陳丹，俞瀅，岳川，王鵬杰，陳靜，陳桂信，葉乃興

福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002

茶樹△12-脂肪酸去飽和酶基因FAD2和FAD6的克隆與表達(dá)分析

陳丹，俞瀅，岳川，王鵬杰，陳靜，陳桂信*，葉乃興*

福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002

本研究在茶樹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，以鐵觀音茶樹的芽葉為材料，采用 RT-PCR技術(shù)，克隆了茶樹不飽和脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵限速酶—△12-FAD（△12-脂肪酸去飽和酶）基因的包含完整ORF的cDNA序列（CsFAD2和CsFAD6）。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CsFAD2的全長(zhǎng)為1 184 bp，其開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度1 149 bp，編碼 382個(gè)氨基酸，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其氨基酸序列與油茶FAD2的同源性最高達(dá) 97%；CsFAD6的全長(zhǎng)為1 425 bp，其ORF長(zhǎng)度為1 311 bp，編碼436個(gè)氨基酸，定位于葉綠體上,其氨基酸序列與葡萄FAD6同源性達(dá)81%。熒光定量PCR結(jié)果表明，鐵觀音茶樹幼苗在4℃低溫脅迫處理72 h過(guò)程中，這兩個(gè)基因的表達(dá)均受低溫的誘導(dǎo)，其表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在處理48 h時(shí)，表達(dá)量水平最高；在100 g·L-1的PEG脅迫處理12 h過(guò)程中，這兩個(gè)基因的表達(dá)均受PEG脅迫處理的誘導(dǎo)；在ABA（100 μmol·L-1）脅迫處理72 h過(guò)程中，在處理 6～24 h期間，CsFAD2的表達(dá)量顯著升高，而CsFAD6的表達(dá)不受 ABA處理的影響，CsFAD6的表達(dá)量在處理72 h時(shí)顯著降低；在NaCl（250 mmol·L-1）脅迫72 h過(guò)程中，CsFAD2的表達(dá)量全程降低，而CsFAD6在處理24～72 h期間表達(dá)量顯著升高。

茶樹；△12-脂肪酸去飽和酶；非生物脅迫；基因表達(dá)

在逆境下，植物細(xì)胞中的不飽和脂肪酸的含量及其組成發(fā)生改變，以維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，降低逆境對(duì)膜結(jié)構(gòu)的損害，增強(qiáng)植物的抗逆性，因此，調(diào)控植物細(xì)胞中不飽和脂肪酸的代謝，對(duì)于研究植物的抗逆機(jī)制具有重要意義。前人研究結(jié)果表明[1-3]，催化不飽和脂肪酸合成的酶基因發(fā)生突變，植物細(xì)胞中不飽和脂肪酸的含量減少，植物的抗逆性（抗寒性等）減弱。

在植物不飽和脂肪酸的合成代謝途徑中，△12-不飽和脂肪酸合成酶（FAD），是催化油酸脫氫形成亞油酸的關(guān)鍵限速酶，F(xiàn)AD是一種膜結(jié)合蛋白，存在于植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)體膜及藍(lán)細(xì)菌的類囊體膜上，在單不飽和脂肪酸油酸（Oleic acid，18: 1△9）的第 12和 13位碳原子之間插入1個(gè)雙鍵，形成2個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸亞油酸（Oleic acid，18：2△9,12）[4]。根據(jù)電子供體和細(xì)胞定位不同，有 FAD2和FAD6兩種類型，F(xiàn)AD2以細(xì)胞色素b5為電子供體，位于植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，F(xiàn)AD6以鐵氧還蛋白為電子供體，是 FAD2質(zhì)體型同工酶，存在于植物細(xì)胞的質(zhì)體中，因此，F(xiàn)AD2和FAD6具有相同的生理功能，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[5]。

