張桂芬， 王玉生， 冼曉青，2， 萬(wàn)方浩，2， 邵嘉文

入侵害蟲(chóng)梣粉虱的種特異性SS-COⅠ檢測(cè)技術(shù)

張桂芬1，2?， 王玉生1， 冼曉青1，2， 萬(wàn)方浩1，2， 邵嘉文3

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2農(nóng)業(yè)部外來(lái)入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京100193；3青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東青島266109

【目的】梣粉虱是新近入侵中國(guó)大陸的一種危險(xiǎn)性果樹(shù)和園林植物害蟲(chóng)，針對(duì)其體型微小，與近緣種粉虱形態(tài)相仿，很難快速準(zhǔn)確區(qū)分的問(wèn)題，以田間常見(jiàn)的11種/隱種粉虱為參考，采用基于mtDNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunitⅠ，mtDNA COⅠ)基因的物種特異性(species-specific COⅠ，SS-COⅠ)PCR法，研究梣粉虱快速分子檢測(cè)鑒定技術(shù)?！痉椒ā坷胢tDNA COⅠ基因通用型引物對(duì)LCO-1490/HCO-2198獲得梣粉虱和其他常見(jiàn)粉虱的COⅠ基因序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)梣粉虱特異性SS-COⅠ引物1對(duì)(SPZWCF1/SPZWCR1)，之后確定其對(duì)目的片段的擴(kuò)增長(zhǎng)度，并對(duì)該引物對(duì)的物種特異性和檢測(cè)靈敏性進(jìn)行檢驗(yàn)?！窘Y(jié)果】引物對(duì)SPZWCF1/SPZWCR1擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為426 bp。物種特異性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該對(duì)引物只對(duì)梣粉虱的mtDNA COⅠ基因具有擴(kuò)增效果，對(duì)我國(guó)常見(jiàn)的其他種類(lèi)的粉虱包括5種煙粉虱隱種(AsiaⅠ、AsiaⅡ1、AsiaⅡ3、MED、MEAM1隱種)以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、雙鉤巢粉虱和溫室粉虱等不具有交叉反應(yīng)和擴(kuò)增能力。靈敏性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該對(duì)引物不僅對(duì)不同性別、不同采集地的成蟲(chóng)具有良好的擴(kuò)增效能，對(duì)2～4齡若蟲(chóng)以及單粒卵和初孵若蟲(chóng)亦具有同樣的擴(kuò)增效力，其最低檢測(cè)閾值為75.1 pg·μL-1(相當(dāng)于1/10240頭雌性成蟲(chóng))?！窘Y(jié)論】該技術(shù)體系可用于梣粉虱的快速準(zhǔn)確鑒定及其檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，對(duì)有效阻截其進(jìn)一步傳播擴(kuò)散具有重要作用。

梣粉虱；種特異性引物；檢測(cè)閾值；快速鑒定；分子檢測(cè)；監(jiān)測(cè)

梣粉虱Siphoninus phillyreae(Haliday)，屬半翅目粉虱科虹管粉虱屬，是一種世界性檢疫性害蟲(chóng)(Martin，1987)，2002年我國(guó)臺(tái)灣將其列為重要的防疫檢疫性害蟲(chóng)(柯俊成和許洞慶，2004)，2006年中國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將其列為需要關(guān)注的進(jìn)境檢疫性有害生物(詳見(jiàn)國(guó)質(zhì)檢動(dòng)[2006]31號(hào)文件)。梣粉虱為多食性害蟲(chóng)，寄主植物多達(dá)11科28屬60多種/變種，且以果樹(shù)和園林植物為主，如薔薇科、石榴科、蕓香科、鼠李科、豆科、夾竹桃科、紫葳科、木蘭科、木犀科、茜草科及千屈菜科等，尤其嗜好薔薇科和木犀科的植物(Dooley，2009；Stocks＆Hodges，2000)。其中，受害較為嚴(yán)重的果樹(shù)植物有薔薇科的桃、杏、蘋(píng)果、梨、山楂、木瓜，石榴科的石榴，以及蕓香科的金橘、橘子、橙子、檸檬等；園林植物受害較重的有薔薇科的櫻花、海棠、榆葉梅，木犀科的梣樹(shù)、女貞、丁香，紫葳科的楸樹(shù)，千屈菜科的紫薇，茜草科的風(fēng)箱樹(shù)，以及木蘭科的郁金香樹(shù)等(Byrne，1991； Martin et al.，2000)。 在非洲北部、地中海地區(qū)以及南美洲和歐洲等地區(qū)，梣粉虱還可以危害重要的油料兼果用植物——油橄欖 Olea europaea L.(Gómez-del-Campo et al.，2010；Nguyen＆Hamon，2014)。梣粉虱原產(chǎn)于歐洲、地中海和非洲北部地區(qū)，寄主范圍廣，適生能力強(qiáng)(Paula et al.，1995)，極易隨植物苗木的貿(mào)易活動(dòng)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播擴(kuò)散，一旦在新入侵區(qū)域成功定殖，就會(huì)導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)美元的經(jīng)濟(jì)損失(Tom et al.，1992)。目前，梣粉虱已擴(kuò)散至北美洲的美國(guó)、墨西哥，南美洲的秘魯、委內(nèi)瑞拉，以及亞洲的以色列、敘利亞、印度、巴基斯坦、日本等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)(冼曉青等，2015； CABI，2014)。

