母發(fā)光，王 強，鄭 佳，房 俊

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a.兒科；b.醫(yī)學實驗中心，四川 成都 610072)

TLR2、TLR9及CD19、CD23在兒童傳染性單核細胞增多癥中的表達及意義

母發(fā)光a，王 強a，鄭 佳a，房 俊b

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a.兒科；b.醫(yī)學實驗中心，四川 成都 610072)

目的了解傳染性單核細胞增多癥(infectious mononucleosis，IM)患兒不同時期外周血單個核細胞TLR2、TLR9 mRNA和 CD19、CD23的表達情況及其變化規(guī)律，探討其在發(fā)病中的作用。方法回顧性分析2015年4月至2016年2月30例我院確診為IM患兒的臨床資料。新診斷IM的30例患兒為IM急性期組，其中26例(失訪4例)經(jīng)治療臨床癥狀體征消失，病程滿1個月為IM恢復期組，同期常規(guī)體檢健康的24例兒童為對照組。采用SYBRGreen I 實時熒光定量PCR方法檢測外周血單個核細胞TLR2 mRNA、TLR9 mRNA的表達。采用流式細胞術檢測外周血單個核細胞中B細胞CD19+和永生B細胞CD19+CD23+的陽性表達率。結果IM患兒急性期CD19+及CD19+CD23+表達陽性率低于恢復期 (P< 0.05)，且急性期和恢復期表達陽性率均低于對照組(P< 0.05)。急性期TLR2 mRNA、TLR9 mRNA表達水平高于恢復期 (P< 0.05)，且急性期和恢復期表達水平均高于對照組(P< 0.05)。結論TLR2、TLR9，CD19+CD23+、 CD19+在IM不同時期通過對免疫細胞的調(diào)節(jié)可能參與了IM發(fā)病。

傳染性單核細胞增多癥；Toll受體2；Toll受體9；CD19；CD23；兒童

兒童時期感染 EB 病毒后表現(xiàn)形式多種多樣，可無明顯臨床癥狀而僅表現(xiàn)為病毒攜帶者，或僅有發(fā)熱、咽炎等輕微臨床癥狀，傳染性單核細胞增多癥(Infectious mononucleosis，IM)，是常見的感染形式，進一步可表現(xiàn)為EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)相關性嗜血細胞綜合癥、淋巴瘤、慢性活動性EBV感染等，臨床癥狀重，可伴有多器官損害等嚴重并發(fā)癥[1]。但發(fā)病機制尚未完全清楚，如何在感染后及時評估患兒的預后，以期早期干預，避免其向重癥發(fā)展值得關注。CD19的陽性表達(CD19+)即為B細胞，CD19和CD23均陽性表達(CD19+CD23+)即為永生B細胞。B細胞是EB病毒感染的最初靶細胞，也是EBV在體內(nèi)建立持續(xù)感染的終身潛伏場所[2]。Toll樣受體(TLRs)參與免疫系統(tǒng)對EBV的識別，同時在EBV感染及其轉歸中起重要作用[3]。本研究觀察30例IM患兒不同時期外周血單個核細胞TLR2、TLR9 mRNA，B細胞CD19+和永生B細胞CD19+CD23+的表達情況及變化規(guī)律，以探討其在發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2015年4月至2016年2月在四川省人民醫(yī)院兒科住院新診斷為IM患兒30例(IM急性期組)，男 18 例，女12例，年齡2～14歲(6.5±2.5)歲，研究對象均符合IM診斷標準[4，5]。IM恢復期組： IM急性組患兒經(jīng)治療臨床癥狀體征消失，病程滿1個月時復查，26例(失訪4例)。對照組：我院兒童保健門診同期常規(guī)體檢健康兒童24例，男 10例，女12例，年齡3～14歲(6.3±2.0)歲，檢測其血清EB病毒衣殼抗原IgM和IgG抗體均為陰性(EBVCA-IgM、IgG陰性)。各組兒童家長均知情同意，試驗經(jīng)我院倫理委員會審查通過。三組兒童年齡、性別分布差異無統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。