目前已經(jīng)在多種植物上分離了△12-FAD基因全長(zhǎng)cDNA，研究表明該基因表達(dá)受多種逆境脅迫的誘導(dǎo)，并采用轉(zhuǎn)基因手段驗(yàn)證了該基因的功能。熒光定量PCR研究結(jié)果表明，在低溫脅迫下，佛手香櫞葉的FAD2[6]、棉花葉的FAD2-3和FAD2-4[7]、油橄欖果實(shí)的FAD2-1和FAD2-2[8-9]及馬齒莧葉的FAD2-2[10]的表達(dá)量隨著溫度的降低而顯著升高；在冷凍脅迫下，白楊PtFAD2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的存活率明顯比非轉(zhuǎn)基因株系和轉(zhuǎn)基因下調(diào)株系要高[11]。油橄欖FAD2和FAD6受光的調(diào)節(jié)，F(xiàn)AD2表達(dá)還受機(jī)械損傷的誘導(dǎo)[9,12]，利馬豆FAD2的表達(dá)受到NaCl和PEG的誘導(dǎo)[13]。

在茶樹上，僅在龍井43上克隆了2個(gè)不飽和脂肪酸合成酶基因（FAD7和FAD8）[14]，并研究了這 2個(gè)基因在非生物脅迫下表達(dá)量的變化，其他有關(guān)茶樹不飽和脂肪酸合成酶基因與逆境脅迫關(guān)系的研究甚少，因此，揭示茶樹FAD的功能及其對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制，對(duì)于茶樹抗逆性育種具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。本研究在茶樹轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，以鐵觀音茶樹芽葉為材料，采用RT-PCR技術(shù)，獲得鐵觀音不飽和脂肪酸合成代謝關(guān)鍵限速酶——△12-FAD的包含完整ORF的cDN A，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)該基因在低溫、干旱、高鹽脅迫和ABA處理下，其表達(dá)量的變化，初步揭示△12-FAD基因在逆境脅迫下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

取生長(zhǎng)良好、大小一致的兩年生盆栽鐵觀音品種茶樹為材料，茶苗的種植、生長(zhǎng)均在露天茶園。

分子生物學(xué)試劑：pEASYT?-T1載體、T1感受態(tài)細(xì)胞、TransTaq HiFi DNA Polymerase、Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix和Transstart? Tip Green qPCR superMix 試劑盒購(gòu)自全式金生物技術(shù)（北京）有限公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

茶樹芽葉總RNA提取方法按天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒方法進(jìn)行，對(duì)RNA進(jìn)行濃度、完整性等質(zhì)量檢驗(yàn)。參照全式金Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒的說(shuō)明合成 cDNA用于RT-PCR。

1.2.2 基因ORF全長(zhǎng)克隆

在前期鐵觀音茶樹芽葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)序列注釋的信息，從中篩選出相關(guān)的FAD編碼的EST序列，通過(guò)序列比對(duì)獲得與其他植物中報(bào)道的FAD2和FAD6高度同源的片段序列，DNAstar軟件拼接，分別獲得含有兩個(gè)基因包含完整 ORF的 cDNA序列，它們均具有完整開放閱讀框。為了進(jìn)一步驗(yàn)證序列在鐵觀音品種中的準(zhǔn)確性，在起始密碼子上游和終止密碼子下游設(shè)計(jì)RT-PCR引物（表 1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)體系和程序參照姚雪倩等[15]的方法；反應(yīng)條件為 94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，2 min，35個(gè)循環(huán)，后續(xù)克隆試驗(yàn)參照俞瀅等[16]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序后，得到這兩個(gè)基因包含完整ORF的cDNA序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

用 DNAstar軟件包對(duì)序列進(jìn)行拼接；用DNAMAN 軟件進(jìn)行開放閱讀框查詢；核酸序列及氨基酸序列分別在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAsTn和BLAsTx分析；在 MEGA5.0軟件中用鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；在EXPASY（http://expasy.org/tools）中用 ProtParam 及TargetP、singalP、TMHMM、Wolf Psort等工具對(duì)氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；用SOPMA模擬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

表1 試驗(yàn)引物及其序列Table1 Primer Sequences of this study

1.2.4 茶樹逆境脅迫實(shí)驗(yàn)

