丁 月, 張 晶, 田 景 玉, 姜 鵬 飛, 周 大 勇,, 宋 亮,

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116034 )

紫外線對刺參體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度與凋亡的影響

丁 月1, 張 晶1, 田 景 玉1, 姜 鵬 飛2, 周 大 勇1,2, 宋 亮1,2

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116034 )

通過激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞儀，檢測紫外線對刺參體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度變化及凋亡的影響。將鮮活刺參隨機等分3組：對照組刺參為未經(jīng)UVA照射；UVA組刺參為經(jīng)UVA(15 W/m2)照射30 min；藥物處理-UVA組刺參為鈣離子螯合劑(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)灌入刺參體腔內(nèi)后，再經(jīng)UVA照射30 min。刺參經(jīng)室溫避光分別靜置0、1、2、3和4 h后采集其體腔細胞待檢。結(jié)果表明，與對照組相比，UVA組刺參體壁“化皮”程度隨靜置時間延長而逐漸加重，并伴隨“吐腸”現(xiàn)象的發(fā)生；其體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度隨著靜置時間的延長而逐漸升高，2 h時達到最高值，隨后下降；體腔細胞凋亡率在3 h后達到最高值，隨后降低。藥物處理-UVA組刺參體壁“化皮”程度隨靜置時間延長而未見明顯變化；其體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度和細胞凋亡率均顯著低于UVA組。推斷紫外線照射刺參導致刺參體壁發(fā)生“化皮”現(xiàn)象，其體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高促進了細胞凋亡率的上升。

刺參；體腔細胞；鈣離子；細胞凋亡

0 引 言

刺參(Stichopusjaponicas)屬棘皮動物(Echinodermata)，海參綱(Holothuroidea)[1]，是沿海漁業(yè)最重要的海參品種之一。刺參易受溫度、鹽濃度、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、光照以及機械刺激等應激因素的影響，能夠觸發(fā)其發(fā)生“化皮”現(xiàn)象[2-4]。這種現(xiàn)象給刺參的?；畋ｕr儲運行業(yè)帶來諸多不便。研究證實，紫外線作為最重要的應激因素之一，能夠誘導刺參發(fā)生“化皮”現(xiàn)象，且伴隨細胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[5]。但刺參細胞對紫外線刺激的生物學響應研究十分有限，此條件下細胞內(nèi)Ca2+濃度與凋亡水平的研究更是鮮有報道。Ca2+是細胞內(nèi)重要的第二信使，改變細胞內(nèi)Ca2+濃度能夠參與調(diào)控許多不同的細胞功能[6-7]。其中，細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的改變對細胞凋亡的調(diào)控發(fā)揮非常重要的作用，一旦細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)被打亂，細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，引起鈣超載，從而誘導細胞凋亡[8]。刺參作為海洋無脊椎動物，其體腔細胞具有氣體交換、營養(yǎng)物質(zhì)運輸和貯存、凝塊形成、排泄、免疫防御等功能[9-12]。海洋無脊椎動物體腔細胞作為一種環(huán)境脅迫的新型細胞生物傳感器監(jiān)控傳感器的生物學改變，可以用來評估水生生態(tài)系統(tǒng)健康，也可以用來評價水產(chǎn)動物的鮮活程度[9,13]。因此，本研究采用紫外線(UVA)照射刺參后靜置不同時間，通過激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞儀，檢測其體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度及細胞凋亡水平的變化，同時觀察刺參在靜置過程中體壁“化皮”程度的變化，以探究紫外線照射對體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度與細胞凋亡變化的影響，進一步探討刺參“化皮”現(xiàn)象的可能機制，以期為刺參等海珍品保活保鮮技術(shù)可控靶點的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

刺參：大連劉家橋市場購買，產(chǎn)自大連金州周邊海域。

流式細胞儀，BD FACSVerseTM；激光掃描共聚焦顯微鏡，Leica DMi8；凋亡試劑盒，美國醫(yī)療器械有限公司；Ca2+熒光探針Fluo-3 AM，碧云天生物技術(shù)有限公司；鈣離子螯合劑(BAPTA-Na)，艾美捷科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 實驗分組

