完成。獲得全長(zhǎng)序列后，跨開放閱讀框（ORF）設(shè)計(jì)特異引物，驗(yàn)證序列完整性。

1.5 序列生物信息學(xué)分析

用EditSeq和MegAlign軟件查詢ORF框、氨基酸序列。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量用EditSeq軟件分析，ExPASY-ProtScale（http://web.expasy.org/protscale）預(yù)測(cè)親/疏水性，SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0）預(yù)測(cè)信號(hào)肽，TMHMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）預(yù)測(cè)跨膜螺旋，NetPlos2.0 PredictProtein （https://ppopen.informatik.tu-muenchen.de）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，SOPMA （https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS

MODEL （https://swissmodel.expasy.org/interactive）模擬蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)在NCBI(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行，用Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo）比對(duì)蛋白質(zhì)的同源性序列，擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、葡萄（Vitis vinifera）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）SBP轉(zhuǎn)錄因子基因序列參照文獻(xiàn)[21]，利用MEGA5.1[25]軟件并通過鄰接（N-J）算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 茶樹Csn-miR156a和SPLs的表達(dá)分析

熒光定量分析東北抗不同葉位、4個(gè)品種（系）間和高溫脅迫下 Csn-miR156a和SPLs的表達(dá)。根據(jù) miR156a成熟序列設(shè)計(jì)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和 miR156a熒光定量正反向引物[26]。Csn-miR156a熒光定量?jī)?nèi)參為Csn-pc-3p-222[27]，CsSPLs的內(nèi)參為 GAPDH。熒光定量實(shí)驗(yàn)體系和反應(yīng)參數(shù)按照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa，大連）說明進(jìn)行。采用 CFX96TMReal-Time PCR Detection System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。驗(yàn)證目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增范圍，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsSPL6和CsSPL9的全長(zhǎng)克隆和序列分析

以 CsSPL6-3′RACE和 CsSPL6-5′RACE引物分別擴(kuò)增出約1 000 bp（圖1-A）和750 bp（圖1-B）的片段，拼接后利用引物CsSPL6-F/R驗(yàn)證ORF框完整性（圖1-C）。經(jīng)測(cè)序和分析，得到CsSPL6全長(zhǎng)為2 318 bp，包含1個(gè)1 688 bp完整的ORF框，編碼1個(gè)由 555個(gè)氨基酸組成的蛋白（圖 2）。預(yù)測(cè)蛋白分子量為 60.44 kDa，等電點(diǎn)為 6.58。以引物 CsSPL9-3′RACE擴(kuò)增出 500 bp（圖 1-D）左右的片段，CsSPL9-5′RACE擴(kuò)增出1 200 bp（圖 1-E）左右的條帶，利用 CsSPL9-F/R驗(yàn)證ORF框完整性（圖1-F）。測(cè)序分析表明，茶樹CsSPL9基因全長(zhǎng)1 954 bp，完整ORF框大小為1 116 bp，編碼371個(gè)氨基酸（圖2）。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量是 39.62 kDa，等電點(diǎn)為8.3。CsSPL6和CsSPL9序列提交至GenBank，登錄號(hào)KX808499和KY569510。

CsSPL6和 CsSPL9蛋白為親水性蛋白，Score值小于0.5，不存在信號(hào)肽。CsSPL6不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白。在CsSPL9上發(fā)現(xiàn)1處由內(nèi)到外的跨膜螺旋和1處由外到內(nèi)的跨膜螺旋，存在跨膜區(qū)域，屬于跨膜蛋白，CsSPL6和CsSPL9定位于細(xì)胞核。CsSPL6由9.55%的 α-螺旋（Alpha helix）、11.89%的 β-折疊（Beta sheet）和 55.41%的無規(guī)則卷曲（Random coil）組成，CsSPL9由19.41%的α-螺旋、8.63%的β-折疊和52.02%的無規(guī)則卷曲組成。CsSPL6和CsSPL9屬于α/β型（圖3），具有高等植物轉(zhuǎn)錄因子特有的SBP結(jié)合域。

