□楊玉婷佟世生北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部

□秦譽(yù)北京維德維康生物技術(shù)有限公司

豬組織中賽庚啶間接競爭ELISA檢測方法研究

□楊玉婷佟世生北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部

□秦譽(yù)北京維德維康生物技術(shù)有限公司

酶聯(lián)免疫分析方法（Enzyme-LinkedImmuno-SorbentAssay,ELISA）具有特異性高、靈敏度高和成本低等特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的快速篩選。本研究在前期制備的賽庚啶人工抗原和單克隆抗體基礎(chǔ)上，建立了對(duì)豬組織中賽庚啶殘留的間接競爭ELISA檢測方法，為后續(xù)檢測產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

賽庚啶（Cyproheptadine，CLD）是一種具有抗膽堿能力和鎮(zhèn)靜作用，可用于治療各種過敏性疾病的抗組胺藥，也可用于改善患者食欲。近年來，人們發(fā)現(xiàn)在飼料產(chǎn)品中添加賽庚啶會(huì)增加動(dòng)物食欲，可達(dá)到增加養(yǎng)殖動(dòng)物體重的目的。但食用含賽庚啶殘留的動(dòng)物源性產(chǎn)品會(huì)對(duì)人體造成不利影響，濃度高時(shí)可直接引發(fā)昏厥、呼吸急促、全身無力等中毒癥狀，嚴(yán)重者則直接導(dǎo)致死亡。

農(nóng)業(yè)部1519號(hào)公告將賽庚啶列入《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》，然而飼料安全預(yù)警監(jiān)測結(jié)果表明，國內(nèi)仍然有一些飼料產(chǎn)品中添加了此類藥物，同時(shí)也有在豬肉組織中檢出賽庚啶殘留的報(bào)道。因此，加強(qiáng)對(duì)賽庚啶殘留的檢測迫在眉睫。目前，已報(bào)道的檢測方法有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，而且多為動(dòng)物尿液及飼料中賽庚啶殘留的檢測。因此，建立一種直接、方便、靈敏、高效、準(zhǔn)確的檢測方法十分必要。酶聯(lián)免疫分析方法具有特異性高、靈敏度高和成本低等特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的快速篩選。本研究在前期制備的賽庚啶人工抗原和單克隆抗體基礎(chǔ)上，建立了對(duì)豬組織中賽庚啶殘留的間接競爭ELISA檢測方法，為后續(xù)檢測產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法

材料與試劑

賽庚啶和可樂定標(biāo)準(zhǔn)品（98%中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（美國Jackson）、四甲基聯(lián)苯胺（華美生物工程公司）、小牛血清（杭州四季青）、牛血清白蛋白（美國SIGMA）、賽庚啶完全抗原和單克隆抗體（北京維德維康生物技術(shù)有限公司研發(fā)中心制備保存）；豬肉、豬肝等樣本（超市）。甲醇、二氯甲烷、碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、乙腈、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純級(jí)別（國藥集團(tuán)）。

儀器與設(shè)備

MK-3酶聯(lián)免疫測定儀（Thermo）；QL-901渦動(dòng)儀(海門其林貝爾）；TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)板（廈門云鵬）；氮吹儀（美國organomation）；移液器（Thermo)；精密電子天平（梅特勒-托利多）。

方法

1ELISA檢測條件的優(yōu)化

1.1 最適包被濃度與最適單抗?jié)舛鹊膬?yōu)化

將包被抗原以1:2000、1:10000、1:50000、1:250000稀釋包板，每個(gè)稀釋度包兩條作為平行。比較各組的最大吸光度和抑制率，確定最適包被濃度。

單 抗 設(shè) 定 1:2000、1:10000、1:50000、1:250000共4組稀釋度。比較各組最大吸光度和抑制率，確定最適單抗稀釋倍數(shù)。

