田 景 玉， 丁 月， 張 晶， 姜 鵬 飛， 周 大 勇,， 宋 亮,

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術研究中心， 遼寧 大連 116034 )

紫外線照射對刺參體腔細胞吞噬活性的影響

田 景 玉1， 丁 月1， 張 晶1， 姜 鵬 飛2， 周 大 勇1,2， 宋 亮1,2

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術研究中心， 遼寧 大連 116034 )

采用流式細胞儀(FCM)技術與激光共聚焦顯微鏡技術(LSCM)對紫外線(UVA)照射后的刺參(Stichopusjaponicus)體腔細胞的吞噬活性進行了檢測。通過對刺參體內(nèi)、外熒光吞噬微球孵育體系的篩選和比較，確定采用體外孵育方法測定吞噬率。在體外吞噬中，以熒光微球與體腔細胞的體積比為1∶1 500測定刺參體腔細胞吞噬率。結(jié)果表明，刺參經(jīng)UVA照射，靜置不同時間(0～4 h)后提取體腔細胞,采用FCM檢測其吞噬率在靜止1 h后達到最大，隨后下降，LSCM檢測結(jié)果與之相同；采用FCM檢測發(fā)現(xiàn)，隨著靜置時間的延長，刺參體腔細胞的死亡率呈不斷上升趨勢，推測UVA照射會對刺參體腔細胞的免疫功能造成一定程度的損傷，其死亡率與吞噬率之間存在著一定的聯(lián)系。通過檢測刺參體腔細胞吞噬率的變化可以判斷刺參的鮮活狀態(tài)。

刺參；體腔細胞；吞噬；紫外線；死亡率

0 引 言

刺參(Apostichopusjaponicus(Selenka))，又稱仿刺參，屬棘皮動物門 (Echinodermata)，為典型的溫帶種類[1]。到2015年底，我國刺參產(chǎn)量達到了20.5萬t[2]。與刺參產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展相比，刺參生理免疫學研究相對滯后，導致其在刺參的養(yǎng)殖、加工和運輸產(chǎn)業(yè)缺乏完善的理論依據(jù)，加之市場管理與運作沒有在科學的指導下進行，出現(xiàn)了諸如腐爛化皮現(xiàn)象頻發(fā)、苗種資源貧乏等問題，造成了巨大的經(jīng)濟損失，成為制約該產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸之一。

國外學者對棘皮動物免疫系統(tǒng)的研究開始僅僅是對棘皮動物的直觀觀察，包括觀察其體腔細胞的吞噬作用、包裹及同種異物體的排斥現(xiàn)象[3]。目前已有國內(nèi)外學者陸續(xù)對海膽、海星等棘皮動物進行免疫系統(tǒng)研究，而對刺參的免疫系統(tǒng)研究較少。刺參具有比較寬闊的真體腔，體腔中的體腔液有參與免疫反應的細胞，而體腔細胞可與多種體腔免疫因子共同并直接作用于入侵病原構(gòu)成其免疫應答[4]。刺參機體免疫系統(tǒng)主要由細胞免疫和體液免疫構(gòu)成，兩者相互協(xié)同，共同對體內(nèi)異物進行識別，從而完成傷口修復作用。隨著研究的逐步深入，對刺參免疫系統(tǒng)組成已有初步的了解， 但仍然有很多防御機制未知[5]。有研究表明，棘皮動物體腔細胞的吞噬作用是機體最重要的免疫功能之一，其吞噬活力的大小直接影響了免疫效應的高低。

本研究將鮮活刺參經(jīng)過紫外線(UVA)照射后，靜置不同時間，通過測定體腔細胞吞噬率及死亡率的變化情況來監(jiān)測刺參機體狀態(tài)，以期從分子水平上研究刺參細胞免疫功能提供科學可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試劑：0.75 μm YG熒光羧基微球。

儀器：流式細胞儀，BD FACSVerseTM；激光共聚焦顯微鏡，Leica SP8。

1.2 方 法

1.2.1 刺參原料的制備

鮮活刺參，體長(12.5±1.6) cm，體質(zhì)量(128.3±7.2) g，產(chǎn)自大連金州周邊海域。在低溫條件下運至實驗室，暫養(yǎng)于25 L玻璃水族箱內(nèi)，不間斷充氣，每天投飼換過濾海水，維持水溫15 ℃左右，鹽度28～31，pH 7.9～8.2，3 d后用于實驗。