圖 1 茶樹 CsSPL6和 CsSPL9全長(zhǎng) cDNAFig. 1 Full cDNA sequences of CsSPL6 and CsSPL9 in C. sinensis

圖3 預(yù)測(cè)的CsSPL6/CsSPL9蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 3 Tertiary structure prediction of protein CsSPL6/CsSPL9

圖2 CsSPL9和CsSPL6 cDNA全長(zhǎng)與推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Full cDNA sequences of CsSPL9 and CsSPL6 and their deduced amino acids

續(xù)圖2 CsSPL9和CsSPL6 cDNA全長(zhǎng)與推導(dǎo)的氨基酸序列Continued Fig. 2 Full cDNA sequences of CsSPL9 and CsSPL6 and their deduced amino acids

2.2 CsSPL6和CsSPL9的進(jìn)化分析和氨基酸序列的比對(duì)

為進(jìn)一步分析CsSPL6和CsSPL9轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化，將CsSPL6和CsSPL9的氨基酸序列與 34條雙子葉植物（擬南芥和葡萄）、19條單子葉植物（水稻）、13條無花植物（小立碗蘚）的SBP序列進(jìn)行比對(duì)，參考Li[21]的分類方法，構(gòu)建同源進(jìn)化樹，SPL轉(zhuǎn)錄家族被分成 6組（圖 4）。CsSPL6與AtSPL6（At1g69170）、VvSBP1（XM002273498.1）、VvSBP16（XM002265167.1）聚在一類，屬于G2組；CsSPL9與VvSBP8（XM002278476.1）、AtSPL9（At2g42200）、AtSPL15（At3g57920）同處一個(gè)分支，屬于G1組，推測(cè)CsSPL9與VvSBP8、AtSPL9、AtSPL15具有相似的生物學(xué)功能。而小立碗蘚SBP轉(zhuǎn)錄因子沒有聚類在G1和G2，說明茶樹CsSPL6和CsSPL9轉(zhuǎn)錄因子和小立碗蘚親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，而和擬南芥、葡萄較近。不同物種的 SBP轉(zhuǎn)錄因子并沒有聚在一起，演化情況可能比較復(fù)雜。

圖4 茶樹CsSPL6和CsSPL9轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of CsSPL6 and CsSPL9 transcription factors in C. sinensis

對(duì)茶樹CsSPL6和CsSPL9轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CsSPL6和CsSPL9都含有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域（圖5-A和圖5-B）和 miR156a的識(shí)別位點(diǎn)。通過 BlastP同源序列檢索與多序列比對(duì)，CsSPL6與葡萄（XP_010663469.1）、可可（XP_017973789.1）、棗（XP_015883292.1）相似度分別為61.10%、61.63%和59.15%；CsSPL9與葡萄（ADG36380.1）、番薯（XP_019186327.1）和可可（XP_017977243.1）的相似度達(dá)65.51%、54.59%和59.31%，而且SBP結(jié)構(gòu)域在植物中高度保守（圖5-C）。

圖5 茶樹CsSPL6（A）和CsSPL9（B）轉(zhuǎn)錄因子的保守域預(yù)測(cè)及和同源物種SBP結(jié)構(gòu)域比對(duì)（C）Fig. 5 Prediction of CsSPL6 (A) and CsSPL9 (B) conserved domains and alignment of SBP domain in C. sinensis and homologous proteins in other species (C)

2.3 茶樹Csn-miR156a和SPLs表達(dá)機(jī)制分析

2.3.1 不同葉位時(shí)序表達(dá)

如圖 6顯示，CsSPL6和CsSPL9以及Csn-miR156a在不同葉位中均有所表達(dá)，但表達(dá)量存在差異。Csn-miR156a在芽中表達(dá)量最高，隨著葉位的增加，表達(dá)量依次降低；CsSPL6和CsSPL9的表達(dá)情況一致，表達(dá)量在芽中最低，第7葉中最高，分別是芽的2.3和2.9倍，與Csn-miR156a的表達(dá)模式相反。

