梁晉剛， 孟 芳， 張正光?

轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆對(duì)根際土壤主要有機(jī)元素和酶活性的影響

梁晉剛1，2， 孟 芳2， 張正光2?

1農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京100122；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京210095

【目的】為了評(píng)估轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆ZD91對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性，開展了其對(duì)土壤主要有機(jī)元素和酶活性影響的實(shí)驗(yàn)?！痉椒ā窟B續(xù)2年，在大豆苗期、花期、鼓粒期和成熟期，采用抖落法采集根際土壤樣品，通過(guò)室內(nèi)測(cè)定，分析了轉(zhuǎn)基因大豆ZD91對(duì)根際土壤含水量、pH、主要有機(jī)元素和酶活性的影響?！窘Y(jié)果】轉(zhuǎn)基因大豆ZD91較之對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)根際土壤含水量、pH、主要有機(jī)元素和酶活性無(wú)顯著影響，但同一種酶活在不同年份和不同生育期存在顯著差異。【結(jié)論】轉(zhuǎn)基因大豆ZD91對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)具有安全性。

轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆；ZD91；土壤有機(jī)元素；土壤酶活性

隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植面積的不斷增大，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性日益受到人們的廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)基因作物的外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)植株殘?bào)w或根系分泌物等進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，土壤的特異生物功能類群以及土壤生物多樣性都可能因此而發(fā)生改變。此外，外源基因的導(dǎo)入可能會(huì)造成轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)藝性狀等方面與其對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物之間存在差異，這些差異可能會(huì)影響植物組織在土壤中的降解速率，進(jìn)而影響土壤生物、生態(tài)過(guò)程和肥力水平(陳振華等，2008；李孝剛，2011)。因此，研究轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響是其環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要內(nèi)容，對(duì)保證轉(zhuǎn)基因作物安全應(yīng)用具有重要意義。

目前，評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的安全性，主要研究其根際土壤有機(jī)元素、土壤酶活性和土壤微生物多樣性等的變化(王兵等，2013)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因作物的種植可能會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)元素及土壤酶活性發(fā)生變化(Chen et al.，2011；Flie?bach et al.，2012； Liu et al.，2010； Lupwayi et al.，2007； Motavalli et al.，2004； Sun et al.，2007)。

大豆籽粒中蛋白質(zhì)含量豐富，可較好地滿足人類和動(dòng)物的需求，然而其含硫氨基酸尤其是蛋氨酸含量偏低，限制了大豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。胱硫醚-γ-合酶是控制蛋氨酸合成的關(guān)鍵酶，Song et al.(2013)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)胱硫醚-γ-合酶基因的高蛋氨酸大豆。本課題組前期的研究表明，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆ZD91較之對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因大豆ZD對(duì)根際土壤中細(xì)菌、叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)、土壤微生物群落碳代謝功能均無(wú)顯著影響(Liang et al.，2014，2015，2016)。 基于此，本文進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因大豆ZD91對(duì)其根際土壤主要有機(jī)元素和酶活性的影響，以期為評(píng)估該轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性提供更充分的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及栽培方法

轉(zhuǎn)胱硫醚-γ-合酶基因高蛋氨酸大豆ZD91及其受體自貢冬豆ZD，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。從2009年開始，大豆已連續(xù)多年種植于四川省南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地(30°48′N、106°04′E)，本次實(shí)驗(yàn)的供試材料采集于 2012—2013年。實(shí)驗(yàn)地面積約0.19 hm2，種植非豆科植物作為隔離帶，并設(shè)置圍欄，由專人監(jiān)管。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)品種設(shè)4個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積60 m2。播種后按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方式統(tǒng)一管理。

1.2 根際土壤樣品的采集

樣品采集分為 4個(gè)階段，即苗期(seedling stage，SS)、花期(flowering stage，F(xiàn)S)、鼓粒期(podsetting stage，PS)和成熟期(Maturity stage，MS)，采用抖落法采集根際土壤(Liang et al.，2014)。采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣，將每個(gè)小區(qū)5點(diǎn)的土壤樣品混合為一個(gè)重復(fù)，過(guò)2 mm篩，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 土壤含水量測(cè)定 土壤含水量采用烘干稱重法測(cè)定(陳豐等，2012)。取土壤樣品于105℃烘干至恒重，利用以下公式計(jì)算土壤含水量。

含水量/%＝(濕土重-干土重)/干土重×100。

1.3.2 土壤pH值測(cè)定 取風(fēng)干土壤樣品10 g置于50 mL錐形瓶中(水土體積比2.5∶1)，間歇性攪拌或搖動(dòng)30 min，靜置30 min澄清后，用pH計(jì)測(cè)定懸池液的pH值(吳建平等，2015)。

1.3.3 土壤主要有機(jī)元素測(cè)定 根際土壤全碳、全氮含量的測(cè)定委托南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心完成，運(yùn)用Vario MICRO元素分析儀，檢測(cè)依據(jù)是JY/T 017-1996元素分析儀方法通則。