露天茶園中取生長(zhǎng)健壯的2年生盆栽茶樹分別用于低溫（4℃）、ABA（100 μmol·L-1）、高鹽（250 mmol·L-1NaCl）和干旱（100 g·L-1PEG）處理。低溫處理：調(diào)節(jié)氣候箱溫度，維持在(4±1)℃，將整株茶樹迅速置于氣候箱中，進(jìn)行低溫脅迫處理，根據(jù)前期的研究結(jié)果[14]，在處理后的 0、1、3、6、12、24、48、72 h取樣。ABA處理參考曹紅利等[17]的方法，用100 μmol·L-1ABA 溶液噴灑茶樹，進(jìn)行 ABA脅迫處理，分別在處理后的0、6、12、24、48、72 h取樣；NaCl和PEG處理方法參考岳川等[18]方法，用 250 mmol·L-1NaCl溶液噴灑茶樹，進(jìn)行鹽脅迫處理，分別在處理后的0、6、12、24、48、72 h取樣；將茶樹從花盆中取出，用自來(lái)水洗凈根上泥土后浸入純凈水中平衡約15 min，將茶樹移入提前配制好的 100 g·L-1PEG溶液中處理12 h，分別在處理后的0、6、12 h取樣。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上分別從至少3個(gè)枝條上取頂端第二、三片成熟葉混合為試驗(yàn)材料，用錫箔紙包裹并標(biāo)記，所有樣品采摘后液氮速凍，于－80℃保存用于提取茶樹總RNA。每個(gè)處理每個(gè)時(shí)期取樣設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

以4種逆境脅迫處理的樣品總RNA為模板，按照全式金的Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒的說(shuō)明合成cDNA作為熒光定量PCR模板。采用Bio-Rad的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進(jìn)行 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)，以茶樹TATA-box binding protein gene（TBP）作為內(nèi)參基因[19]，熒光定量引物列于表1，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系參照 Transstart?Tip Green qPCR superMix試劑盒的方法。反應(yīng)程序及數(shù)據(jù)處理參考陳靜等[20]的方法：94℃，30 s；94℃，5 s；60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；試驗(yàn)數(shù)據(jù)釆用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsFAD2和CsFAD6克隆及序列分析

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分析，篩選出茶樹中可能的FAD基因序列，用DNAstar軟件包對(duì)序列進(jìn)行拼接，經(jīng)NCBI BLASTx比對(duì)，從中獲2條具有完整開放閱讀框（ORF）的茶樹FAD基因序列，分別在開放閱讀框上下游設(shè)計(jì)引物RT-PCR擴(kuò)增出1 184 bp和1 524 bp的條帶（圖1），測(cè)序驗(yàn)證其序列正確性。分別對(duì)它們進(jìn)行BLASTn和BLASTx比對(duì)分析，結(jié)果顯示在獲得的序列中均具有完整的ORF，且均編碼完整的△12-不飽和脂肪酸合成酶，分別與其他植物中的FAD2和FAD6具有較高的相似性，因此將它們分別命名為CsFAD2和CsFAD6。CsFAD2序列全長(zhǎng) 1 184 bp，包含1 149 bp的ORF，編碼382個(gè)氨基酸；CsFAD6序列全長(zhǎng)1 524 bp，包含1 311 bp的ORF，編碼436個(gè)氨基酸。

2.2 CsFAD2和CsFAD6的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

Protparam在線軟件預(yù)測(cè)CsFAD2蛋白分子式為C2074H3062N532O536S13，相對(duì)分子質(zhì)量為44.44 kDa，理論等電點(diǎn)為 8.51。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為 39.69，推測(cè)該蛋白為穩(wěn)定蛋白。CsFAD6蛋白分子式為C2376H3571N613O603S17，相對(duì)分子質(zhì)量為 50.92 kDa，理論等電點(diǎn)為9.33。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為 52.52，推測(cè)該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

圖1 CsFAD2和CsFAD6 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of RT-PCR products of CsFAD2 and CsFAD6

TMHMM server V.2.0對(duì)CsFAD2和CsFAD6氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示 CsFAD2蛋白的 53～75、82～104、114～136、173～195、222～244、249～271 位氨基酸之間形成 6個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，預(yù)測(cè)CsFAD2蛋白是膜蛋白。CsFAD6蛋白的138～160、264～283、287～306位氨基酸之間形成3個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，預(yù)測(cè)CsFAD6蛋白是膜蛋白（圖2）。

singalP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示 CsFAD2和CsFAD6蛋白N端不存在信號(hào)肽，屬于非分泌性蛋白。Wolf Psort亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示CsFAD2定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，CsFAD6定位在葉綠體上。SOPMA分析顯示，CsFAD2和CsFAD6蛋白主要以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和 β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成，CsFAD2中分別占32.98%、30.10%、26.18%、10.73%；CsFAD6中分別占28.90%、43.81%、22.48%、4.82%。