2.3.2 不同生長(zhǎng)勢(shì)品種（系）表達(dá)

右圖7可見，CsSPL6、CsSPL9和Csn-miR156a在4個(gè)品種（系）間表達(dá)量差異明顯。Csn-miR156a在4個(gè)品種（系）的表達(dá)量東北抗最高，特香早最低；而CsSPL6和CsSPL9的表達(dá)趨勢(shì)一致，與Csn-miR156a呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

新梢生長(zhǎng)勢(shì)的測(cè)定結(jié)果表明（圖 8），4個(gè)品種（系）生長(zhǎng)速度東北抗最快，特香早最慢。光合指標(biāo)中（表2），Pn和Tr結(jié)果一致，東北抗最高，特香早最低，而Gs結(jié)果相反。生長(zhǎng)勢(shì)高的植物Pn和Tr高，Gs低[28-29]，即植物光合能力強(qiáng)而呼吸作用弱，有利于干物質(zhì)積累，增加植物產(chǎn)量。新梢生長(zhǎng)勢(shì)和光合作用指標(biāo)測(cè)定結(jié)果與 Csn-miR156a的表達(dá)量的趨勢(shì)一致。東北抗生長(zhǎng)速度最快，Csn-miR156a的表達(dá)量最高；特香早生長(zhǎng)最慢，Csn-miR156a的表達(dá)量最低。

圖6 茶樹不同葉位Csn-miR156a-CsSPLs表達(dá)水平的qRT-PCR分析Fig. 6 Expression profiles of the Csn-miR156a-CsSPLs in different leaf positions

圖7 茶樹不同品種（系）Csn-miR156a-CsSPLs表達(dá)水平的qRT-PCR分析Fig. 7 Expression analysis of Csn-miR156a-CsSPLs in different varieties (strains) by qRT-PCR

圖8 不同品種（系）的新梢長(zhǎng)度和生長(zhǎng)速率比較Fig. 8 Comparison of new shoots length and growth rate of different tea cultivars(strains)

表2 不同茶樹品種（系）光合指標(biāo)Table 2 Photosynthesis indexes of different tea cultivars (strains)

2.3.3 響應(yīng)高溫脅迫表達(dá)

從圖 9可以看出，高溫影響CsSPL6、CsSPL9和Csn-miR156a的表達(dá)，東北抗和黃山白茶1號(hào)Csn-miR156a在處理的第1天表達(dá)量達(dá)到最高，之后表達(dá)水平下降，Csn-miR156a的表達(dá)量在4個(gè)品種（系）順序?yàn)闁|北抗＞黃山白茶 1號(hào)＞特香早＞舒茶早。黃山白茶 1號(hào)和舒茶早在處理 1天后CsSPL6表達(dá)量達(dá)最高，分別達(dá)到對(duì)照的1.7和2.4倍，隨后呈下降趨勢(shì)，仍維持很高水平；特香早經(jīng)高溫處理后CsSPL6呈波動(dòng)下降趨勢(shì)并在處理第3天降至最低。東北抗在處理的第 2天和第 4天CsSPL9的表達(dá)量急劇增加，是對(duì)照的3.9倍；舒茶早高溫脅迫 1 d后，CsSPL9劇增達(dá)最大值，是對(duì)照4.3倍，之后表達(dá)量下降仍高于處理前水平。高溫脅迫下，CsSPL6的表達(dá)不受Csn-miR156a調(diào)控，而CsSPL9受Csn-miR156a負(fù)調(diào)控。