粉虱類(lèi)害蟲(chóng)是我國(guó)入侵事件發(fā)生最為頻繁的外來(lái)入侵生物類(lèi)群之一，自2003年發(fā)現(xiàn)煙粉虱MED隱種Bemisia tabaci(Gennadius)(Q型)入侵以來(lái)(褚棟等，2005)，已先后有螺旋粉虱Aleurodicus disperses(Russell)(虞國(guó)躍等，2007)、雙鉤巢粉虱Paraleyrodes pseudonaranjae Martin(虞國(guó)躍等，2010)、小巢粉虱Paraleyrodes minei Iaccarino(虞國(guó)躍等，2014；朱文靜和符悅冠，2013)、甘藍(lán)粉虱Aleyrodes proletella(L.)(張桂芬等，2014)等多種粉虱類(lèi)害蟲(chóng)入侵中國(guó)大陸，同時(shí)，園林和果樹(shù)重大害蟲(chóng)梣粉虱也不請(qǐng)自來(lái)(冼曉青等，2015)，對(duì)我國(guó)果樹(shù)以及園林綠化產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。通常，粉虱類(lèi)害蟲(chóng)的鑒定主要依據(jù)擬蛹的外部形態(tài)特征，或雄性成蟲(chóng)的外生殖器特征，如雙鉤巢粉虱(虞國(guó)躍等，2010；Martin，2001)。 然而，梣粉虱個(gè)體微小，成蟲(chóng)體長(zhǎng)0.80～1.10 mm，含翅體長(zhǎng)約為1.40 mm(Stocks＆Hodges，2000)，且與其他粉虱類(lèi)昆蟲(chóng)間的形態(tài)非常相似。因此，未經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練的非粉虱分類(lèi)人員很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。為此，本研究擬以線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ (mitochondrial DNA cytochrome c oxidase submitⅠ， mtDNA COⅠ)基因?yàn)榘袠?biāo)，建立靶向梣粉虱的種特異性(speciesspecific COⅠ，SS-COⅠ)PCR檢測(cè)技術(shù)體系，以期為有效阻截梣粉虱的進(jìn)一步傳播擴(kuò)散，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其種群擴(kuò)張趨勢(shì)及對(duì)其有效防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

梣粉虱采自上海閔行區(qū)和江蘇南京玄武區(qū)，寄主植物均為石榴樹(shù)。本研究涉及到的其他種/隱種粉虱共計(jì)11種:煙粉虱MED隱種(Q型)、MEAM1隱種(B型)以及溫室粉虱Trialeurodes vaporariorum(Westwood)均飼養(yǎng)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室，寄主植物分別為番茄和棉花；煙粉虱AsiaⅠ隱種和AsiaⅡ1隱種(ZHJ-2型)由浙江大學(xué)贈(zèng)送，AsiaⅡ3隱種(ZHJ-1型)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送；桑粉虱Bemisia myricae Kuwana和柑橘粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)均采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)花園，寄主植物分別為紫椹果桑樹(shù)和月季；螺旋粉虱和雙鉤巢粉虱均采自海南省?？谑?，寄主植物分別為番石榴和小葉榕；黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus(Quaintance)采自湖北省荊州市，寄主植物為柑橘。