圖2 CsFAD2和CsFAD6蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Predicted transmembrane helices in proteins of CsFAD2 and CsFAD6

2.3 CsFAD2和CsFAD6的同源比對(duì)和蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

在 NCBI中對(duì)獲得的核苷酸序列進(jìn)行BLASTx同源比對(duì)，結(jié)果顯示，CsFAD2與油茶（AIN52150.1）、珙桐（ABZ05022.1）、芝麻（XP_011080226.1）、水黃皮（AGZ02022.1）和油橄欖（AAW63040.1）等植物的FAD2的相似性分別達(dá)到 97%、84%、81%、81%和82%；CsFAD6與葡萄（XP_003634863.1）、棗（XP_015892777.1）、橙（XP_006488208.1）、可可（XP_017983888.1）、麻風(fēng)樹（ABU96742.1）FAD6的氨基酸序列相似性分別達(dá)到81%、79%、77%、78%和77%。序列保守結(jié)構(gòu)域分析和氨基酸序列同源比對(duì)結(jié)果顯示CsFAD2和CsFAD6蛋白與其他植物中的相應(yīng)FAD序列同源性較高（圖3）。

選取不同植物中的FAD2和FAD6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖 4），結(jié)果顯示茶樹 FAD2與油茶的親緣關(guān)系最近聚為一類；從進(jìn)化樹中可以看出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)CsFAD2和CsFAD6各聚為一類，CsFAD2屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型FAD2一類，CsFAD6聚在葉綠體型FAD6中。根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、同源性比對(duì)和進(jìn)化樹結(jié)果分析推測(cè)，本研究獲得的兩條茶樹△12-FAD分別屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型FAD2和葉綠體型FAD6。

2.4 逆境脅迫下CsFAD2和CsFAD6的表達(dá)分析

CsFAD2和CsFAD62個(gè)基因?qū)Φ蜏兀?℃）的響應(yīng)模式相同（圖 5-A）。在 1～24 h低溫處理期間，CsFAD2和CsFAD6的表達(dá)受低溫抑制，表達(dá)量均被下調(diào)，但差異不顯著。在24～48 h低溫處理期間，CsFAD2相對(duì)表達(dá)量開始上升，在低溫處理 48 h時(shí)CsFAD6相對(duì)表達(dá)量開始上升。在處理48 h時(shí)CsFAD2和CsFAD6相對(duì)表達(dá)量被誘導(dǎo)表達(dá)達(dá)到最高，顯著高于低溫處理的其他時(shí)期基因的相對(duì)表達(dá)量。在處理 72 h時(shí)CsFAD2和CsFAD6相對(duì)表達(dá)量下調(diào)。

ABA誘導(dǎo)CsFAD2和CsFAD6的表達(dá)（圖5-B）。ABA（100 μmol·L-1）處理后，CsFAD2的表達(dá)顯著上調(diào)，在6 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高為 5.73，后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)到 72 h，CsFAD2的相對(duì)表達(dá)量仍處于上調(diào)，在處理時(shí)間達(dá) 24 h之前均顯著高于處理前的相對(duì)表達(dá)量。然而，ABA對(duì)CsFAD6的表達(dá)誘導(dǎo)作用沒(méi)有對(duì)CsFAD2的顯著，在處理 12 h時(shí)CsFAD6被誘導(dǎo)相對(duì)表達(dá)量最高至1.79，其他處理階段除了 72 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，但差異不顯著，說(shuō)明 ABA對(duì)CsFAD6的表達(dá)影響較小。

CsFAD2和CsFAD6受高鹽（250 mmol·L-1NaCl）脅迫的調(diào)控，但其表達(dá)模式不相同（圖5-C），CsFAD2在72 h內(nèi)的處理過(guò)程中表達(dá)受抑制，而CsFAD6在處理后的表達(dá)顯著上調(diào)，在72 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高為391.81。

100 gL·-1的PEG處理12 h過(guò)程中，CsFAD2和CsFAD6均被誘導(dǎo)表達(dá)，6 h的相對(duì)表達(dá)量分別為 2.06和1.83，12 h的相對(duì)表達(dá)量分別達(dá)到了4.65和1.96（圖5-D）。