3 討論

3.1 CsSPL6和CsSPL9的克隆及序列分析

從茶樹中克隆出 SPL家族中 2個(gè)成員——CsSPL6和CsSPL9的 cDNA全長(zhǎng)序列。序列分析發(fā)現(xiàn)，CsSPL6編碼555個(gè)氨基酸，CsSPL9編碼371個(gè)氨基酸。CsSPL6和CsSPL9編碼蛋白序列都含SBP結(jié)構(gòu)域和miR156a的識(shí)別位點(diǎn)。SBP結(jié)構(gòu)域由79個(gè)保守的氨基酸殘基組成，結(jié)合 2個(gè)鋅離子形成鋅指結(jié)構(gòu)（Zinc-finger domain）[30]。2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)均由3個(gè)半胱氨酸和1個(gè)組氨酸殘基形成四面體并結(jié)合1個(gè)鋅離子，從而形成穩(wěn)定的構(gòu)象。其中N-端構(gòu)成是Cys-Cys-Cys-His，C-端是Cys-Cys-His-Cys，C末端帶有1個(gè)雙向核定位信號(hào)（Nuclear Localization Signal）KRXXXRRRK[1]，與第2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)有部分重疊。Birkenbihl[31]等研究表明，該信號(hào)肽序列可以引導(dǎo) SBP蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)控下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)茶樹CsSPL6和CsSPL9轉(zhuǎn)錄因子分別屬于G2組和G1組，并且和小立碗蘚親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，而和擬南芥、葡萄較近；這可能和 SBP轉(zhuǎn)錄因子序列長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)域起始位置、外顯子數(shù)量及miRNA識(shí)別位點(diǎn)的差異性有關(guān)[19]。

3.2 Csn-miR156a和CsSPLs的表達(dá)分析

miR156a在擬南芥和大豆第1、2葉表達(dá)水平高，隨著葉位增加，表達(dá)水平大幅降低[32-34]。miR156a在頂芽中表達(dá)量最高并在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中與 SPL呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[35]。目前研究證明 miR156a隨發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量降低的時(shí)序降低機(jī)制可能涉及到內(nèi)源信號(hào)分子響應(yīng)[36]。在本研究中Csn-miR156a與CsSPL6和CsSPL9呈負(fù)調(diào)控，推測(cè)Csn-miR156a通過負(fù)調(diào)控CsSPL6和CsSPL9參與茶樹生長(zhǎng)過程[37]，在茶樹生長(zhǎng)階段發(fā)育和轉(zhuǎn)變中起重要作用。

在不同茶樹品種（系）的表達(dá)模式中，Csn-miR156a表達(dá)趨勢(shì)與新梢生長(zhǎng)量以及光合指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致，與CsSPLs呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。目前這方面的研究較少，初步推斷Csn-miR156a和CsSPLs表達(dá)機(jī)制可能是茶樹生長(zhǎng)過程中的重要組成部分，Csn-miR156a表達(dá)量越高，CsSPLs表達(dá)量越低，植物生長(zhǎng)可能越快，反之，則越慢，推測(cè) Csn-miR156a和CsSPLs表達(dá)機(jī)制可作為判斷植物生長(zhǎng)快慢的重要分子指標(biāo)。

高溫脅迫下不同茶樹品種（系）、不同處理時(shí)間 Csn-miR156a和CsSPLs表達(dá)有所差異，說明在高溫脅迫下存在調(diào)控關(guān)系。在脅迫處理第1天，Csn-miR156a通過急劇上調(diào)減少高溫對(duì)植物體的傷害，與Xin等[38]、Stief等[15]研究結(jié)果一致。蕓薹屬蔬菜作物受高溫脅迫后，miR156也是下調(diào)SPL2來增加耐受性[39]。干旱條件下研究miR156與其呈負(fù)調(diào)控關(guān)系的靶基因SPL6、SPL12、SPL13的表達(dá)模式時(shí)，發(fā)現(xiàn)SPL6、SPL12表達(dá)不顯著，無規(guī)律，而SPL13表達(dá)量明顯下調(diào)從而增加氣孔導(dǎo)度、減少水分缺失。推測(cè)在干旱脅迫中，miR156調(diào)控SPL13占主導(dǎo)部分從而提高抗旱能力[16]。SPL基因家族在響應(yīng)鹽脅迫后會(huì)刺激二級(jí)代謝產(chǎn)物如 VATP、GRP、NHX1、RCI2、H＋-ATP酶和SOS1等的合成，從而直接或間接地參與逆境脅迫[17,40-41]。在本研究中，不同茶樹品種（系）在高溫脅迫下，CsSPL9與Csn-miR156a呈負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)椴铇湓诟邷孛{迫下Csn-miR156a通過下調(diào)CsSPL9來增加耐高溫性，而其他CsSPLs成員的作用則可能是通過刺激二級(jí)代謝產(chǎn)物的合成來達(dá)到抵抗高溫的作用，但目前這些產(chǎn)物及其作用機(jī)制還是未知的，需進(jìn)一步研究。