1.3.4 土壤主要酶活性測(cè)定 根際土壤蔗糖酶和堿性磷酸酶活性測(cè)定分別參照關(guān)蔭松(1986)和Wang et al.(2007)的方法。蔗糖酶的活性以反應(yīng)中釋放出的葡萄糖的量表示，堿性磷酸酶的活性以反應(yīng)中釋放出的酚的量表示，單位均為mg·g-1·d-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多處理間的差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan′s多重比較。另外，選擇單因素方差分析年份、生育期和栽培品種對(duì)土壤酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤含水量、pH和有機(jī)元素的變化

如表1所示，在大豆生長(zhǎng)各時(shí)期，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91與受體大豆ZD之間的土壤含水量、pH值均未出現(xiàn)顯著差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因大豆ZD91較之對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因大豆ZD對(duì)土壤含水量、pH值無(wú)顯著影響。

如表2所示，在大豆生長(zhǎng)各時(shí)期，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91與受體大豆ZD之間的土壤碳、氮元素含量均未出現(xiàn)顯著差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因大豆較之對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤碳、氮元素含量無(wú)顯著影響。土壤碳氮比值是土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的一個(gè)敏感指標(biāo)(Ge et al.，2013)。如表2所示，在大豆生長(zhǎng)各時(shí)期，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91與受體大豆ZD之間的土壤碳氮比值均未出現(xiàn)顯著差異。

2.2 根際土壤主要酶活性變化

2.2.1 蔗糖酶活性 由圖1可知，2012年，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91和其受體大豆ZD的根際土壤蔗糖酶活性在不同生育期的變化無(wú)明顯規(guī)律，成熟期時(shí)活性最高，分別為(0.75±0.02)和(0.72±0.07)mg·g-1·d-1。2013年，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91和其受體大豆ZD的根際土壤蔗糖酶活性在不同生育期呈均勻分布，與2012年不同，成熟期時(shí)活性最低，分別為(0.23±0.01)和(0.25±0.03)mg·g-1·d-1。 2 年中，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91與其受體大豆ZD的蔗糖酶活性在各個(gè)生育時(shí)期內(nèi)均無(wú)顯著差異。

表1 大豆生長(zhǎng)各時(shí)期根際土壤的含水量和p H值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 1 Mean values(±standard errors)of moisture and p H in rhizosphere soil under soybean at various developmental stages

表2 大豆生長(zhǎng)各時(shí)期根際土壤的碳、氮元素含量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 2 Mean values(±standard errors)of C and N contents in rhizosphere soil under soybean at various developmental stages

圖1 轉(zhuǎn)基因大豆ZD91及其受體大豆ZD根際土壤的蔗糖酶活性Fig.1 The invertase activity in rhizosphere soil of transgenic soybean ZD91 and its recipient ZD

2.2.2 堿性磷酸酶活性 由圖2可知，2012年，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91和其受體大豆ZD的根際土壤堿性磷酸酶活性隨大豆的生長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。苗期活性最高，轉(zhuǎn)基因大豆 ZD91 為(1.64±0.01)mg·g-1·d-1，其受體大豆ZD為(1.58±0.08)mg·g-1·d-1。 2013年，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91和其受體大豆ZD的根際土壤堿性磷酸酶活性在不同生育期呈均勻分布。鼓粒期活性最高，轉(zhuǎn)基因大豆 ZD91 為(0.87±0.01)mg·g-1·d-1，其受體大豆ZD為(0.85±0.03)mg·g-1·d-1。 2年中，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91與其受體大豆ZD的堿性磷酸酶活性在各個(gè)生育時(shí)期內(nèi)均無(wú)顯著差異。

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆ZD91及其受體大豆ZD根際土壤的堿性磷酸酶活性Fig.2 The alkaline phosphatase activity in rhizosphere soil of transgenic soybean ZD91 and its recipient ZD

2.2.3 土壤酶活性影響因素的ANOVA比較分析年份、生育期以及栽培品種對(duì)蔗糖酶和堿性磷酸酶活性影響的ANOVA比較分析(表3)發(fā)現(xiàn)，不同年份和不同生育期間的同種酶活性具有顯著差異(堿性磷酸酶的不同生育期除外)，說(shuō)明這2種酶的活性主要受年份和生育期的影響，而栽培品種未對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生影響。

表3 酶活與年份、生育期和栽培品種的ANOVA比較分析Table 3 ANOVA analysis of enzyme activity and year，growth stage and cultivar

3 討論與結(jié)論

由于外源基因的插入，轉(zhuǎn)基因植物的根系分泌物化學(xué)組成和數(shù)量就有可能發(fā)生變化，這種差異會(huì)對(duì)土壤含水量、有機(jī)元素含量等產(chǎn)生不同程度的影響(李孝剛，2011)。另外，轉(zhuǎn)基因作物的外源基因表達(dá)產(chǎn)物在降解或富集過(guò)程中，可能會(huì)引起微生物新陳代謝途徑的改變，從而引起土壤酶活性等的變化(蒲傳亮，2013)。因此，土壤有機(jī)元素、酶活性分析已被用于轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)，并被證實(shí)可間接地反映土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況(Caldwell，2005； Liang et al.，2014； Monkiedje et al.，2002； Zhang et al.，2014)。 研究表明，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸苜蓿會(huì)影響土壤中氮循環(huán)的相關(guān)細(xì)菌(Faragováet al.，2005)。本課題組前期研究表明，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆ZD91與其受體大豆ZD相比，根系分泌物中蛋氨酸含量無(wú)顯著差異，且根際固氮細(xì)菌、氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量均無(wú)顯著變化(Liang et al.，2014)。