圖3 CsFAD2和CsFAD6與其他植物FAD2、FAD6同源比對(duì)Fig. 3 Alignment of the deduced CsFAD2, CsFAD6 proteins and homologous proteins from other plants

圖4 CsFAD2和CsFAD6與其他植物FAD2和FAD6氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of CsFAD2, CsFAD6 and homologous proteins from other plants

圖5 逆境脅迫下CsFAD2和CsFAD6的表達(dá)分析Fig. 5 Expression analysis of CsFAD2 and CsFAD6 in the leaves of tea plants under stresses

3 討論

脂肪酸去飽和作用是植物防御系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分，F(xiàn)AD是參與此調(diào)控的關(guān)鍵酶，在植物體中由多基因家族編碼。所有已知的 ω-3和 ω-6FAD以位于高度保守區(qū)的HXXXH，HXX（X）HH和HXXHH 3個(gè)組氨酸簇為特征。這些面向細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的組氨酸簇可能和鐵原子構(gòu)成了酶的活性中心[3]。本研究克隆得到 2個(gè)茶樹△12-脂肪酸去飽和酶酶基因，CsFAD2和CsFAD6分別編碼382和 436個(gè)氨基酸。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、同源比對(duì)、保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和進(jìn)化樹等分析表明，CsFAD2在氨基酸序列高度保守區(qū)具有3個(gè)保守的組氨酸簇HECGHH、HRRHH和HVAHH，分別位于此序列的第 105～110、140～144和314～318位氨基酸殘基；并在進(jìn)化樹中與其他植物FAD2聚為一類；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，因此推測(cè)CsFAD2屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型FAD2基因。而CsFAD6在氨基酸序列高度保守區(qū)同樣具有3個(gè)保守的組氨酸簇；在進(jìn)化樹中與葉綠體型FAD6聚為一類；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于葉綠體上，因此推測(cè)CsFAD6屬于葉綠體型FAD6基因。

本研究結(jié)果表明，茶樹CsFAD2和CsFAD6在低溫、ABA、高鹽和干旱逆境脅迫處理下均有表達(dá)且表達(dá)受到不同程度的誘導(dǎo)。在4℃低溫脅迫下，CsFAD2和CsFAD6的表達(dá)先下調(diào)，在24～48 h低溫處理期間，CsFAD2表達(dá)量開始上升；在低溫處理 48 h時(shí)CsFAD6表達(dá)量開始上升。在處理48 h時(shí)，CsFAD2和CsFAD6表達(dá)量被誘導(dǎo)表達(dá)達(dá)到最高，與前人的研究結(jié)果相近，表明茶樹中CsFAD2和CsFAD6與低溫逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。Ma等[14]研究表明，在茶樹中FAD7和FAD8的表達(dá)量在4℃低溫處理1 h時(shí)表達(dá)量先下降，后上升，處理24 h時(shí)達(dá)到最高，后又下降。目前已經(jīng)有多種脂肪酸去飽和酶基因分別從不同種植物中分離出來(lái)，并進(jìn)行了功能的驗(yàn)證，表明植物脂肪酸去飽和酶基因在抵抗低溫逆境脅迫中具有重要作用。Wada等[21]從抗寒藍(lán)藻（Anacystis nidulans）中克隆了△12-脫飽和酶基因，并將其導(dǎo)入寒敏感的藍(lán)藻，結(jié)果不飽和脂肪酸含量大為增加，受體對(duì)低溫的抗性明顯增強(qiáng)。Matos等[22]研究表明，在 22℃下擬南芥FAD2突變體的線粒體表現(xiàn)出多不飽和脂肪酸含量較低，而且比野生型具有更高的膜微粘度。在低溫逆境脅迫前期，CsFAD2和CsFAD6的表達(dá)變化較小，后期對(duì)低溫脅迫處理更敏感。茶樹在低溫脅迫處理達(dá)到一定程度時(shí)，茶樹中不飽和脂肪酸的含量發(fā)生相應(yīng)變化，以維持膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，降低逆境對(duì)膜結(jié)構(gòu)和功能的損害，從而增強(qiáng)植物的抗逆性。由此推測(cè)茶樹CsFAD2和CsFAD6在相應(yīng)低溫逆境脅迫中可能發(fā)揮重要作用。