1.2方法①血液樣本收集：抽取IM患兒分別在急性期(發(fā)病<7天)，病程1月和健康體檢對照組兒童，外周靜脈血4 ml注入BD肝素鋰抗凝真空采血管中，立即送檢。采用聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)備用。剩余血標本1000 r/min離心5 min，分離上層血漿分裝至EP管，-80 ℃冰箱保存；提取血漿后剩余血細胞加等量PBS用于提取RNA，合成cDNA，制備實時熒光定量 PCR檢測樣本。②儀器與試劑：美國 Beckman Coulter公司Cytomics FC500型流式細胞儀。美國 ABI 公司7900 hT Fast Real-Time PCR System型實時熒光定量PCR 儀。引物由上海生物工程技術公司合成。1-15K，CD23-FITC(異硫氰酸熒光素)和CD19-PE(藻紅蛋白)鼠抗人熒光單克隆抗體購自美國Beckman Coulter公司。Trizol試劑盒購自美國 Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒購自美國ABI公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購于大連寶生物工程有限公司。③CD19+CD23+，CD19+表達的檢測：分別取CD19，CD23單抗各10 μl，加入抗凝血50 ml混勻，避光孵育20分鐘，加入紅細胞裂解液，在流式細胞儀上計數(shù)4000個以上的淋巴細胞，分別記錄CD19+CD23+，CD19+的陽性表達率。④總RNA提?。恨D速10000～12000 r/rain離心樣本，用Trizol試劑提取上述分離的PMBC總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量。⑤cDNA制備：用逆轉錄試劑盒，取 2 μg 總 RNA 合成cDNA，反應體積為20 μl，逆轉錄條件： 25 ℃10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ forever。制成的 cDNA-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。⑥實時熒光定量 PCR檢測：引物序列設計如下：TLR2(80bp)上游引物序列：5'-ATTGTGC-CCATTGCTCTTTC-3'，下游引物序列： 5'-CTTCC TTG-GAGAGGCTGATG-3；TLR9(194bp)上游引物序列：5'-CAGGGACAACCACCACTTC T-3'，下游引物序列：5'-AGC-CTT-CGG-TA G-CAT-TTA-TTG-3'。內(nèi)參基因hGAPDH(226bp)上游引物序列5'-GAAGGTGAAG-GTCGGAGTC-3'，下游引物序列5'-GAAGATGGT-GATGG GATTTC-3'。采用SYBR Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒，使用PCR擴增儀，進行SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR擴增。以參照基因作為標準進行相對定量的△Ct 法計算目的基因的相對表達量。

1.3統(tǒng)計學方法采用 SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，對所有數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，多組樣本均數(shù)間比較用采用One-Way ANOWA方差分析，進一步組間兩兩比較用LSD法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

三組IM患兒CD19+及CD19+CD23+表達陽性率總體差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)，急性期表達陽性率低于恢復期 (P< 0.05)；急性期和恢復期表達陽性率均低于對照組(P< 0.05)。IM患兒TLR2 mRNA、TLR9 mRNA相對表達水平在三組總變異率比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)，組間兩兩比較顯示：急性期表達水平高于恢復期 (P< 0.05)，急性期和恢復期表達水平均高于對照組(P< 0.05)。見表1。

表1 三組兒童CD19+、CD19+CD23+表達陽性率及TLR2 mRNA、TLR9 mRNA相對表達水平比較

a與b比較，a與c比較，b與c比較，均P< 0.05

3 討論

IM是原發(fā)EBV感染的一種常見形式，B細胞成為原發(fā)EBV感染最初靶細胞平[6]。當機體免疫力正常時，T細胞及NK細胞對感染B細胞的殺滅，大多數(shù)EBV被清除，病情常表現(xiàn)為自限性、預后良好。但EBV感染B細胞可逃避免疫監(jiān)視，并建立持續(xù)性感染B細胞庫，在T細胞缺乏或T細胞功能不足時這種永生B細胞可不斷增殖、在體內(nèi)建立持續(xù)感染的潛伏場所[7]。CD19分子是B細胞表面相對分子質(zhì)量為95000的糖基化I型跨膜蛋白。CD19分子的表達在骨髓B祖細胞即開始，持續(xù)于整個B細胞成熟期，，其表達水平代表B細胞水平[8]。CD23是一種相對分子質(zhì)量為45000的II型跨膜糖蛋白，主要表達于激活的B細胞表面，是B細胞激活標志之一，CD23的持續(xù)表達，代表了B細胞的永生化。測定外周血單個核細胞CD19+CD23+及CD19+表達水平，可反映B細胞及永生B細胞水平[9，10]。