1.2 DNA提取

以梣粉虱以及其他11種/隱種粉虱為靶標(biāo)，參照李小鳳等(2014)的方法，提取單頭粉虱總DNA。提取的DNA以40μL超純水復(fù)溶，以超微量分光光度計(jì)(NanoPhotometerTM P330， Implen， Munich，Germany)測(cè)定濃度，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 粉虱類(lèi)昆蟲(chóng)COⅠ基因序列的PCR擴(kuò)增

以梣粉虱以及其他11種/隱種粉虱DNA為模板，以mtDNA COⅠ基因的通用型引物對(duì)LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′) 進(jìn)行擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度約為700 bp(Folmer et al.，1994)。PCR 反應(yīng)體系為30 μL，其中，10× Buffer(含Mg2＋)2.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.5 μL，上游引物和下游引物(5 pmol·L-1)分別為0.5μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1，北京全式金生物技術(shù)有限公司)0.4μL，模板DNA 1.0μL，以24.6μL超純水補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min；35個(gè)循環(huán):94℃40 s，52℃ 40 s，72℃ 40 s；最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀(ABI-9700)上運(yùn)行。取4μL PCR產(chǎn)物在含有GoldView的1.0%(w/v)瓊脂糖凝膠上以90 V電泳(Bio-Rad Power-Pac Basic)分離45 min后，檢測(cè)電泳結(jié)果。

1.4 梣粉虱的種特異性SS-COⅠ引物對(duì)的設(shè)計(jì)

將1.3中檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司)，然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果以軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)1對(duì)靶向梣粉虱COⅠ基因的種特異性SS-COⅠ引物對(duì)，并命名為SPZWCF1/SPZWCR1。上游引物SPZWCF1的堿基序列為5′-AAGAGAATTAAGTAATAGAGGG-3′， 下 游 引 物SPZWCR1的堿基序列為 5′-GATTCAAATCTTATACCCAATAGT-3′；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 梣粉虱SS-COⅠ引物對(duì)的特異性檢驗(yàn)

分別以單頭不同隱種的煙粉虱(包括AsiaⅠ、AsiaⅡ1、AsiaⅡ3、MED 和 MEAM1隱種)以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、雙鉤巢粉虱和溫室粉虱的DNA為模板，以梣粉虱為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證梣粉虱特異片段擴(kuò)增引物對(duì)SPZWCF1/SPZWCR1的物種特異性。反應(yīng)體系為25μL，其中，10× Buffer 2.5μL，dNTPs 0.2μL，上游引物和下游引物分別為0.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 1.0μL，以20.7μL超純水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min；30個(gè)循環(huán):94℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 30 s；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法同1.3。每種/隱種粉虱各檢測(cè)8頭。

1.6 梣粉虱SS-COⅠ引物對(duì)的靈敏性檢測(cè)

以不同性別(單頭雌性成蟲(chóng)和雄性成蟲(chóng))、不同蟲(chóng)態(tài)(單粒卵，單頭1、2、3、4齡若蟲(chóng)和擬蛹)和不同采集地(上海和江蘇)的梣粉虱DNA，以及2倍遞減稀釋(19.2×103、9.6×103、4.8×103、2.4×103、1.2×103、0.6×103、0.3×103、150.2、75.1、37.55、18.78、9.39、4.69、2.35 和 1.17 pg·μL-1，相當(dāng)于 1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560、1/5120、1/10240、 1/20480、 1/40960、 1/81920、 1/163840、1/327680和1/655360頭)的單頭成蟲(chóng)(雌性)DNA為模板，進(jìn)行靈敏性檢測(cè)。每個(gè)性別、每個(gè)蟲(chóng)態(tài)、每個(gè)地區(qū)以及每個(gè)濃度各檢測(cè)8頭。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉虱類(lèi)害蟲(chóng)COⅠ基因堿基序列擴(kuò)增及種特異性標(biāo)記分析

電泳檢測(cè)結(jié)果表明，12種/隱種粉虱都能擴(kuò)增出一條清晰明亮的目的片段(圖1)。將電泳檢驗(yàn)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果表明該片段的長(zhǎng)度大約為710 bp(梣粉虱GenBank登錄號(hào)為HFS.2012.201199.5.1)。根據(jù)堿基序列測(cè)定結(jié)果設(shè)計(jì)梣粉虱特異性 SS-COⅠ引物1對(duì)(SPZWCF1/SPZWCR1)，其擴(kuò)增片段的大小為426 bp。

