胡 志，馬 慧，范粉玲，劉文娟，謝 航

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)構(gòu)性心臟病科，陜西 西安 710061)

ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路激活在低氧所致肺動(dòng)脈內(nèi)皮增殖中的作用

胡 志，馬 慧，范粉玲，劉文娟，謝 航

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)構(gòu)性心臟病科，陜西 西安 710061)

目的考察ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白激活在低氧所致肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用。方法將人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分別在常氧狀態(tài)(21% O2)和低氧狀態(tài)(1% O2)下培養(yǎng)24、48、72及96小時(shí)，同時(shí)低氧狀態(tài)下分別設(shè)立活性氧(ROS)清除劑Trolox組和ALOX5抑制劑齊留通組。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率的改變，活性氧探針H2-DCFA檢測(cè)低氧狀態(tài)下肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的變化，Western blot法分別檢測(cè)低氧狀態(tài)及加入Trolox或齊留通干預(yù)后ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在低氧作用48、72及96 h后可見增殖顯著，分別達(dá)(135.6±29.4)%、(185.3±21.7)%及(212.3±39.0)%。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS在24、48及72 h可檢測(cè)到顯著增加，96小時(shí)后基本恢復(fù)正常。ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白隨低氧時(shí)間增加而表達(dá)增多。預(yù)先加入ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通均可抑制NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3和Caspase-1的表達(dá)，且細(xì)胞增殖率也顯著降低。結(jié)論ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路在低氧所致的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖中顯著激活，抑制這一通路可顯著減少低氧所致的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

肺動(dòng)脈高壓；低氧；人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；NLRP3炎性小體；信號(hào)通路

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種以肺血管循環(huán)阻力增加、肺動(dòng)脈壓力持續(xù)增高，進(jìn)而誘發(fā)右心衰竭的高致死率和致殘率疾病，其病理生理改變以進(jìn)展性肺動(dòng)脈壓力升高和血管重建為特征[1]。目前雖然機(jī)制未明，但臨床PAH患者檢查發(fā)現(xiàn)，低氧所導(dǎo)致的肺泡血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能不全、異常增殖在PAH的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[2]。

低氧所誘發(fā)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖機(jī)制較為復(fù)雜，新近研究資料表明，氧化應(yīng)激和炎癥應(yīng)答可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)釋放，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化后釋放成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GF)，進(jìn)而改變肺部動(dòng)脈血管微環(huán)境，從而促進(jìn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary artery endothelial cells，PAEC)無(wú)序增殖，使肺動(dòng)脈血管狹窄而誘發(fā)PAH[3]。但低氧是如何誘發(fā)肺動(dòng)脈內(nèi)皮增生，期間關(guān)聯(lián)的信號(hào)分子及機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。

花生四烯酸5脂氧酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5)，可催化具有促血管增殖作用的白三烯類物質(zhì)的生成。文獻(xiàn)報(bào)道，在PAH動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期低氧可能伴隨ALOX5表達(dá)改變[4]。NLRP3，也被稱做NALP3(NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3)是由位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂的NLRP3基因所編碼的重要炎癥小體，其在低氧所致的腫瘤細(xì)胞增殖中起重要作用[5，6]，但其對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖作用還不明確。由于 ROS生成，ALOX5表達(dá)及NLRP3激活在低氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈內(nèi)皮增殖中的作用尚不清楚，因此本研究試圖考察ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白在低氧所致肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的變化規(guī)律，同時(shí)采用活性氧(ROS)清除劑Trolox組和ALOX5抑制劑齊留通來(lái)驗(yàn)證這一通路抑制對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器CCK-8 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Dojindo Molecular Technologies 公司；活性氧探針2’，7’-二氯熒光素二乙酸鹽(2’，7’-dihydrodichlorofluorescein diacetate，H2-DCFDA)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；低氧培養(yǎng)容器(Hypoxia Incubator Chamber購(gòu)自加拿大Stemcell公司；ALOX5，NLRP3，Caspase-1及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；Thermo MK3型酶標(biāo)儀產(chǎn)地美國(guó)；Olympus IX53 倒置熒光顯微鏡產(chǎn)地日本。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonary artery endothelial cells，HPAEC)購(gòu)自美國(guó)ScienCell實(shí)驗(yàn)室。常規(guī)DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清進(jìn)行傳代培養(yǎng)，20代內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2低氧及藥物處理 HAPEC細(xì)胞正常培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2，95% 空氣；低氧條件下，將HAPEC細(xì)胞置于Stemcell公司的低氧培養(yǎng)容器，培養(yǎng)條件為1% O2，5% CO2，94% N2。為考察ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通對(duì)細(xì)胞增殖的影響，在進(jìn)行低氧處置前，預(yù)先加入10 μmol/L 的Trolox和齊留通。