1.2 包被液pH的優(yōu)化

分別用3種不同pH值的包被液將賽庚啶包被原稀釋至最適工作濃度。比較各組最大吸光值、靈敏度點(diǎn)抑制、IC50值和曲線的線性，確定最適包被液pH。

1.3 封閉液的優(yōu)化

分別用4種不同配方的封閉液封閉，37℃溫育2h，其余變量相同。比較各組最大吸光值、靈敏度點(diǎn)抑制、IC50值和曲線的線性，確定最適封閉液配方。

1.4 包被條件的優(yōu)化

用包被液將賽庚啶抗原稀釋至最適工作濃度，每孔100μL，分成3組。第一組：37℃溫育2h；第二組：室溫放置2h；第三組：4℃過夜。比較各組最大吸光值、靈敏度點(diǎn)抑制、IC50值和曲線的線性，確定最適包被條件。

1.5 樣品溶液與單抗溶液體積比例的優(yōu)化

加入樣品溶液和單抗溶液比例分別 為：30μL:70μL、40μL:60μL、5 0 μ L:5 0 μ L 、 6 0 μ L:4 0 μ L 、70μL:30μL和80μL:20μL。比較最大吸光度和抑制率，確定最適樣品與單抗體積比例。

1.6 試劑盒特異性的確定

選擇對(duì)賽庚啶類似物可樂定（Apraclonidine）、 羅 米 非啶（Romifidine）、 替 扎 尼 定（Tizanidine）、賽拉嗪（Xylazine）、克倫特羅（Clenbuterol）、萊克多巴胺（Ractopamine）和沙丁胺醇（Salbutamol）進(jìn)行測定，得到各類似物在標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的OD值，應(yīng)用RIDAWIN軟件分析，得出類似物的IC50，從而計(jì)算其交叉反應(yīng)率(CR)：

交叉反應(yīng)率(CR)=IC50(CLD)/IC50(類似物)×100%

1.7 試劑盒精密度的測定

用零標(biāo)準(zhǔn)的OD值來測定ELISA方法的可重復(fù)性，分別測定板內(nèi)差、批內(nèi)差和批間差。

2樣本的添加回收試驗(yàn)

樣本的前處理方法如下：

豬肉：準(zhǔn)確稱取2±0.01g均質(zhì)后的新鮮組織樣品于50mL離心管中；加入1mL0.1M鹽酸，再加入1mL無水甲醇，室溫（25±2℃）下，充分渦動(dòng)3min；4000r以上，離心10min；取100μL上清液于新的離心管中，再加入400μL0.02MPBS，渦動(dòng)30s混勻，然后進(jìn)行檢測。

豬肝：準(zhǔn)確稱取2±0.01g均質(zhì)后的新鮮組織樣品于50mL離心管中；加入0.5mL0.1M鹽酸，再加入0.5mL1MEDTA-2Na溶液，最后加入1mL無水甲醇，室溫（25±2℃）下，充分渦動(dòng)3min；4000r以上，離心10min；取100μL上清液于新的離心管中，再加入 400μL0.02MPBS，渦動(dòng) 30s混勻，然后進(jìn)行檢測。

每個(gè)添加濃度做兩份樣品，每份樣品的提取液做兩個(gè)重復(fù)。各樣品經(jīng)上述方法處理后，用優(yōu)化的ELISA方法檢測，測定OD450值，用RIDAWIN軟件分析數(shù)據(jù)，得出賽庚啶的含量，并根據(jù)下式計(jì)算添加回收率。

添加回收率（%）＝實(shí)測值（ng/mL）/添加值（ng/mL）×100%

結(jié)果與分析

ELISA檢測條件的優(yōu)化

1最適包被濃度與最適單抗的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選擇最大吸光值在2.0左右，靈敏度抑制率在80%以下為合適的抗原抗體稀釋倍數(shù)。最適包被濃度與最適單抗的優(yōu)化結(jié)果見表1、表2，由表可知，隨著包被原濃度和抗體濃度的降低，最大吸光值也在降低，當(dāng)抗原做1:50000稀釋，抗體做1:10000稀釋時(shí)，靈敏點(diǎn)抑制率為79.3%，最大吸光值和靈敏度抑制均符合要求，故確定其為最適稀釋度。