2.2 梣粉虱SS-COⅠ引物的種特異性驗(yàn)證

電泳檢測(cè)結(jié)果表明，種特異性引物SPZWCF1/SPZWCR1只對(duì)梣粉虱具有擴(kuò)增效果，對(duì)其他田間常見(jiàn)的11種/隱種粉虱不具有擴(kuò)增能力，說(shuō)明該對(duì)引物為梣粉虱的特異性引物(圖2)。

2.3 種特異性SS-COⅠ引物對(duì)不同性別、蟲(chóng)態(tài)和地域梣粉虱的擴(kuò)增效果

以不同性別、蟲(chóng)態(tài)以及采自2個(gè)地域的梣粉虱DNA為模板，采用種特異性引物對(duì) SPZWCF1/SPZWCR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測(cè)結(jié)果表明，不同性別、不同蟲(chóng)態(tài)以及2個(gè)地域的梣粉虱均能擴(kuò)增出426 bp的特異性片段(圖3)。

圖1 COⅠ基因通用型引物L(fēng)CO1490/HCO2198對(duì)梣粉虱及其他11種/隱種田間常見(jiàn)粉虱DNA的擴(kuò)增效果Fig.1 PCR amplification of mitochondrial DNA of S.phillyreae and 11 other whitefly species or cryptic species common in the field using a pair of universal primer pair LCO1490/HCO2198 target to COⅠgene

圖2 種特異性SS-COⅠ引物SPZWCF1/SPZWCR1對(duì)梣粉虱以及其他11種/隱種田間常見(jiàn)粉虱類(lèi)害蟲(chóng)的擴(kuò)增效果Fig.2 Amplification pattern of mitochondrial DNA of S.phillyreae and 11 other whitefly species or cryptic species using the species-specific SS-COⅠprimer pair SPZWCF1/SPZWCR1

2.4 梣粉虱特異性SS-COⅠ引物的檢測(cè)閾值

將單頭梣粉虱成蟲(chóng)(雌性)的DNA模板以2倍遞減稀釋?zhuān)瑱z測(cè)結(jié)果顯示，所有的個(gè)體都可以擴(kuò)增出特異性的目的條帶。當(dāng)濃度為2.35～37.55 pg·μL-1時(shí)，依然有20%～50%的個(gè)體能擴(kuò)增出較弱的目的片段(圖4)，表明該引物對(duì)的靈敏性較高，檢測(cè)閾值大約為75.1 pg·μL-1(即1/10240頭成蟲(chóng))。

3 討論

我國(guó)是遭受外來(lái)入侵生物危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一。梣粉虱于2002年首次在中國(guó)臺(tái)灣發(fā)生危害(柯俊成和許洞慶，2004)；2010年在上海被發(fā)現(xiàn)為害薔薇科的梨樹(shù)，2年后又被發(fā)現(xiàn)其為害石榴科的石榴樹(shù)、木犀科的桂花樹(shù)等(史蘋(píng)香，2012；冼曉青等，2015)；2015年筆者又在江蘇省發(fā)現(xiàn)其蹤跡。目前，梣粉虱只在我國(guó)局部區(qū)域發(fā)生危害，一旦進(jìn)一步傳播擴(kuò)散，必將對(duì)我國(guó)的園林綠化行業(yè)、水果產(chǎn)業(yè)以及飲料行業(yè)等造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

圖3 種特異性SS-COⅠ引物SPZWCF1/SPZWCR1對(duì)不同蟲(chóng)態(tài)、不同性別和2個(gè)地域梣粉虱的PCR擴(kuò)增效果Fig.3 Amplification pattern of mitochondrial DNA from different developmental stages，sexes and adults collected in two locations of S.phillyreae using the SS-COⅠprimer pair SPZWCF1/SPZWCR1

圖4 種特異性SS-COⅠ引物SPZWCF1/SPZWCR1對(duì)梣粉虱線粒體DNA的檢測(cè)閾值Fig.4 Detection threshold for diluted mitochondrial DNA samples of female adults of S.phillyreae using SS-COⅠprimer pair SPZWCF1/SPZWCR1