1.2.2 體腔細胞懸液制備

用無菌注射器于刺參腹部近1/3處提取體腔液，300目濾布過濾。每個試驗點均保證3只刺參的體腔液等體積混合作為一次實驗，重復測定3次。取適宜體積的混合體腔液于2 700 r/min離心5 min后除去上清液，利用高壓滅菌的體腔液進行重懸，制備得到細胞濃度為106～107個/mL的體腔細胞懸液，用于后期實驗。

扎實推進高中化學實驗探究性教學，需要教師轉(zhuǎn)變思維觀念，理解教學本質(zhì)，為學生創(chuàng)造利于“學”的環(huán)境.實驗探究體現(xiàn)了實事求是、科學求真的精神，也促進了學習方式的多樣化.筆者將以創(chuàng)設問題的方式作為實驗探究的開端，引導學生通過實驗親身求證書本結(jié)論，以加強學生對知識的掌握能力.

1.2.3 樣本前處理

1.2.3.1 細胞體內(nèi)熒光標記及體腔細胞吞噬率檢測

利用無菌注射器由刺參的尾部向體內(nèi)注射30 μL的熒光微球原液，分別體內(nèi)孵育30、60、120 min 后提取體腔液，制成待檢測樣品。

1.2.3.2 熒光微球濃度對體外體腔細胞吞噬率的影響

取制備好的體腔細胞懸液，設置熒光微球與體腔細胞體積比分別為1∶250、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000，室溫置于搖床上，慢速暗反應孵育30 min，300目濾布過濾，制成待檢測樣品。

1.2.3.3 紫外線照射后刺參體外吞噬率的比較

1.2.3.4 紫外線照射后刺參體腔細胞死亡率的比較

設置對照組與UVA照射后靜置0、1、2、3、4 h 組，取100 μL體腔細胞懸液，加入5 μL PI暗反應孵育染色15 min后，加入400 μL的Binding Buffer，混勻，300目濾布過濾，制成待檢測樣品。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞吞噬率和死亡率

利用流式細胞儀在測定吞噬率與死亡率時，首先在FSC/SSC散點圖中圈定細胞群體，再根據(jù)吞噬熒光微球的細胞及死亡細胞所具有的熒光信號，在熒光頻道數(shù)(FITC，吞噬率；PE，死亡率)單參數(shù)的直方圖中區(qū)分吞噬熒光微球的細胞與未吞噬熒光微球的細胞、活細胞與死細胞，橫坐標FITC與PE代表熒光信號強度，縱坐標Counts代表細胞數(shù)目。

在細胞吞噬率[6]計算公式中，P3代表吞噬熒光微球的細胞群體，P2代表未吞噬熒光微球的細胞群體，公式為

吞噬率=P3/(P2+P3)×100%

在細胞死亡率[6]的計算公式中，P′2代表死亡細胞數(shù)，P′3代表活細胞數(shù)，公式為：

死亡率=P′2/(P′2+P′3)×100%

1.2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測

將待檢測樣品用300目濾布過濾于共聚焦培養(yǎng)皿中，以氬-氪激光為激光光源，激發(fā)光為458 nm，在460～510 nm波長下觀察，物鏡鏡頭為65倍油浸鏡頭，圖像采集為512×512像素。為減少因熒光淬滅帶來的影響，在成像之前接受可見光和激光照射的時間盡可能短且相等。

2 結(jié)果與討論

2.1 體內(nèi)熒光標記及吞噬率檢測

利用FCM檢測相同濃度下體內(nèi)孵育熒光微球不同時間其吞噬率的變化情況，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)孵育30 min吞噬率為2.04%，60 min吞噬率為8.42%，120 min后吞噬率降到0.32%，吞噬率都相對較低。如圖1所示，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡檢測，發(fā)現(xiàn)雖光鏡圖像中存在細胞，但熒光圖像中并不存在熒光微球。因此，無法進行熒光微球標記的體內(nèi)檢測。