本研究通過茶樹生長(zhǎng)勢(shì)測(cè)定或者高溫脅迫初步揭示 Csn-miR156a-CsSPL的表達(dá)機(jī)制可以反映植物的生長(zhǎng)快慢以及耐高溫程度。但關(guān)于 miR156-SPLs處于怎樣的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，miR156的表達(dá)受哪些上游基因的時(shí)序調(diào)控，及SPLs的下游調(diào)控基因是什么等問題都有待更多研究去揭示。

[1]Klein J, Saedler H, Huijser P. A new family of DNA binding proteins includes putative transcriptional regulators of the Antirrhinum majus floral meristem identity gene SQUAMOSA [J]. Mol Gen Genet, 1996, 250(1): 7-16.

[2]Yu S, Galvao V C, Zhang Y C, et al. Gibberellin regulates theArabidopsisfloral transition through miR156-targeted SQUAMOSA promoter binding-like transcription factors [J].Plant Cell, 2012, 24(8): 3320-3332.

[3]Wu G, Poethig R S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3 [J]. Development, 2006, 133(18): 3539-3547.

[4]Wang J W, Czech B, Weigel D. miR156-Regulated SPL transcription factors define an endogenous flowering pathway inArabidopsis thaliana[J]. Cell, 2009, 138(4):738-749.

[5]Schwarz S, Grande A V, Bujdoso N, et al. The microRNA regulated SBP-box genesSPL9andSPL15control shoot maturation inArabidopsis[J]. Plant Molecular Biology,2008, 67(1/2): 183-195.

[6]Jung J H, Seo P J, Kang S K, et al. miR172 signals are incorporated into the miR156 signaling pathway at theSPL3/4/5genes inArabidopsisdevelopmental transitions [J].Plant Molecular Biology, 2011, 76(1/2): 35-45.

[7]Eriksson M, Moseley J L, Tottey S, et al. Genetic dissection of nutritional copper signaling in chlamydomonas distinguishes regulatory and target genes [J]. Genetics, 2004,168(2): 795-807.

[8]Yang Z, Wang X, Gu S, et al. Comparative study of SBP-box gene family in Arabidopsis and rice [J]. Gene, 2008,407(1/2): 1-11.

[9]Rhoades M W, Reinhart B J, Lim L P. Prediction of plant microrna targets [J]. Cell, 2002, 110(4): 513-520.

[10]Gandikota M, Birkenbihl R P, H?hmann S, et al. The miRNA156/157 recognition element in the 3' UTR of theArabidopsisSBP box gene SPL3 prevents early flowering by translational inhibition in seedlings [J]. Plant Journal for Cell amp; Molecular Biology, 2007, 49(4): 683-693.

[11]Zhang Y, Schwarz S, Saedler H, et al. SPL8, a local regulator in a subset of gibberellin-mediated developmental processes inArabidopsis[J]. Plant Molecular Biology, 2007, 63(3):429-439.

[12]Wang J W, Schwab R, Czech B, et al. Dual effects of miR156-targeted SPL genes and CYP78A5/KLUH on plastochron length and organ size inArabidopsisthaliana[J].Plant Cell, 2008, 20(5): 1231-1243.

[13]Shikata M, Koyama T, Mitsuda N, et al.ArabidopsisSBP-box genes SPL10, SPL11 and SPL2 control morphological change in association with shoot maturation in the reproductive phase [J]. Plant amp; Cell Physiology, 2009,50(12): 2133-2145.