本研究采用基于mtDNA COⅠ基因的物種特異性SS-COⅠ標(biāo)記方法，研發(fā)出了靶向梣粉虱的特異性引物對(duì)SPZWCF1/SPZWCR1及其快速檢測(cè)技術(shù)。該對(duì)引物只對(duì)梣粉虱的目的基因片段具有擴(kuò)增能力，對(duì)田間常見(jiàn)的其他11種/隱種粉虱(包括煙粉虱AsiaⅠ隱種、AsiaⅡ1隱種、AsiaⅡ3隱種、MED隱種和MEAM1隱種，以及桑粉虱、螺旋粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、雙鉤巢粉虱和溫室粉虱)不具有擴(kuò)增效果。同時(shí)，該技術(shù)體系具有比較高的靈敏度，不僅對(duì)梣粉虱成蟲(chóng)(包括雌性和雄性)、2～4齡若蟲(chóng)和擬蛹具有好的擴(kuò)增效果，對(duì)單粒卵和初孵若蟲(chóng)亦具有同樣的擴(kuò)增能力，其檢測(cè)閾值約為75.1 pg·μL-1，相當(dāng)于1/10240頭雌性成蟲(chóng)。進(jìn)一步的數(shù)據(jù)庫(kù)同源性比對(duì)分析結(jié)果表明，沒(méi)有任何一種近緣種粉虱或其他昆蟲(chóng)的DNA序列與梣粉虱特有的426 bp片段完全一致(堿基序列一致性≤82%)，表明該檢測(cè)技術(shù)體系可以用于口岸園林植物及果樹(shù)苗木等國(guó)際貿(mào)易活動(dòng)的檢驗(yàn)檢疫，以及國(guó)內(nèi)地區(qū)間種苗的調(diào)運(yùn)檢疫及其種群擴(kuò)張趨勢(shì)的監(jiān)測(cè)。

基于mtDNA COⅠ基因的序列測(cè)定以及據(jù)此發(fā)展起來(lái)的物種特異性SS-COⅠ標(biāo)記技術(shù)，是目前用于鑒定外來(lái)入侵粉虱類(lèi)害蟲(chóng)的最為常用的方法之一。如羅晨等(2002)和Qiu et al.(2009)以COⅠ基因3′端為靶標(biāo)，采用DNA序列測(cè)定法成功鑒定了B型(MEAM1隱種)、Q型(MED隱種)和 Cv型(AsiaⅡ 7隱種)煙粉虱；Ovalle et al.(2014)以COⅠ基因5′端序列為靶標(biāo)，鑒定了在哥倫比亞發(fā)生的9種重要的粉虱科害蟲(chóng)[包括螺旋粉虱、Aleuronudus melzeri Bondar、絲 絨 粉 虱 Aleurothrixus floccosus Maskell、Aleurotrachelus socialis Bondar、 辣 椒 粉 虱Aleurotrachelus trachoides Back、煙粉虱、Lecanoideus floccissimus Martin、溫室粉虱和木瓜粉虱Trialeurodes variabilis(Quaintance)等]，并表明研究結(jié)果對(duì)上述粉虱類(lèi)害蟲(chóng)捕食性天敵的保護(hù)利用意義非凡；李小鳳等(2014)則分別以 COⅠ基因5′端和 3′端為靶標(biāo)，對(duì)包括煙粉虱MED隱種、雙鉤巢粉虱、螺旋粉虱等入侵種在內(nèi)的我國(guó)田間常見(jiàn)的16種粉虱進(jìn)行了分子鑒定，并指出5′端序列更適用于基于DNA條形碼技術(shù)的物種鑒定；陳苗苗等(2015)和張桂芬等(2013)基于COⅠ基因序列，采用SS-COⅠ標(biāo)記技術(shù)，分別建立了入侵種甘藍(lán)粉虱和雙鉤巢粉虱的快速檢測(cè)技術(shù)體系。