(a)熒光圖像；(b)光鏡圖像；(c)合成圖像

圖1 體內(nèi)吞噬熒光微球后的刺參體腔細胞激光掃描共聚焦成像圖

Fig.1Invivophagocytizing activities in coelomocytes on fluorescent microspheres detected by laser scanning confocal microscopy

2.2 體外熒光微球孵育比例對吞噬率的影響

熒光微球體外吞噬經(jīng)流式細胞儀檢測的吞噬率結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，無論設置體積比為多少，吞噬率明顯高于體內(nèi)吞噬，當熒光微球與體腔細胞體積比為1∶2 000時，吞噬率仍大于30%，并且隨著比例的增大，熒光含量也逐漸增加。體外吞噬實驗中，在熒光微球與體腔細胞體積比為1∶250與1∶500條件下孵育，其體腔細胞吞噬率均大于80%；但采用這兩個比例進行UVA照射刺參后靜置不同時間的體腔細胞吞噬率的檢測，可能會由于熒光微球含量過高，造成實驗結(jié)果差異不明顯。因此最終選擇1∶1 500進行刺參體腔細胞吞噬率的檢測。

圖2 熒光微球與刺參體腔細胞按不同體積比進行體外吞噬熒光微球的細胞吞噬率

Fig.2Invitrophagocytizing rates of coelomocytes with different volume ratio of fluorescent microspheres to coelomic cells

體腔細胞在刺參體內(nèi)能夠保持較高并且穩(wěn)定的吞噬活力，在正常條件，體內(nèi)的吞噬活性應高于體外吞噬，因此首先進行了體內(nèi)吞噬實驗，但是實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)吞噬的熒光含量遠遠低于體外吞噬組。研究表明，刺參機體免疫系統(tǒng)主要由細胞免疫和體液免疫構(gòu)成，同時由于棘皮動物的開放式循環(huán)系統(tǒng)，體液免疫反應成為棘皮動物抵抗外來物種侵略的主要防御反應[5]。在體內(nèi)吞噬實驗中，體液作為刺參的主要構(gòu)成[7]，在激光共聚焦檢測的明場下可以明顯發(fā)現(xiàn)凝集現(xiàn)象較為普遍，而凝集現(xiàn)象作為體液免疫的指標之一[8]，認為在體內(nèi)吞噬實驗中主要發(fā)生了體液免疫。因此，本研究的刺參體腔細胞吞噬率檢測，不宜采用體內(nèi)孵育熒光微球的方法。

2.3 UVA照射后刺參體腔細胞的體外吞噬率

經(jīng)UVA照射30 min后，靜置0～4 h，F(xiàn)CM檢測結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，吞噬率在1 h達到峰值，隨著靜置時間的延長，吞噬率逐漸降低。經(jīng)LSCM檢測結(jié)果(圖4)與之相同。

有研究表明，紫外線照射后會使免疫細胞及其功能發(fā)生根本改變，能夠顯著提高機體的特異性免疫功能和非特異性免疫功能[9]。由此可以推測，經(jīng)過一定的紫外線刺激后，刺參體腔細胞的吞噬能力被激活，在靜置1 h后達到峰值，隨后吞噬率不斷下降。由于吞噬率屬于海參的主要免疫指標之一，吞噬率的下降反映機體免疫能力下降[10]。推測吞噬率降低的原因可能有三方面：一是由于應激過度，造成吞噬能力下降；二是由于熒光微球?qū)儆谌槟z微粒，體腔細胞在識別并內(nèi)吞之后，由于無法對微球進行分解消化，隨著微球在體腔細胞內(nèi)不斷堆積，使得部分細胞未能及時消化，影響細胞的正常功能，導致部分細胞溶解，因此后期吞噬率下降可能是由于細胞數(shù)量減少[11]；三是由于細胞本身的胞吞胞吐作用，當部分微球被識別吞噬后，但由于最終微球無法被識別消化，使得微球被排除細胞外，導致其吞噬率降低[12]。

圖3 UVA照射后刺參靜置不同時間的體腔細胞體外吞噬率

Fig.3Invitrophagocytizing rates of coelomocytes after UVA-induced incubation for different duration