2包被液的優(yōu)化

結(jié)果見表3，由表3可知，比較3種緩沖液的最大吸光值、靈敏度點(diǎn)的抑制率、IC50及曲線線性，選擇0.05mol/L、pH=9.6的碳酸鹽緩沖液做為包被液。

3封閉液的確定

分析較幾種常用的封閉液，結(jié)果見表4。選擇最大吸光值較大，IC50較低，曲線線性大于99%，靈敏度點(diǎn)抑制在70%～80%之間的封閉液，最終選擇5%的脫脂奶粉做為封閉液。

表1 不同濃度抗原抗體反應(yīng)最大吸光度

表2 不同濃度抗原抗體反應(yīng)靈敏度點(diǎn)抑制率

表3 包被液的確定試驗(yàn)

表4 封閉液的確定試驗(yàn)

表5 包被條件的確定試驗(yàn)

4包被條件的優(yōu)化分析

包被條件的優(yōu)化見表5，實(shí)驗(yàn)選擇最大吸光值較大，靈敏度抑制率為70%～80%，IC50在0.1ng/mL左 右，線性相關(guān)系數(shù)在99%以上的數(shù)據(jù)，由表確定4℃反應(yīng)16h作為試劑盒的最佳包被條件。

5樣品溶液與單抗溶液體積比例的確定

結(jié)果見表6，樣品溶液與單抗溶液體積比為40:60時(shí)，靈敏度抑制率在70%～80%之間，最大吸光度值在2.0左右，線性相關(guān)系數(shù)為99.45%，因此確定樣品溶液與單抗溶液體積比為40:60。

6特異性的測定

結(jié)果見表7，該單抗與賽庚啶、可樂定、羅米非啶、替扎尼定、賽拉嗪、克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率分別為100.0%、0.1%、0.05%，其余均小于0.05%，表明對(duì)賽庚啶靈敏。

7精密度的測定

精密度通常用標(biāo)準(zhǔn)樣品的批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）或者變異系數(shù)（CV）來進(jìn)行考察，一般要求CV應(yīng)小于10%。精密度的測定見表8，由表8可以看出3批酶標(biāo)板的板內(nèi)變異系數(shù)小于5%，板間變異系數(shù)小于10%，符合要求。

表6 樣品溶液與單抗溶液體積比的確定試驗(yàn)

表7 交叉反應(yīng)

表8 變異系數(shù)

表9 豬肉中賽庚啶的回收率

表10 豬肝中賽庚啶的回收率

樣本的添加回收率檢測

取空白樣本各5份，根據(jù)檢測限要求對(duì)樣品進(jìn)行添加，每種樣本、每個(gè)濃度各做2個(gè)平行，按提取方法進(jìn)行提取稀釋，所得樣本溶液進(jìn)行ELISA檢測，計(jì)算添加回收率。表9、表10表明兩種組織的添加回收率均在70%～128%之間。

結(jié)語

本研究在已制備的賽庚啶抗原和單克隆抗體的基礎(chǔ)上，對(duì)抗原濃度、抗體濃度、包被液配方、封閉液配方、包被條件等進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，研制了檢測豬肉組織中賽庚啶的ELISA方法，該方法IC50變動(dòng)范圍在0.1～0.15ng/mL之間，豬組織中檢測限為0.5μg/kg，添加回收率70.0%～128.0%之間（添加濃度為0.5μg/kg和1.0μg/kg），樣本重復(fù)檢測的變異系數(shù)在2.6%～12.1%之間，具有良好的特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，表明本ELISA方法的穩(wěn)定性符合檢測要求，能夠滿足對(duì)豬組織賽庚啶檢測的需要。