在高鹽脅迫下，本研究中CsFAD2和CsFAD6均被誘導(dǎo)，但其表達(dá)模式不相同（圖5），CsFAD2在72 h內(nèi)的處理過(guò)程中表達(dá)受負(fù)調(diào)控，均被下調(diào)。CsFAD6在處理后的表達(dá)顯著上調(diào)，在 72 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高為391.81，在處理 48～72 h期間，CsFAD6的表達(dá)量顯著高于未處理前。Zhang等[23]結(jié)果表明，與野生型相比，缺乏FAD2功能的擬南芥突變體液泡和質(zhì)膜的多不飽和水平較低，液泡和質(zhì)膜囊泡中的 Na+/H+交換活性降低。根細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中積累更多的Na+，在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)早期對(duì)鹽脅迫比較敏感，說(shuō)明了FAD2介導(dǎo)的高水平液泡和質(zhì)膜的脂肪酸去飽和對(duì)于膜附著的 Na+/H+交換器的正常功能是必需的。在酵母中轉(zhuǎn)入向日葵的FAD2-1、FAD2-3，提高了對(duì)NaCl脅迫的耐受性[24]。由此可以推測(cè)茶樹在高鹽逆境脅迫下，影響了細(xì)胞膜系統(tǒng)的脂肪酸多不飽和水平，而CsFAD2和CsFAD6在參與植物鹽脅迫響應(yīng)中起到了調(diào)節(jié)細(xì)胞膜系統(tǒng)脂肪酸不飽和水平的重要作用。

在干旱脅迫下，CsFAD2和CsFAD6表達(dá)量在100 g·L-1PEG處理0～12 h過(guò)程中被誘導(dǎo)表達(dá)，與前人研究結(jié)果一致，說(shuō)明CsFAD2和CsFAD6能響應(yīng)茶樹干旱逆境脅迫。Paula等[25]研究表明，干旱脅迫影響豇豆脂肪酸合成及造成不飽和脂肪酸的降解。Zhang等[26]檢測(cè)過(guò)表達(dá)的 ω-3FAD番茄植株，能夠提高對(duì)干旱（PEG）脅迫的耐受性。利馬豆的FAD2在干旱（PEG）脅迫下表達(dá)量顯著提高[13]，這些研究說(shuō)明植物對(duì)干旱的耐受性與植物膜脂的去飽和化存在關(guān)系[27]。

ABA（100 μmol·L-1）脅迫處理 72 h 過(guò)程中，CsFAD2在處理6～24 h期間表達(dá)量被顯著上調(diào)，而CsFAD6的表達(dá)在此期間不受 ABA影響，但在 72 h時(shí)顯著降低，表明CsFAD2和CsFAD6可能參與ABA脅迫誘導(dǎo)反應(yīng)。目前尚未有FAD基因與激素脅迫響應(yīng)相關(guān)性的研究，有待后續(xù)試驗(yàn)探究。

本研究在茶樹中克隆并分析了CsFAD2和CsFAD6在不同脅迫中的表達(dá)模式，初步確定CsFAD2和CsFAD6參與的不飽和脂肪酸代謝在茶樹抵御逆境脅迫中起到重要作用。CsFAD2和CsFAD6對(duì)逆境不同程度的響應(yīng)表達(dá)，可能與茶樹細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量發(fā)生相應(yīng)變化，以維持膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，降低逆境對(duì)膜結(jié)構(gòu)和功能的損害，從而增強(qiáng)植物的抗逆性有關(guān)，為后續(xù)研究不飽和脂肪酸代謝在茶樹抗逆中的作用提供了基礎(chǔ)。目標(biāo)基因抵抗逆境脅迫的功能有待通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其轉(zhuǎn)入楊樹等模式植物中作深入研究。同時(shí)，F(xiàn)AD2可能還受光、植物生長(zhǎng)激素和還原性輔酶的調(diào)控并參與植物對(duì)逆境的應(yīng)答，因此，對(duì)△12-脂肪酸脫氫酶基因的研究不應(yīng)局限于植物組織中脂肪酸組成的變化，以及不飽和脂肪酸改變所引起的生物膜的變化，應(yīng)拓展到激素調(diào)控、光調(diào)控、電子傳遞和逆境應(yīng)答等更廣泛的領(lǐng)域。高等植物中FAD2基因是以多拷貝形式存在的，不同F(xiàn)AD2基因拷貝具有不同的序列特征、編碼區(qū)、內(nèi)含子、5′UTR 和 3′UTR長(zhǎng)度、表達(dá)特性和功能，后續(xù)可通過(guò)克隆茶樹上的FAD2基因家族的其他基因來(lái)全面研究不飽和脂肪酸合成酶基因在茶樹抵御逆境脅迫中的作用。

[1]年洪娟, 陳麗梅. 不飽和脂肪酸在逆境脅迫中的作用[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2012(8): 760-762.

