劉 榮 娜， 江 國 金， 陳 瑞 華， 趙 長 新

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.中糧麥芽(大連)有限公司， 遼寧 大連 116200 )

帶電蛋白質(zhì)對α-淀粉酶活性及酶促反應(yīng)的影響

劉 榮 娜1， 江 國 金2， 陳 瑞 華1， 趙 長 新1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.中糧麥芽(大連)有限公司， 遼寧 大連 116200 )

利用Zeta電位儀對帶電蛋白質(zhì)表面的Zeta電位進(jìn)行測量，在不同濃度梯度的還原型谷胱甘肽、牛血清蛋白和兩種蛋白的混合溶液中分別加入α-淀粉酶，測定目標(biāo)酶系的活性、米氏常數(shù)、活化能等參數(shù)。結(jié)果表明，分別加入濃度為0.6 mmol/L還原型谷胱甘肽、牛血清蛋白和兩種蛋白的混合溶液的酶活力分別提高7.9%、8.7%、11.1%，米氏常數(shù)從129.7 g/L分別降低至116.0、104.2、85.1 g/L，最大反應(yīng)速率從32 g/(L·min)分別降至30.50、28.10、23.79 g/(L·min)，活化能從13.91 kJ/mol分別降至10.00、9.91、9.88 kJ/mol。這種改變與蛋白質(zhì)的濃度呈正相關(guān)，線性關(guān)系良好。說明不同帶電蛋白質(zhì)的加入使α-淀粉酶的活性增大，酶與底物的親和力增加，反應(yīng)速率加快，效率更高。

α-淀粉酶；帶電蛋白；活化能；Zeta電位

0 引 言

α-淀粉酶(1,4-α-D葡聚糖葡聚糖水解酶；E.C.3.2.1.1) 可以水解淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，水解產(chǎn)物為糊精、低聚糖和單糖[1]。酶作為一種高效、專一的催化劑，在很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，比如醫(yī)學(xué)、食品和飲料、洗滌、皮革等行業(yè)[2-3]。在磁場和電場方面的研究已經(jīng)有諸多報(bào)道[4]，包括脈動場和靜電場，這些研究大多以酶的活性、米氏參數(shù)和酶的二級結(jié)構(gòu)為研究對象，結(jié)果顯示場的存在使酶促反應(yīng)過程中酶活、米氏參數(shù)和二級結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變，但是對于反應(yīng)所需活化能的研究未有涉及，并且對于這種變化都沒有合理地解釋[5]。YE等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在胰蛋白酶的消化過程中，不同蛋白質(zhì)被消化的先后順序與蛋白濃度無關(guān)，而與切割位點(diǎn)附近的氨基酸殘基種類有關(guān)，在中性氨基酸殘基附近的位點(diǎn)切割速度很快，而在帶電氨基酸殘基附近的位點(diǎn)切割速度很慢，甚至不切割。

本研究中，蛋白質(zhì)的Zeta電位由Zetasizer Nano ZS電位儀測定，用于表征蛋白質(zhì)的表面電勢。對加入不同帶電荷的蛋白質(zhì)后酶的活性、米氏參數(shù)和活化能進(jìn)行分析，以期在提高酶活、多酶系統(tǒng)中各種酶的協(xié)同作用、酶和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

α-淀粉酶(A4551)，地衣芽孢桿菌種屬，Sigma 公司，純度為99%，4 ℃保存，質(zhì)量濃度為1 mg/mL；還原型谷胱甘肽(GSH)、牛血清蛋白(BSA)，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純?？扇苄缘矸廴芤含F(xiàn)用現(xiàn)配，0 ℃保存，質(zhì)量濃度為20 g/L。所有的實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。試劑制備的緩沖液均為pH 6.9、濃度20 mmol/L 的PBS緩沖液。

Nano-ZS90 Zeta 電位儀，英國Malvern公司。

1.2 方 法

1.2.1 Zeta電位的測量

選取不同大小、不同分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行電位測量，根據(jù)Zeta電位儀的測量條件，選擇無色、無毒、常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA和GSH，由于BSA的溶解性問題，BSA最高濃度選擇0.6 mmol/L，GSH及混合液濃度與其保持一致。

把100、200、300、400 mg的BSA固體分別溶于10 mL的PBS緩沖液中，制得濃度分別為0.15、0.30、0.45、0.60 mmol/L的BSA溶液；按同種方法配得相同濃度的GSH溶液；把相同質(zhì)量的BSA溶解在10 mL對應(yīng)濃度的GSH中得到兩種蛋白的混合溶液。所有的待測樣品經(jīng)10 000 r/min 室溫離心20 min，上清液經(jīng)0.2 μm膜過濾得待測樣品。

Zeta電位的測量溫度選擇40 ℃，Zeta電位通過測量顆粒的電泳遷移率，由Henry方程計(jì)算得到。

(1)