將體長(12.5±1.6) cm、體質(zhì)量(128.3±7.2) g鮮活刺參隨機等分為3組，每組5只。對照組為無紫外線照射的刺參；UVA組為經(jīng)15 W/m2紫外線照射30 min處理的刺參；藥物處理-UVA組為Ca2+螯合劑(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)灌入刺參體腔內(nèi)，再經(jīng)15 W/m2紫外線照射30 min處理的刺參。每組刺參分別室溫避光靜置0、1、2、3和4 h。

1.2.2 刺參體腔細胞的制備

每組刺參斷尾處理，收集體腔液，300目濾布過濾除雜，制備體腔細胞。

1.2.3 激光共聚焦檢測體腔細胞內(nèi)的游離Ca2+濃度

采用Fluo-3 AM對體腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度進行檢測。取體腔液500 μL，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入HBSS溶液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度約為1×106cells/mL，加入終濃度5 μmmol/L 的Fluo-3 AM,輕輕混勻，室溫避光孵育20 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長為525～530 nm。掃描Ca2+的熒光強度，實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀對體腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的檢測

Fluo-3 AM對體腔細胞內(nèi)游離Ca2+標記方法同“1.2.3”。制成1×106個/mL，流式細胞儀進行檢測，激發(fā)光為氬離子激光，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長為525～530 nm。每組檢測的細胞量在105個以上，實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞儀對體腔細胞凋亡率的檢測

取體腔液500 μL，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，利用1×Binding Buffer制備100 μL濃度為1×106個/mL體腔細胞懸液，分別加入5 μL 的Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，再加入400 μL的1×Binding Buffer，輕輕混勻，流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0對數(shù)據(jù)進行分析。正態(tài)分布的計量資料以(均數(shù)±標準差)表示，兩組間比較采用t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 UVA對刺參體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響

2.1.1 基于激光掃描共聚焦顯微鏡檢測體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度

利用Fluo-3 AM標記刺參體腔細胞內(nèi)游離Ca2+，在激光掃描共聚焦顯微鏡下檢測體腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化的情況，如圖1所示。與對照組相比較，UVA組刺參體腔細胞內(nèi)游離Ca2+的熒光強度明顯升高(P<0.05)，并且隨著靜置時間的延長而逐漸上升，靜置2 h達到最高值，隨后下降。藥物處理-UVA組刺參體腔細胞內(nèi)游離Ca2+的熒光強度雖高于對照組(P<0.05)，但顯著低于UVA組刺參(P<0.05)。結(jié)果表明，UVA照射刺參能夠?qū)е缕潴w腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度在整個檢測過程中持續(xù)保持高水平；Ca2+螯合劑灌入刺參體腔內(nèi)，經(jīng)UVA照射后，其體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度相比較于UVA組發(fā)生了大幅度的降低。推測刺參細胞體腔細胞內(nèi)的游離Ca2+主要來源于其細胞外Ca2+。

2.1.2 基于流式細胞儀檢測體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度

利用流式細胞儀檢測體腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化的情況，如圖2所示。與對照組相比，UVA組刺參體腔細胞內(nèi)游離Ca2+峰圖向右遷移(圖2(a))，表明Ca2+的熒光強度明顯升高(P<0.05)；UVA照射后，室溫避光靜置0、1、2、3和4 h 的熒光強度先升高，到2 h左右達到峰值，而反應超過2 h后逐漸降低(圖2(c))；定量結(jié)果表明，UVA照射刺參后，靜置不同時間的體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度是對照組體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度的2倍以上。與對照組相比，藥物處理組-UVA的刺參體腔細胞內(nèi)游離Ca2+峰圖也向右遷移(圖2(b))。

(a) UVA組的Ca2+熒光成像

(b) 藥物處理-UVA組的Ca2+熒光成像

(c) Ca2+熒光強度定量分析

圖1 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測體腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化

Fig.1 Changes of Ca2+concentration in coelomocytes detected by laser scanning confocal microscopy