準(zhǔn)確、快速、高效的物種鑒定方法對(duì)實(shí)時(shí)掌控梣粉虱在我國(guó)的擴(kuò)張動(dòng)態(tài)，制定行之有效的靶向性防控策略具有重要指導(dǎo)意義。本研究研發(fā)建立的梣粉虱特異性SS-COⅠ引物對(duì)SPZWCF1/SPZWCR1及其快速檢測(cè)技術(shù)體系，彌補(bǔ)了基于外部形態(tài)特征鑒定法的不足，不僅準(zhǔn)確性高、靈敏度強(qiáng)，而且操作簡(jiǎn)便、快捷有效，在梣粉虱種群擴(kuò)張趨勢(shì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和有效阻截與防控中將發(fā)揮重要作用。然而需要注意的是，粉虱類(lèi)害蟲(chóng)種類(lèi)比較多，其中有些常見(jiàn)種類(lèi)在本研究中并未涉及，如分布于歐洲可對(duì)柑橘造成危害的Siphoninus immaculatus(Heeger)。因此，該對(duì)SS-PCR引物的特異性還需要進(jìn)一步考證。

致謝:浙江大學(xué)昆蟲(chóng)科學(xué)研究所劉銀泉教授提供煙粉虱AsiaⅠ隱種和AsiaⅡ1隱種標(biāo)本，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院邱寶利教授提供煙粉虱AsiaⅡ3隱種標(biāo)本，特表感謝。

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Species-specific COⅠprimers for rapid identification of an exotic whitefly，Siphoninus phillyreae(Haliday)

ZHANG Guifen1，2?， WANG Yusheng1， XIAN Xiaoqing1，2， WAN Fanghao1，2， SHAO Jiawen3

1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China；2Center for Management of Invasive Alien Species， Ministry of Agriculture， Beijing 100193，China；3College of Agronomy and Plant Protection， Qingdao Agricultural University， Qingdao， Shandong 266109， China

【Aim】 The ash whitefly Siphoninus phillyreae(Haliday)，is one of the most important pests infesting fruit trees and ornamental plants worldwide.It is a recent invader to China.Morphological identification of this whitefly is complicated by its small size， high degree of similarity to related whitefly species and polymorphism.In the present study， a species-specific identification technique based on mitochondrial DNA cytochrome Coxidase subunitⅠ (mtDNA COⅠ)gene sequence(namely SS-COⅠ marker)was developed for the rapid identification of S.phillyreae.【Method】 The fragments of mtDNA COⅠ gene of S.phillyreae and 11 other related whitefly species or cryptic species were amplified and sequenced using COⅠgene universal primers LCO-1490/HCO-2198.One pair of species-specific COⅠ (SS-COⅠ)primers， SPZWCF1 and SPZWCR1 was designed.The length of target fragment amplified by this SS-COⅠprimer pair was identified and its specificity and sensitivity tested using various life stages and sexes of 11 whitefly species collected from two geographic locations.【Result】 The primer pair amplified a 426 bp long fragment.The primer pair proved species-specific as it gave no cross-reactions against any of the 11 other whitefly species tested:five cryptic species of Bemisia tabaci(Gennadius)(AsiaⅠ，AsiaⅡ1， AsiaⅡ3， MED and MEAM1)， Bemisia myricae Kuwana， Aleurodicus disperses(Russell)，Aleurocanthus spiniferus Quaintance，Dialeurodes citri(Ashmead)，Paraleyrodes pseudonaranjae Martin and Trialeurodes vap-orariorum(Westwood).All S.phillyreae specimens were successfully identified.Sensitivity test demonstrated that the successful amplification could be obtained with 75.1 pg·μL-1template DNA，equal to 1/10240 of a whole female S.phillyreae adult.【Conclusion】 The SS-COⅠ method developed here provides a rapid， simple and reliable molecular technique for the identification and monitoring of S.phillyreae，which would be benefit in intercepting and blocking the further spreading of this new invasive whitefly species.

Siphoninus phillyreae； SS-COⅠ primers； detection threshold； rapid identification； molecular detection； monitoring

10.3969/j.issn.2095-1787.2017.04.003

2017-07-11 接受日期(Accepted):2017-09-11

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017YFC1200600、2016YFC1200600)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303019、201103026)；農(nóng)業(yè)部“一帶一路”948項(xiàng)目(2016-X48)

張桂芬，女，研究員，博士。研究方向:入侵生物預(yù)防與控制

?通信作者(Author for correspondence)，E-mail:guifenzhang3＠163.com

(責(zé)任編輯:楊郁霞)