[14]Cui L, Shan J, Shi M, et al. The miR156-SPL9-DFR pathway coordinates the relationship between development and abiotic stress tolerance in plants [J]. Plant Journal for Cell amp;Molecular Biology, 2014, 80(6): 1108-1117.

[15]Stief A, Altmann S, Hoffmann K, et al.ArabidopsismiR156 regulates tolerance to recurring environmental stress through spl transcription factors [J]. The Plant Cell, 2014, 26(4):1792-1807.

[16]Arshad M, Feyissa B A, Amyot L, et al. MicroRNA156 improves drought stress tolerance in alfalfa (Medicago sativa) by silencing SPL13 [J]. Plant Science, 2017,258:122-136.

[17]Wang M, Wang Q, Zhang B. Response of miRNAs and their targets to salt and drought stresses in cotton (Gossypium hirsutumL.) [J]. Gene, 2013, 530(1): 26-32.

[18]Lei K J, Lin Y M, An G Y. miR156 modulates rhizosphere acidification in response to phosphate limitation inArabidopsis[J]. Journal of Plant Research, 2016, 129(2):275-284.

[19]宋長(zhǎng)年, 錢劍林, 房經(jīng)貴, 等. 枳 SPL9和 SPL13全長(zhǎng)cDNA克隆、亞細(xì)胞定位和表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010, 43(10): 2105-2114.

[20]Miura K, Ikeda M, Matsubara A, et al. OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice [J].Nature Genetics, 2010, 42(6): 545-549.

[21]Li M, Zhao S Z, Zhao C Z, et al. Cloning and characterization of SPL-family genes in the peanut (Arachis hypogaeaL.) [J]. Genetics and Molecular Research, 2015,14(1): 2331-2340.

[22]Zhang X, Dou L, Pang C, et al. Genomic organization,differential expression, and functional analysis of the SPL gene family inGossypium hirsutum[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2015, 290(1): 115-126.

[23]趙曉初, 李賀, 代紅艷, 等. 草莓 miR156靶基因 SPL9的克隆與表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(12):2515-2522.

[24]李磊. 不同肥料處理對(duì)茶樹生長(zhǎng)和茶葉品質(zhì)的影響[D].泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[25]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J].Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.

[26]Erika V G. Stem-Loop qRT-PCR for the detection of plant microRNAs [M]. Totowa N J: Humana Press, 2016.

[27]謝小芳. 茶樹 miRNA靶基因的鑒定及在低溫脅迫下的表達(dá)分析[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[28]張永福, 任禛, 莫麗玲, 等. 葡萄品種生長(zhǎng)勢(shì)差異的相關(guān)機(jī)制研究[J]. 北方園藝, 2015 (2): 1-5.

[29]楊雨華, 宗建偉, 楊風(fēng)嶺. 不同生長(zhǎng)勢(shì)馬尾松光合日變化研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2014, (8):25-29.

[30]Yamasaki K, Kigawa T, Inoue M, et al. A novel zinc-binding motif revealed by solution structures of DNA-binding domains of Arabidopsis SBP-family transcription factors [J].Journal of Molecular Biology, 2004, 337(1): 49-63.

[31]Birkenbihl R P, Jach G, Saedler H, et al. Functional dissection of the plant-specific sbp-domain: overlap of the dna-binding and nuclear localization domains [J]. Journal of Molecular Biology, 2005, 352(3): 585-596.

[32]Yang L, Conway S R, Poethig R S. Vegetative phase change is mediated by a leaf-derived signal that represses the transcription of miR156 [J]. Development, 2011, 138(2):245-249.

[33]Yoshikawa T, Ozawa S, Sentoku N, et al. Change of shoot architecture during juvenile-to-adult phase transition in soybean [J]. Planta, 2013, 238(1): 229-237.

[34]Gou J Y, Felippes F F, Liu C J, et al. Negative regulation of anthocyanin biosynthesis inArabidopsisby a miR156-targeted SPL transcription factor [J]. Plant Cell,2011, 23(4): 1512-1522.