在室溫避光靜置0、1、2、3和4 h后測得的Ca2+強度熒光強度先逐漸升高，到3 h左右達到最大值，之后熒光強度逐漸降低；其體腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯低于UVA組刺參體腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度(P<0.05，圖2(c))。此結(jié)果進一步驗證了UVA照射刺參能夠?qū)е缕潴w腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的升高。

2.2 UVA對刺參體腔細胞凋亡水平的影響

通過流式細胞儀檢測UVA對刺參體腔細胞凋亡水平的影響，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，UVA組經(jīng)紫外照射后，體腔細胞凋亡率增大，并且隨著靜置時間的延長而逐漸增大，在靜置3 h后達到最大(P<0.05，圖3(a))。其中，對照組的細胞凋亡率為(6.73±0.77)%，經(jīng)UVA照射，室溫避光靜置0、1、2、3和4 h后，測得UVA組的細胞凋亡率逐漸升高，靜置3 h達到最大，隨后下降，分別為(8.96±1.41)%、(12.65±1.15)%、(17.13±2.20)%、(22.48±1.75)%和(9.59±0.64)%(圖3(c))。與對照組相比，藥物處理-UVA組刺參體腔細胞凋亡率也呈現(xiàn)升高的趨勢(P<0.05，圖3(b))，但其在室溫避光靜置0、1、2、3和4 h后，測得的細胞凋亡率變化趨勢與UVA組相似，分別為(7.34±2.49)%、(9.02±1.37)%、(12.57±0.70)%、(14.35±0.62)%和(9.04±0.50)%；其體腔細胞凋亡率明顯低于UVA組(P<0.05，圖3(c))。結(jié)果表明，UVA照射刺參能夠引起其體腔細胞發(fā)生凋亡；本研究在UVA照射的同時加用了Ca2+螯合劑(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)，發(fā)現(xiàn)其凋亡率雖然沒有恢復正常對照水平，但UVA照射引起的體腔細胞凋亡減少，推測是由于Ca2+螯合劑抑制了刺參細胞外Ca2+進入細胞內(nèi)，降低其細胞內(nèi)游離Ca2+的濃度，減少了UVA對體腔細胞凋亡的促進作用，發(fā)揮一定的保護作用。

(a) UVA組Ca2+熒光強度流式峰

(b) 藥物處理-UVA組Ca2+熒光強度流式峰

(c) Ca2+熒光強度定量分析

圖2 流式細胞儀檢測體腔細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化

Fig.2 Changes of Ca2+concentration in coelomocytes detected by flow cytometer

2.3 UVA對刺參體壁組織的影響

由圖4可以看出，鮮活刺參未經(jīng)UVA照射、室溫避光靜置不同時間，其體態(tài)表皮整體完好，有彈性；鮮活刺參經(jīng)UVA照射30 min后，室溫避光靜置過程中，體表發(fā)生明顯變化。經(jīng)UVA照射后，刺參表皮受損；靜置1 h后發(fā)生“吐腸”現(xiàn)象；靜置3 h后參體癱軟；靜置4 h后白色真皮層暴露，體壁組織出現(xiàn)“黏液化”現(xiàn)象。結(jié)果表明，刺參經(jīng)UVA照射后，隨著靜置時間的延長，“化皮”現(xiàn)象逐漸加重；在這一過程中，刺參出現(xiàn)吐腸，體壁組織出現(xiàn)許多黏液，體壁原有的機械剛性變差。Ca2+螯合劑處理的刺參，經(jīng)UVA照射30 min后，室溫避光靜置過程中，其體表彈性有所下降，但沒有發(fā)生明顯的損傷變化，即UVA引起的刺參體壁損傷程度明顯降低。結(jié)果表明，經(jīng)UVA照射，刺參體壁組織發(fā)生一定損傷，其損傷程度與此過程中體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度、凋亡水平有一定的時序性，推測UVA照射刺參發(fā)生“化皮”現(xiàn)象可能的原因是UVA照射導致體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引起細胞發(fā)生凋亡，進而造成刺參體壁組織一定程度上的損傷。