1.2.3細(xì)胞增殖率測(cè)定 將96孔板低氧及常氧狀態(tài)下培養(yǎng)的HAPEC細(xì)胞，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37 ℃下室溫孵育2小時(shí)后，用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)吸光度值。檢驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次取均值(n=3)。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)總ROS測(cè)定采用ROS敏感的熒光探針H2-DCFDA進(jìn)行反應(yīng)標(biāo)記。具體方法如下：HPAEC細(xì)胞進(jìn)行ROS測(cè)定前，先用PBS液清洗2次，然后加入10 μg/ml的H2-DCFDA溶液按1∶500濃度稀釋，37 ℃孵育15 min后，PBS液清洗3次，去除殘留的反應(yīng)液，488 nm下進(jìn)行熒光激發(fā)，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)OD值，檢驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次取均值(n=3)。倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。

1.2.5Western Blot分析 將常氧或低氧狀態(tài)培養(yǎng)不同時(shí)間、不同藥物處理的HPAEC進(jìn)行收集，加入細(xì)胞裂解液后進(jìn)行蛋白定量。每組取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下2%BSA封閉1小時(shí)，按不同稀釋倍數(shù)加入一抗(ALOX5，NLRP3，Caspase-1及GAPDH)，4 ℃ 封閉過夜后PBS清洗3次，加入1：1000稀釋的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1小時(shí)，ECL顯色，常規(guī)膠片曝光。Image-Pro Plus Version 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。檢驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次取均值(n=3)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖率的影響肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在低氧作用48、72和96小時(shí)后可見增殖顯著，增殖率分別達(dá)(135.6±29.4)%、(185.3±21.7)%和(212.3±39.0)%，與常氧對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖率的影響(n=3) 與常氧組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.2低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的影響圖2 A為熒光分光光度法檢測(cè)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的生成變化(n=3)；圖2B為常氧組及低氧24、48、72及96小時(shí)ROS探針H2-DCFDA激發(fā)后的熒光照片。結(jié)果可見，低氧作用24、48及72小時(shí)可見細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著增多，分別達(dá)(164.38±19.75)%、(196.31±36.02)%及(272.74±31.77)%，與常氧對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。第96小時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS基本恢復(fù)正常。

2.3低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響隨著低氧作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ALOX5蛋白在第48、72及96小時(shí)出現(xiàn)顯著上調(diào)，而炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3和Caspase-1的表達(dá)上調(diào)在早期(第24小時(shí))已開始出現(xiàn)。見圖3。

圖2 低氧致肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加 a：熒光分光光度法檢測(cè)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的生成變化(n=3)；b：常氧組及低氧24、48、72及96小時(shí)ROS探針H2-DCFDA激發(fā)后的熒光照片。與對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

圖3 低氧對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 a：Western Blot法檢測(cè)低氧狀態(tài)下24、48、72及96小時(shí)后ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)的變化，內(nèi)參蛋白為GAPDH；b：Image-Pro Plus6.0軟件分析ALOX5蛋白表達(dá)量(n=3)；c：Image-Pro Plus6.0軟件分析NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)量(n=3)。與對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.4Trolox和齊留通對(duì)ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路蛋白的干預(yù)及對(duì)HPAEC增殖的影響圖4a為Trolox和齊留通對(duì)ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路蛋白的干預(yù)作用；圖4b為Trolox和齊留通對(duì)HPAEC增殖的影響。10 μmol/L的 Trolox和齊留通均能顯著下調(diào)ALOX5、NLRP3及Caspase-1蛋白的表達(dá)，且能抑制低氧所導(dǎo)致的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

3 討論

目前，人們對(duì)PAH的病理生理機(jī)制尚不明確。長(zhǎng)期以來(lái)，低氧[7]、酸中毒[8]、肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮增殖[9]及血管重塑所致的肺泡毛細(xì)血管循環(huán)阻力增加[10]均被認(rèn)為是導(dǎo)致PAH的重要危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，隨著對(duì)PAH發(fā)病機(jī)制的深層次探索，低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷、炎性通路激活[11]及誘發(fā)的內(nèi)皮功能障礙逐漸成為新的研究熱點(diǎn)和潛在藥物作用靶標(biāo)[12]。

肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(PVEC) 在正常生理狀態(tài)下，其增殖率和凋亡率之間維持著動(dòng)態(tài)平衡，其數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)維持血管正常結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要。但PAH發(fā)病中，低氧作為重要的危險(xiǎn)因素可引起PVEC增殖率和凋亡率之間失衡，使PVEC數(shù)量增多，其產(chǎn)生的促血管生成物質(zhì)VEGF、FGF及LTs等大量釋放，改變肺動(dòng)脈血管微環(huán)境進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)膜和平滑肌增厚，使肺血管管腔出現(xiàn)明顯狹窄，表現(xiàn)為肺循環(huán)阻力持續(xù)增大，動(dòng)脈壓力持續(xù)升高而發(fā)展為PAH[13]。

圖4 Trolox和齊留通對(duì)ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路蛋白的干預(yù)及對(duì)HPAEC增殖的影響 A：ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通對(duì)ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路蛋白的干預(yù)作用；B：Trolox和齊留通對(duì)HPAEC增殖的影響(n=3)。與低氧組比較，##P < 0.01；與常氧組比較，**P < 0.01