一些環(huán)境因素，包括土壤含水量、土壤有機(jī)元素等，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物和微生物互作的影響十分明顯(李鑫鑫等，2010)。 Means et al.(2007)發(fā)現(xiàn)，只有在土壤含水量充足的條件下，草甘膦處理的轉(zhuǎn)基因大豆根際土壤酶活性和微生物活性才會(huì)增強(qiáng)，推測(cè)土壤含水量是土壤微生物發(fā)生變化的關(guān)鍵因素之一。另外，龐延軍等(2011)建立的一種適于轉(zhuǎn)基因植物土壤微生態(tài)系統(tǒng)評(píng)價(jià)的體系指出，通過(guò)測(cè)定土壤含水量、有機(jī)元素、酶活等土壤相關(guān)指標(biāo)，可評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生態(tài)的影響。

研究表明，外源基因的導(dǎo)入可能會(huì)影響植物分解速率和碳、氮水平，碳氮比(C/N)的增大會(huì)降低土壤微生物氮元素的利用度，從而會(huì)導(dǎo)致土壤降解速率的降低(陳豐等，2012)。另有研究顯示，種植轉(zhuǎn)基因作物對(duì)其根際土壤的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)都無(wú)明顯影響，且不會(huì)產(chǎn)生副作用(杜娟等，2014)。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆ZD91較之對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤主要有機(jī)元素?zé)o顯著影響。

土壤酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)方面扮演重要的角色，在一定程度上反映了土壤微生物的活性，是測(cè)定土壤質(zhì)量的生物活性指標(biāo)，因此評(píng)價(jià)不同轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤酶活的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義(楊萬(wàn)勤和王開運(yùn)，2004)。土壤酶活性受很多因素影響，如植物根系、土壤類型、土壤有機(jī)元素等(Das ＆ Varma，2011； Hannula et al.，2012)。商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物可能會(huì)對(duì)土壤特性以及土壤酶活性產(chǎn)生影響(Flie?bach et al.，2012；Liu，2010)。前人研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤酶活性的影響機(jī)理可能是轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白與土壤酶競(jìng)爭(zhēng)土壤顆?；钴S表面的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響土壤酶的活性(郭文文等，2009)。土壤中包含了多種多樣的酶，研究時(shí)有必要選取具有代表性的酶進(jìn)行分析(Flores et al.，2005； Ladd et al.，1996； Rao et al.，2003)。

本研究發(fā)現(xiàn)，土壤酶活性隨著年份和生育期的改變而改變；相同生育期內(nèi)，轉(zhuǎn)基因大豆ZD91與其受體大豆ZD土壤酶活性沒有顯著差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因大豆ZD91未對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生影響。Icoz et al.(2008)、Liu et al.(2008)和 Shen et al.(2006)也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物相比，土壤酶活性沒有顯著差異。

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Effect of a high-methionine transgenic soybean(Glycine max)on soil organic elements and enzyme activities in the rhizosphere

LIANG Jingang1，2， MENG Fang2， ZHANG Zhengguang2?

1Development Center of Science and Technology， Ministry of Agriculture， Beijing 100122， China；2College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095， China

【Aim】 In order to evaluate the safety of transgenic high-methionine soybean ZD91 to the soil component of ecosystems，we studied the impact of transgenic soybean ZD91 on the main organic elements and enzyme activities in the soil.【Method】 Rhizosphere soil samples were collected at four different growth stages(seedling， flowering， pod-setting， and maturity)in two consecutive growing seasons，and the effect on soil moisture，pH，a mounts of total Cand total N，and invertase and alkaline phosphatase activities were measured under the laboratory conditions.【Result】 The results showed that growing transgenic soybean ZD91 had no significant effects on soil moisture，pH，the concentrations of main soil organic elements and enzyme activities in rhizosphere compared to similar parameters in soil under non-transgenic soybean.Invertase and alkaline phosphatase activities showed significant differences in different years and different growth stages.【Conclusion】 Transgenic soybean ZD91 is safety for soil ecosystem.

transgenic high-methionine soybean； ZD91； soil organic element； soil enzyme activity

10.3969/j.issn.2095-1787.2017.04.008

2017-05-31 接受日期(Accepted):2017-07-01

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2016ZX08011-003)

梁晉剛，男，農(nóng)藝師。研究方向:轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)與檢測(cè)。E-mail:jgliang0513＠sina.com

?通信作者(Author for correspondence)，E-mail:zhgzhang＠njau.edu.cn

(責(zé)任編輯:楊郁霞)