3 結(jié) 論

體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度主要受到胞內(nèi)鈣庫釋放和胞外鈣離子進出的調(diào)節(jié)，不同時空Ca2+濃度的微小變化可以編碼出復雜的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡進而影響細胞的各項功能[14]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，UVA照射刺參后，體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度是對照組的2倍以上；體腔細胞凋亡率是對照組的2倍以上，且都顯著高于藥物處理組-UVA的；同時，UVA組刺參出現(xiàn)“吐腸”，參體癱軟，暴露白色真皮層現(xiàn)象。實驗結(jié)果表明，刺參體壁發(fā)生“化皮”現(xiàn)象，推測出紫外線照射使體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促進了細胞凋亡，引起了刺參體壁組織損傷。

綜上所述，紫外線照射導致刺參體壁發(fā)生“化皮”現(xiàn)象的過程中，其體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高促進了細胞凋亡水平上升。本研究從Ca2+通道作為細胞感知外界環(huán)境變化應答器的角度，探討了刺參“化皮”現(xiàn)象可能的機制，一定程度上對刺參等海珍品?；畋ｕr技術(shù)的可控靶點研究提供了指導意義。

(a) UVA組細胞凋亡流式散點圖

(b) 藥物處理-UVA組細胞凋亡流式散點圖

(c) 細胞凋亡率的定量分析

(a) 對照組

(b) UVA組

(c) 藥物處理-UVA組

圖4 紫外線誘導刺參“化皮”過程中體壁組織形態(tài)的變化

Fig.4 Morphological changes of “melting” sea cucumber induced by UVA radiation

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EffectofUVAonintracellularfreecalciumconcentrationandapoptosisofseacucumberStichopusjaponicascoelomocytes

DINGYue1,ZHANGJing1,TIANJingyu1,JIANGPengfei2,ZHOUDayong1,2,SONGLiang1,2

( 1.SchoolofFoodScienceandTechnology,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China；2.NationalEngineeringResearchCenterofSeafood,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Effect of UVA on intracellular free calcium concentration and apoptosis of sea cucumberStichopusjaponicascoelomocytes were investigated by laser scanning confocal microscope and flow cytometer. FreshS.japonicaswas randomly divided into 3 groups:S.japonicasin the control group was not irradiated by UVA;S.japonicasin the UVA group was irradiated by UVA with the intensity of 15 w/m2for 30 min; andS.japonicasin the Ca2+-suppression group was irradiated by UVA with the intensity of 15 w/m2for 30 min after injecting with calcium chelation agent (BAPTA sodium salt, IC50=1.47 mmol/L) into the coelomic cavity.S.japonicaswere incubated at room temperature in dark for 0, 1, 2, 3 and 4 h, respectively. Compared with the control group, the “melting” degree of body wall of UVA group was gradually increased with the prolonging incubation time, and accompanied by the phenomenon of “spit intestinal”; intracellular free calcium concentration of coelomocytes increased gradually with the prolonging incubation time, which reached the highest level after 2 h of incubation and then decreased; apoptosis rates of coelomocytes achieved the highest after 3 h of incubation and then decreased. The “melting” degree of body wall of the Ca2+-suppression group was not obvious; intracellular free calcium concentration and apoptosis rates of coelomocytes were significantly lower than UVA group. The above results indicated that the “melting” ofS.japonicasbody wall was induced by UVA irradiation, in which promoted the apoptosis of coelomocytes by the up-regulation of intracellular free calcium concentration.

Stichopusjaponicas; coelomocytes; calcium ions; apoptosis

丁月,張晶,田景玉,姜鵬飛,周大勇,宋亮.紫外線對刺參體腔細胞內(nèi)Ca2+濃度與凋亡的影響[J].大連工業(yè)大學學報,2017,36(6):391-396.

DING Yue, ZHANG Jing, TIAN Jingyu, JIANG Pengfei, ZHOU Dayong, SONG Liang. Effect of UVA on intracellular free calcium concentration and apoptosis of sea cucumberStichopusjaponicascoelomocytes[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6): 391-396.

2016-11-09.

國家自然科學基金項目(31401562)；遼寧省農(nóng)業(yè)領域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2015002)；遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2014220).

丁 月(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：宋 亮(1980-)，男，講師.

TS254.9

A

1674-1404(2017)06-0391-06