(a)熒光成像；(b)光鏡成像；(c)合成圖像

2.4 UVA照射后刺參體腔細胞的死亡率

對UVA照射30 min靜置不同時間的體腔細胞死亡率進行流式檢測，得到細胞死亡率流式散點圖和統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果，分別如圖5和圖6所示?？梢钥闯觯S著靜置時間的延長，刺參體腔細胞的死亡率呈不斷上升趨勢。有研究表明，美洲牡蠣在快速升溫脅迫下，細胞的死亡率顯著升高，可能是由于存活的細胞移除死亡細胞殘害的能力下降、吞噬能力下降、免疫能力降低，因此推測死亡率與吞噬率之間存在著一定的聯(lián)系，通過吞噬率的變化來判斷細胞的狀態(tài)，進而可以判斷刺參的鮮活程度。

3 結(jié) 論

刺參屬于開放式循環(huán)系統(tǒng)，本實驗中采用體內(nèi)檢測方法得到的吞噬率較低，因此采用體內(nèi)孵育方法檢測吞噬率不可行。而對于體外吞噬實驗，刺參體腔細胞的吞噬率會隨著熒光吞噬微球濃度的增大而升高，但過高的熒光微球濃度可能會造成吞噬率差異不顯著而影響實驗結(jié)果。經(jīng)驗證，選擇熒光微球與體腔細胞體積比為1∶1 500進行刺參體腔細胞吞噬率的測定。紫外線照射后，靜置不同時間(0～4 h)檢測刺參體腔細胞吞噬率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺參體腔細胞吞噬率在靜置1 h后達到峰值，隨后隨著靜置時間的延長，吞噬率不斷降低；此外，隨著靜置時間的延長，刺參體腔細胞的死亡率呈上升趨勢，表明紫外線照射會對刺參體腔細胞的免疫功能造成一定程度的損傷，通過檢測刺參細胞吞噬率可以判斷刺參的鮮活程度，從分子水平為研究刺參的免疫功能提供了科學依據(jù)。

圖5 UVA照射后靜置不同時間的刺參體腔細胞死亡率的流式散點圖

圖6 細胞死亡率的流式定量分析

Fig.6 Quantitative analysis of coelomocytes mortality detected by flow cytometric

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EffectofUVAonthephagocyticactivityofcoelmocyteinseacucumberStichopusjaponicus

TIANJingyu1,DINGYue1,ZHANGJing1,JIANGPengfei2,ZHOUDayong1,2,SONGLiang1,2

( 1.SchoolofFoodScienceandTechnology,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China；2.NationalEngineeringResearchCenterofSeafood,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

The coelmocyte phagocytic activity ofS.japonicuswas measured with flow cytometry (FCM) and laser scanning confocal microscope (LSCM). Phagocytizing rate (PR) of coelmocyte in suspensions with different fluorescent microsphere concentrations inS.japonicuswas testedinvivoandinvitro. Fluorescent microspheres could not be detected by LSCMinvivo, while the induction of phagocytosisinvitrovia injection was feasible. The results showed that the volume ratio of fluorescent microspheres to coelomic cells of 1∶1 500 was a suitable proportion for PR evaluation of coelmocyte inS.japonicus. According to FCM test, PR of coelmocyte reached to the maximum after 1 h and then gradually declined, which demonstrated consistent results with LSCM. Meanwhile, the mortality rate (MR) of coelomocyte inS.japonicuscontinued rising throughout the trial. It was concluded that UVA irradiation could cause a certain degree of damage to the immune function of coelmocyte, its MR was possibly associated with PR in this study. The freshness ofS.japonicascould be determined by detecting the change of PR fromS.japonicascoelmocyte.

Stichopusjaponicus; coelmocyte; phagocytic; UVA; mortality

田景玉,丁月,張晶,姜鵬飛,周大勇,宋亮.紫外線照射對刺參體腔細胞吞噬活性的影響[J].大連工業(yè)大學學報,2017,36(6):406-410.

TIAN Jingyu, DING Yue, ZHANG Jing, JIANG Pengfei, ZHOU Dayong, SONG Liang. Effect of UVA on the phagocytic activity of coelmocyte in sea cucumberStichopusjaponicus[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6): 406-410.

2017-03-15.

國家自然科學基金項目(31401562)；遼寧省農(nóng)業(yè)領域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2015002)；遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2014220).

田景玉(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：宋 亮(1980-)，男，講師.

TS254.9

A

1674-1404(2017)06-0406-05