式中：UE為電泳遷移率，m2/s；ε為40 ℃下溶液的電解質(zhì)常數(shù)，F(xiàn)/m，由系統(tǒng)設(shè)為73.15 F/m；ζ為Zeta電位，mV；f(ka)是Henry方程，近似值為1.5；η為溶液的黏度，在測定溫度下設(shè)定為0.728×10-3Pa·s。用注射器吸取1 mL待測溶液，注射到一次性樣品池(DTS1061，馬爾文)進(jìn)行Zeta電位的測量。

1.2.2 不同濃度不同帶電荷的蛋白質(zhì)處理酶液

把酶固體粉末溶解在20 mmol/L，pH 6.9的PBS溶液中制得α-淀粉酶溶液，不同濃度的3種蛋白質(zhì)分別加入到酶液中，放置相同時(shí)間。用緩沖液代替蛋白質(zhì)作為空白對照。

1.2.3 α-淀粉酶活性的測定

酶活力單位定義為40 ℃、pH 6.9條件下，1 min 從淀粉中水解產(chǎn)生1.0 mg的葡萄糖所需要的酶量。α-淀粉酶活力計(jì)算公式為

(2)

式中：m為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量，mg；V為反應(yīng)所用淀粉酶原液體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min；n為原液稀釋倍數(shù)。

利用DNS法測定還原糖的生成量。

1.2.4 米氏參數(shù)的測量

測得還原糖的生成量，根據(jù)不同底物濃度和反應(yīng)速率的關(guān)系建立L-B方程，由斜率計(jì)算出米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 活化能的計(jì)算

根據(jù)蛋白質(zhì)和酶的一般性質(zhì)，在其變性以前，酶的活力隨溫度升高而升高。其定量規(guī)律可由Arrhenius公式描述，即

K=Aexp(-Ea/RT)

(3)

式中：K為反應(yīng)的速率常數(shù)；A為指前因子；Ea為活化能，kJ/mol；R為摩爾氣體常數(shù)；T為熱力學(xué)溫度，K。

測出不同溫度(T1=303 K，T2=313 K)下的K，公式為

(4)

2 結(jié)果與討論

2.1 Zeta電位

測得BSA、GSH的電位分別為-10.7和-5.5 mV，α-淀粉酶溶液的電位為-14.3 mV，在酶促反應(yīng)過程中酶表面電位變化曲線如圖1所示。

圖1 酶在反應(yīng)過程中的Zeta電位變化

對曲線進(jìn)行擬合得到滿足的函數(shù)關(guān)系為

f(x)=aebx+cedx

式中：a=-7.97(-8.359,-7.581)；b=4.154×10-3(4.278×10-4,7.879×10-3)；c=5 524(-3.107×104,4.212×104);d=-6.053(-11.33,-0.776 1);R2=0.969，擬合效果良好。

由圖1可知，在酶和底物接觸瞬間，Zeta電位急劇下降，后慢慢回復(fù)，但不能回到最初狀態(tài)。因此，隨著酶使用次數(shù)的增加，酶活性降低，與酶表面帶電氨基酸的個數(shù)變化有關(guān)。

2.2 蛋白質(zhì)對酶活性的影響

于40 ℃添加不同濃度的GSH、BSA、混合蛋白對酶液進(jìn)行處理，測定活性并與空白對照(無蛋白)對比，得到不同濃度的蛋白質(zhì)與α-淀粉酶活性的關(guān)系，如圖2所示。由圖2可知，與原酶液相比，與酶帶同性電荷、不同Zeta電位的蛋白質(zhì)的加入不同程度地促進(jìn)了酶活，并且與蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān)，0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的GSH、BSA、混合蛋白酶活分別提高了2.0%、3.9%、5.9%、7.9%，2.15%、4.2%、6.2%、8.7%和3.2%、6.0%、8.4%、11.1%。

圖2 蛋白質(zhì)濃度對α-淀粉酶活性的影響

為了更直觀地比較Zeta電位對α-淀粉酶活性的影響，選擇濃度均為0.6 mmol/L的3種帶電蛋白質(zhì)，對酶活性的影響如圖3所示，同濃度、帶不同表面電荷的蛋白質(zhì)對酶活影響效果不同，表面電荷量越多對酶活促進(jìn)作用越強(qiáng)。

圖3 同濃度不同蛋白對α-淀粉酶活性的影響

2.3 α-淀粉酶米氏常數(shù)的測定結(jié)果

根據(jù)不同底物濃度下產(chǎn)生的還原糖求得反應(yīng)速率，按照雙倒數(shù)作圖法，作出加入不同蛋白質(zhì)后α-淀粉酶的米氏方程曲線，如圖4所示。由圖4可得，不同帶電荷的蛋白質(zhì)加入，α-淀粉酶的米氏方程分別為