[2]于超. 溫度脅迫下番茄內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω-3脂肪酸去飽和酶基因的表達(dá)和功能研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[3]葉靜, 胡海濤, 王長(zhǎng)春, 等. 植物脂肪酸去飽和酶與抗冷性研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011(12): 131-134.

[4]李金金, 張晶晶, 年洪娟. △12-脂肪酸去飽和酶 FAD2的基本特性及其在脅迫中的功能[J]. 生命科學(xué)研究, 2013(2):174-178.

[5]劉永紅, 張麗靜, 張洪榮, 等. △12-脂肪酸脫氫酶及其編碼基因研究進(jìn)展[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2011(3): 256-267.

[6]Yang L, Ye J, Guo W, et al. Differences in cold tolerance and expression of two fatty acid desaturase genes in the leaves between fingered citron and its dwarf mutant [J]. Trees, 2012,26(4): 1193-1201.

[7]Kargiotidou A, Deli D, Galanopoulou D, et al. Low temperature and light regulate delta 12 fatty acid desaturases(FAD2) at a transcriptional level in cotton (Gossypium hirsutum) [J]. Journal of ExperiMental Botany, 2008, 59(8):2043-2056.

[8]Matteucci M, D'Angeili S, Errico S, et al. Cold affects the transcription of fatty acid desaturases and oil quality in the fruit of Olea europaea L. genotypes with different cold hardiness [J]. Journal of Experimental Botany, 2011, 62(10):3403-3420.

[9]Hernández ML, Padilla MN, Sicardo MD, et al. Effect of different environmental stresses on the expression of oleate desaturase genes and fatty acid composition in olive fruit [J].Phytochemistry, 2011, 72(2): 178-187.

[10]Teixeira MC, Coelho N, Olsson ME, et al. Molecular cloning and expression analysis of three omega-6 desaturase genes from purslane (Portulaca oleracea.L) [J]. Biotechnology Letters, 2009, 31(9): 1089-1101.

[11]Zhou Z，Wang M，Zhao S，et al. Changes in freezing tolerance in hybrid poplar caused by up-and down-regulation of PtFAD2 gene expression [J]. Transgenic Research, 2010,19(4): 647-654.

[12]Hernandez M L, Mancha M, Martinez-Rivas J M, et al.Molecular cloning and characterization of genes encoding two microsomal oleate desaturases (FAD2) from olive [J].Phytochemistry, 2005, 66(12): 1417-1426.

[13]Zhang YM, Wang CC, Hu HH, et al. Cloning and expression of three fatty acid desaturase genes from cold-sensitive lima bean (Phaseolus lunatus.L) [J]. Biotechnology Letters, 2011,33(2): 395-401.

[14]Ma QP，You E，Wang J，et al. Isolation and expression of CsFAD7 and CsFAD8, two genes encoding ω-3 fatty acid desaturase fromCamellia sinensis[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2014, 36(9): 2345-2352.

[15]姚雪倩, 岳川, 楊國(guó)一, 等. 茶樹牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS的克隆及表達(dá)分析[J]. 茶葉科學(xué),2017, 37(1): 86-96.

[16]俞瀅, 陳丹, 孫君, 等. 茉莉花萜類合成酶基因 JsTPS的克隆及其表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2016, 43(2): 356-364.

[17]曹紅利, 岳川, 郝心愿, 等. 茶樹膽堿單加氧酶CsCMO的克隆及甜菜堿合成關(guān)鍵基因的表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(15): 3087-3096.

[18]岳川, 曹紅利, 周艷華, 等. 茶樹谷胱甘肽還原酶基因CsGRs的克隆與表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(16):3277-3289.

[19]Wu ZJ, Tian C, Jiang Q, et al. Selection of suitable reference genes for qRT-PCR normalization during leaf development and hormonal stimuli in tea plant (Camellia sinensis) [J].Scientific Reports, 2016: 1-10. DOI: 1038/srep19748.