Toll樣受體(TLRs)作為一種跨膜信號傳遞受體，是先天性免疫模式識別受體的重要組成部分，在識別病原微生物、觸發(fā)天然免疫和影響獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用，使免疫系統(tǒng)迅速抵抗病原微生物感染的感染[11，12]。其中TLR2是所有TLRs家族亞類中的代表性受體，是抗感染免疫反應中最直接的模式識別受體。存在于細胞表面，幾乎表達于所有的細胞系，在所有的TLRs中，TLR2識別的配體最多，通過 TLR2 信號途徑，EBV能特異地激活免疫細胞，產(chǎn)生炎性因子發(fā)揮病理損害作用[13，14]。EBV衣殼蛋白通過TLR2的配體誘導單核-巨噬細胞高表達TLR2，TLR2激活單核細胞產(chǎn)生趨化蛋白-1等炎性因子，從而參與參與抗EBV的免疫反應。TLR9主要表達于免疫細胞，如記憶性B細胞和漿細胞樣樹突狀細胞，定位于胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，識別特定的病原相關細菌或病毒的非甲基化 CpG-DNA 序列，介導髓樣分化因子88(MyD88)依賴型信號傳導通路，激活多種細胞因子的基因轉錄，啟動免疫應答，調(diào)節(jié)病毒的增殖和復制[15]。EBV在抗病毒的免疫反應中，通過增強免疫細胞表達TLR9，促進免疫細胞產(chǎn)生抗病毒細胞因子(如 IFN-α，IFN-β)，發(fā)揮宿主抗EBV的作用[16]。本研究結果顯示，在TM急性期，TLR2、TLR9 mRNA表達水平上調(diào)，CD19+CD23+及CD19+表達陽性率明顯降低(P< 0.05)?；謴推冢琓LR2、TLR9 mRNA表達水平下調(diào)，CD19+CD23+及CD19+表達陽性率明顯增高(P< 0.05)，急性期和恢復期與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。其免疫機制為：EBV感染觸發(fā)TLRs表達，并影響感染EBV的B細胞增殖。在IM的急性期，TLR2通過機體的固有免疫反應，限制EB病毒的傳播和表達[17]。TLR9識別EBV病毒并限制其傳播并控制已被病毒感染的潛伏B細胞而發(fā)揮作用[18]。EBV感染的急性期觸發(fā)TLR2、TLR9 mRNA表達上調(diào)以識別病原體，并將病原體交予抗原提呈細胞，引發(fā)機體免疫反應，殺滅過多的感染EBV的B細胞，導致急性期CD19+、CD19+CD23+水平降低。該過程有利于宿主免疫系統(tǒng)對病毒的清除，避免永生B細胞的過度增殖，而不至于轉化為腫瘤細胞[19]。在疾病恢復期，EBV清除后，TLR2、TLR9的配體對TLR2、TLR9的刺激減弱。因此，恢復期TLR2、TLR9 mRNA的表達下調(diào)，EBV干擾TLRs的識別表達和功能，宿主免疫反應減弱，CD19+、CD19+CD23+水平逐漸增高，病毒處于暫時穩(wěn)定狀態(tài)，避免機體遭受過度免疫反應的損傷[20]。

由此可見：在IM病程的不同時期TLR2、TLR9，CD19+、CD19+CD23+通過對免疫細胞的調(diào)節(jié)影響EBV在感染免疫的急性期和恢復期平衡關系從而參與IM發(fā)病。

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ExpressionsandsignificanceofTLR2，TLR9，CD19andCD23inchildrenwithinfectiousmononucleosis

MUFa-guanga，WANGQianga，ZHENGJiaa，F(xiàn)ANGJunb

(a.DepartmentofPediatrics，b.MedicalExperimentCenter，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

ObjectiveTo investigate the expressions and variations of TLR2，TLR9，CD19 and CD23 in peripheral blood mononuclear cells of children with infectious mononucleosis (IM)，and to explore their role in the pathogenesis of the disease.MethodsThe clinical data of 30 newly diagnosed IM from April 2015 to February 2016 in our hospital were retrospectively analyzed.The 30 cases were taken as IM acute group.Among them，26 cases whose clinical signs and symptoms disappeared after treatment (4 cases lost follow-up) and course of disease lasted for about 1 month were taken as IM recovery group.Meanwhile，24 children with normal physical examination were taken as control group.The expressions of TLR2 mRNA and TLR9 mRNA in peripheral blood mononuclear cells was detected by SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR.Flow cytometry was used to detect the positive expression rates of B cells (CD19+) and immortalized B cells (CD19+CD23+) in the peripheral blood mononuclear cells.ResultsThe positive expression rate of CD19+and CD19+CD23+in the acute period of children with IM was lower than that in the recovery period (P< 0.05)，and the positive rate of expressions in acute period and recovery period were lower than that in control group (P< 0.05).The expression levels of TLR2 mRNA and TLR9 mRNA in acute period was higher than that in recovery period (P< 0.05)，and the expression levels in acute period and recovery period were higher than that in control group (P< 0.05).ConclusionTLR2，TLR9，CD19 and CD23 may play an important role in the pathogenesis of IM in different stages.

Infectious mononucleosis；TLR2；TLR9；CD19；CD23；Child

R512.7

A

1672-6170(2017)06-0192-04

2017-03-07；

2017-04-17)