[35]Salinas M, Xing S, H?hmann S, et al. Genomic organization,phylogenetic comparison and differential expression of the SBP-box family of transcription factors in tomato[J]. Planta,2012, 235(6): 1171-1184.

[36]馮圣軍. MicroRNA156調(diào)控?zé)煵莅l(fā)育階段轉(zhuǎn)變的功能研究[D]. 臨安: 浙江農(nóng)林大學(xué), 2014.

[37]虞莎, 王佳偉. miR156介導(dǎo)的高等植物年齡途徑研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)科學(xué), 2014, 59(15): 1398-1404.

[38]Xin M M, Wang Y, Yao Y Y, et al. Diverse set of microRNAs are responsive to powdery mildew infection and heat stress in wheat [J]. BMC Plant Biology, 2010, 10: 123-133.

[39]Yu X, Wang H, Lu Y Z, et al. Identification of conserved and novel microRNAs that are responsive to heat stress in Brassica rapa [J]. Journal of Experimental Botany, 2012,63(2): 1025-1038.

[40]Arshad M, Gruber M Y, Wall K, et al. An insight into microrna156 role in salinity stress responses of alfalfa [J].Frontiers in Plant Science, 2017, 8(658):356-370.

[41]Yu Z X, Wang L J, Zhao B, et al. Progressive regulation of sesquiterpene biosynthesis inArabidopsisand patchouli(Pogostemon cablin) by the miR156-Targeted SPL transcription factors [J]. Molecular Plant, 2014, 8(1): 98-110.

Cloning and Expression Analysis of miR156a-targeted Genes SPL 6 and SPL9 in Camellia sinensis

LIU Yaqin1, TIAN Kunhong1, SUN Qilu1, PAN Cheng1,LI Yeyun1, JIANG Jiayue1, JIANG Changjun1,2*

1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;2. Henan Key Laboratory of Tea Biology, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, China

MicroRNA156a-SQUAMOSA promoter binding-like protein（miR156a-SPLs）play important roles in growth process, formation of leaves and response to stress in tea plant (Camellia sinensis). Based on transcriptome data, two cDNACsSPL6(2 318 bp) andCsSPL9(1 954 bp) were cloned from tea plant. The nucleotide and amino acid sequences, biological information, phylogenetic tree and molecular expression models of theCsSPL6andCsSPL9were analyzed. Sequence analysis showed that the open reading frames ofCsSPL6andCsSPL9are 1 668 bp and 1 116 bp, encoding 555 and 371 amino acids respectively. Both genes contain typical SBP domain and the recognition sites of microRNA156a. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression profile of Csn-miR156a was the highest in the buds, and the lowest in the 7th leaves, which was negatively correlated withCsSPL6andCsSPL9. For different varieties(strains), the expression of Csn-miR156a was consistent with the growth of new shoots and the value of Photosynthesis index, but negatively correlated with the expression ofCsSPL6 and CsSPL9,indicating. Csn-miR156a,CsSPL6andCsSPL9were involved in the growth of tea plant and can be used as markers to assess growth abilities among varieties. In addition, the expression ofCsSPL9was negatively correlatedwith Csn-miR156a under heat stress in four varieties (strains), which might be associated with the enhanced heat tolerance ability. The results showed that the expression ofCsSPLswere negatively regulated by Csn-miR156a,which played an important role in the growth, development of tea plant and the stress resistance,providing a theoretical basis for understanding the growth and resistance mechanism of tea plant.

Camellia sinensis, growth potential, high temperature, miR156a, SPL

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2017)06-551-14

2017-07-04

2017-08-05

茶樹響應(yīng)低溫脅迫的microRNA發(fā)掘及其調(diào)控機(jī)制研究（31270729）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31270729）

劉亞芹，女，碩士研究生，主要從事茶樹種質(zhì)資源與育種。*通訊作者：jiangcj@ahau.edu.cn