[20]陳靜, 俞瀅, 張丹丹, 等. 白茶萎凋過(guò)程中兒茶素合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016(8): 1364-1369.

[21]Wada H, Gombos Z, Murata N, et al. Enhancement of chilling tolerance of a cyanobacterium by genetic manipulation of fatty acid desaturation [J]. Nature, 1990,347(9): 200-203.

[22]Matos AR, Hourton-Cabassa C, Ci?ek D, et al. Dominique ci?ek.alternative oxidase involvement in cold stress response of arabidopsis thaliana fad2 and FAD3+ cell suspensions altered in membrane lipid composition [J]. Plant Cell Physiology, 2007, 48(6): 856-865.

[23]Zhang JT, Liu H，Sun J, et al. Arabidopsis fatty acid desaturase FAD2 is required for salt tolerance during seed germination and early seedling growth [J]. Plos One, 2012,7(1): e30355.

[24]Sonia RV, Alicia SG, Jose Manuel MR, et al. Fluidization of membrane lipids enhances the tolerance of saccharomyces cerevisiae to freezing and salt stress [J]. Applied amp;Environmental Microbiology, 2007, 73(1): 110-116.

[25]Paula FMD, Thi ATP, Zuily-Fodil Y, et al. Effects of water stress on the biosynthesis and degradation of polyunsaturated lipid molecular species in leaves ofVigna unguiculata[J]. Plant Physiology amp; Biochemistry, 1993,31(5): 707-715.

[26]Zhang M, Barq R, Yin M, et al. Modulated fatty acid desaturation via overexpression of two distinct ω-3 desaturases differentially alters [J]. Plant Journal, 2005,44(3): 361-371.

[27]RG Upchurch. Fatty acid unsaturation, mobilization, and regulation in the response of plants to stress [J].Biotechnology Letters，2008, 30(6): 967-977.

Cloning and Expression Analysis of △12-fatty Acid Desaturase in Tea Plants

CHEN Dan, YU Ying, YUE Chuan, WANG Pengjie, CHEN Jing, CHEN Guixin*, YE Naixing*
College of Horticulture，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian, Fuzhou 350002, China

Based on the transcriptome database of tea plants, the cDNAs (CsFAD2 and CsFAD6) including full ORFs of the key rate-limiting enzyme-FAD (△12-fatty acid desaturase) in the unsaturated fatty acid synthesis pathway were cloned from the buds and leaves of tea cultivar Tieguanyin by RT-PCR .The full length of cDNA ofCsFAD2was 1 184 bp, which contained a 1 149 bp ORF encoding 382 amino acids with 97% homologous to theCoFAD2.Subcellular localization prediction showed thatCsFAD2was localized to the endoplasmic reticulum. The full length of cDNA ofCsFAD6was 1 425 bp and contained a 1 311 bp ORF encoding 436 amino acids, which was 81%homologous toVvFAD6. It was predicted to be located on the chloroplast. Quantitative PCR analysis showed that the expression ofCsFAD2andCsFAD6were induced by cold stress (4℃), which had the highest expression levels at 48 h.Similarly,CsFAD2andCsFAD6were induced by 100 g·L-1PEG treatment for 12 h. The expression ofCsFAD2was significantly up-regulated under the treatment of ABA(100 μmol·L-1) for 6-24 h. While the expression ofCsFAD6was not affected by ABA during this period and dramatically down-regulated at 72 h. The expression ofCsFAD2was repressed under NaCl (250 mmol·L-1) treatment. Inversely, the expression ofCsFAD6was significantly induced by NaCl treatment from 24 to 72 h.

Camellia sinensis, △12-fatty acid desaturase enzyme, abiotic stresses, gene expression

TS272.5+1；Q946.84+1

A

1000-369X(2017)06-541-10

2017-03-27

2017-06-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270735，31600555）、福建省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”中國(guó)烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心專項(xiàng)（閩教科〔2015〕75號(hào)）、福建省自然科學(xué)基金（2017J01616）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-19）

陳丹，女，在讀碩士生，研究方向?yàn)椴铇湓耘嘤N與生物技術(shù)。*通信作者：ynxtea@126.com，guixinchen@126.com