(5)

(6)

(7)

(8)

圖4 不同濃度的蛋白質(zhì)下的α-淀粉酶的米氏方程曲線

Fig.4 Michaelis-Menton curves of α-amylase at different concentration of protein

式(5)～(8)分別為空白、GSH、BSA和混合蛋白的米氏方程。得到的α-淀粉酶的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)見表1。

表1 加入不同蛋白質(zhì)的α-淀粉酶動力學(xué)參數(shù)

酶與底物親和力用Km和Vm/Km表示，由表1可知，Km降低，Vm/Km增加，故不同帶電蛋白質(zhì)的加入使酶與底物的親和力增加，增加程度由高到低依次為混合液、BSA、GSH，即Zeta電位高的蛋白質(zhì)對酶及酶促反應(yīng)的影響程度大。

2.4 不同Zeta電位的蛋白質(zhì)對α-淀粉酶活化能的影響

根據(jù)單位時(shí)間產(chǎn)生的還原糖量，求得反應(yīng)速率常數(shù)和不同濃度的GSH、BSA、兩者混合液的活化能，得到不同濃度、不同帶電荷的3種蛋白質(zhì)對α-淀粉酶活化能的影響如圖5所示。由圖5可知，加入不同濃度的GSH活化能分別降低2.66%、14.40%、23%、28%；加入不同濃度的BSA活化能分別降低3.88%、15.97%、23.80%、28.90%；加入不同濃度的混合蛋白活化能分別降低5.96%、16.15%、24.30%、29.10%。蛋白質(zhì)與酶分子之間的距離隨著酶促反應(yīng)過程中酶表面電荷的降低而減小，靜電斥力增加，酶在分子中更趨向于穩(wěn)定，催化效率更高，反應(yīng)更易進(jìn)行。

圖5 不同濃度的蛋白質(zhì)與α-淀粉酶活化能的關(guān)系

Fig.5 Activation energies of α-amylase at different concentration of protein

3 結(jié) 論

帶電蛋白質(zhì)對α-淀粉酶活性、Km、Vm/Km和活化能有很大影響。在實(shí)驗(yàn)條件下，蛋白質(zhì)大小、分子質(zhì)量和濃度都對α-淀粉酶的活性和酶促反應(yīng)有很大影響，酶活性增強(qiáng)，Km減小、Vm/Km增加，并且隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，效果更加明顯，與蛋白質(zhì)濃度成正相關(guān)，說明蛋白質(zhì)的加入使酶與底物的親和力增加，反應(yīng)速率加快，效率更高，原因可能是帶同種電荷的蛋白質(zhì)和酶之間相互排斥，蛋白質(zhì)帶電荷量越高，排斥作用力越大，且隨酶在酶促反應(yīng)過程中電荷的變化規(guī)律，酶與蛋白質(zhì)之間的距離先急劇減小，之后增加，酶和蛋白質(zhì)之間的排斥力增大，酶在溶液中趨于穩(wěn)定，更好地發(fā)揮作用。

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Effectofchargedproteinonenzymaticactivityofα-amylaseandenzymaticreaction

LIURongna1,JIANGGuojin2，CHENRuihua1，ZHAOChangxin1

( 1.SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China；2.COFCOMalt(Dalian)CompanyLimited,Dalian116200,China)

Zeta potential was measured to study the effect of charged proteins on α-amylase and its enzymatic reaction. α-amylase solution was added into reduced glutathione (GSH), bovine serum albumin (BSA) and the mixture of two proteins with different concentrations. The activities, kinetic parameters and activation energies were determined. The results showed that the activities were increased by 7.9%, 8.7% and 11.1% respectively at the concentration of 0.6 mmol/L. The kinetic parameters ofKmdecreased from 129.7 g/L to 116.0, 104.2, 85.1 g/L, whileVmdecreased from 32 g/(L·min) to 30.5, 28.1, 23.7 g/(L·min), respectively. The activation energies decreased from 13.91 kJ/mol to 10.00, 9.91 and 9.88 kJ/mol. The change in α-amylase is positively correlated with the protein concentration and has a good linear relationship. The results indicated that the activity of α-amylase and the affinity of enzyme and substrate increased, the reaction rate was accelerated and the efficiency was improved.

α-amylase; charged proteins; activation energy; Zeta potential

劉榮娜,江國金,陳瑞華,趙長新.帶電蛋白質(zhì)對α-淀粉酶活性及酶促反應(yīng)的影響[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(6):402-405.

LIU Rongna, JIANG Guojin, CHEN Ruihua, ZHAO Changxin. Effect of charged protein on enzymatic activity of α-amylase and enzymatic reaction[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6): 402-405.

2016-03-23.

劉榮娜(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：趙長新(1955-)，男，教授.

TS201.2；Q556.2

A

1674-1404(2017)06-0402-04