近年的研究表明，低氧狀態(tài)除可促進(jìn)低氧細(xì)胞內(nèi)ROS生成外，還可能激活下游氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，其中誘發(fā)血管生長(zhǎng)因子釋放的ALOX5蛋白及NLRP3炎癥小體的表達(dá)規(guī)律可能在PVEC增殖中扮演重要作用[14]。為進(jìn)一步探索低氧誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮增殖的機(jī)制，本研究采用人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，在低氧作用48、72和96 h后可見其增殖顯著。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS在24、48、72 h顯著增加，ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白隨低氧時(shí)間增加而表達(dá)增多。預(yù)先加入ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通均可抑制NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3和Caspase-1的表達(dá)，且細(xì)胞增殖率也顯著降低。

本研究結(jié)果首先明確了在體外條件下，低氧可促進(jìn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，伴隨出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS增多，同時(shí)細(xì)胞膜脂質(zhì)調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白ALOX5表達(dá)增加，炎癥蛋白NLRP3和Caspase-1激活，以上結(jié)果均說(shuō)明，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在低氧條件下的增殖與氧化應(yīng)激、炎癥和脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)。ALOX5的增加可能通過旁分泌方式作用于肺小動(dòng)脈內(nèi)膜，引起內(nèi)膜增厚以及介導(dǎo)新生血管的形成，由此產(chǎn)生明顯的肺血管重構(gòu)。隨著病情的發(fā)展，將進(jìn)一步誘發(fā)血管中膜和內(nèi)膜增厚及血管彈性下降，引起血管阻力增加，肺細(xì)小動(dòng)脈肌性化；NLRP3其介導(dǎo)的炎癥通路及下游Caspase-1的激活及白介素1β的釋放也與動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及增殖關(guān)系密切。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)诘脱躞w系中預(yù)先加入ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通，恰好抑制了ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路，同時(shí)大大阻斷了內(nèi)皮細(xì)胞增殖。因此，我們大致可以推論，ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路是調(diào)節(jié)動(dòng)脈內(nèi)皮增殖的重要機(jī)制之一。

目前改善內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的藥物，如內(nèi)皮素受體拮抗劑、血管緊張素受體阻斷劑、血脂調(diào)節(jié)藥物等已經(jīng)證明可一定程度改善PAH患者的病情，但由于這些藥物副作用較大，目前臨床上仍不能作為低氧性PAH的長(zhǎng)期治療手段[15]。因此，尋找新的針對(duì)低氧性PAH的有效治療靶點(diǎn)和新藥物勢(shì)在必行。本研究結(jié)果提示，ROS/ALOX5/NLRP3信號(hào)通路在低氧所致的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖中顯著激活，抑制這一通路可顯著減少低氧所致的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但這一信號(hào)通路的干預(yù)實(shí)驗(yàn)尚需在PAH動(dòng)物模型中驗(yàn)證，其后續(xù)是否可作用藥物調(diào)控的靶點(diǎn)從而形成新的治療手段，還有待進(jìn)一步深入研究。

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TheeffectofROS/ALOX5/NLRP3signalingpathwayonhypoxia-inducedpulmonaryarteryendothelialcellproliferation

HUZhi，MAHui，F(xiàn)ANFen-ling，LIUWen-juan，XIEHang

(DepartmentofStructuralHeartDisease，TheFirstAffiliatedHospital，Xi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061，China)

ObjectiveTo investigate the role of activation of ROS/ALOX5/NLRP3 signaling pathway in hypoxia-induced proliferation of pulmonary artery endothelial cells.MethodsThe human pulmonary arterial endothelial cells (HPAEC) were cultured in normoxia (21% O2) and hypoxia (1% O2) for 24，48，72 and 96 hours，respectively.At the same time，subsets of reactive oxygen species (ROS) scavenger，Trolox and ALOX5 inhibitor，Zileuton were set up.The CCK-8 method was used to detect the cell proliferation rate.The change of ROS level in HPAEC under hypoxia was detected by probe H2-DCFA.Western blot was used to detect the expression of ALOX5，NLRP3 and caspase-1 protein after intervention of hypoxia，Trolox and Zileuton，respectively.ResultsHPAEC were significantly proliferated at 48，72 and 96 hours after hypoxia，reaching (135.6±29.4)%，(185.3±21.7)% and (212.3±39.0)%，respectively.At the same time，intracellular ROS at 24-，48-and 72-hour was increased significantly and return to normal at 96 hour.The protein expressions of ALOX5，NLRP3 and caspase-1 were increased with the prolonged hypoxia time.Pretreatment with Trolox and Zileuton inhibited the expressions of NLRP3 and caspase-1 in the inflammasome，and the cell proliferation rate was decreased significantly.ConclusionROS/ALOX5/NLRP3 signaling pathway is significantly activated in hypoxia-induced proliferation of HPAEC，and inhibition of this pathway can significantly reduce hypoxia-induced endothelial cell proliferation.

Pulmonary arterial hypertension；Hypoxia；Human pulmonary artery endothelial cells；NLRP3 inflammasome；Signaling pathway

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究基金面上項(xiàng)目(編號(hào):2014JM2-8171)

R563

A

1672-6170(2017)06-0044-05

2017-07-21；

2017-09-22)