魯海菊，沈云玫，陶宏征，江 濤，王傳銘

(紅河學院 生命科學與技術學院，云南蒙自 661199)

內(nèi)生木霉P3.9菌株的多功能性及其枇杷根腐病的盆栽防效

魯海菊，沈云玫，陶宏征，江 濤，王傳銘

(紅河學院 生命科學與技術學院，云南蒙自 661199)

為明確內(nèi)生木霉P3.9菌株多功能性及其生防潛力，采用菌絲生長速率法、透明圈法、農(nóng)藝性狀觀測法、組織分離法、土壤梯度稀釋法和盆栽法，分別測定其對不同植物病原菌的抑制率、不同化學農(nóng)藥的耐藥性、纖維素及磷的降解能力、促生作用、在枇杷植株及其根際土壤中的定殖能力和枇杷根腐病的防治效果。結果表明，內(nèi)生木霉P3.9菌株對7種植物病原菌有不同程度的抑菌作用，其中，對枇杷根腐病菌的抑制作用最強，抑菌率達93%；對5種化學農(nóng)藥有不同程度的耐藥性，其中，對硫磺三唑酮的耐藥性最高；對纖維素及磷有極強的降解能力；對枇杷植株有促生作用，能定殖于枇杷植株及其根際土壤中，盆栽防治枇杷根腐病效果可達80%。

內(nèi)生木霉；拮抗作用；耐藥性；降解纖維素能力；解磷能力；促生作用；定殖能力

木霉(Trichoderma)是重要的生防因子，近年來，由于大量持續(xù)使用化肥和農(nóng)藥，使土壤環(huán)境發(fā)生很大變化。施入土壤的木霉受到土壤因子的影響，包括殘留農(nóng)藥(多數(shù)為有機磷農(nóng)藥)的抑制作用，導致木霉菌劑在田間防效不穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)有些木霉同時具有耐藥[1-4]、降解纖維素[5]、解磷[6-12]、促生[13-16]等多種功能。耐藥性菌株更容易定殖于植物的根際土壤及其植株中[17]，另外，內(nèi)生木霉受到宿主的良好保護，較其腐生木霉，更具有生防優(yōu)勢。因此，本研究檢測枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株的抗菌、耐藥、解磷、降解纖維素、促生等多功能特性，并研究其對枇杷根腐病的盆栽防治效果，為枇杷根腐病的安全可持續(xù)防控提供理論依據(jù)及菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生木霉P3.9菌株(Trichodermaatroviride)、石榴干腐病菌(Zythiaversoniana)、枇杷根腐病菌(Pestalotiopsismicrosopora)、辣椒黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、辣椒黑斑病菌(Alternariaalternata)、萬壽菊葉斑病菌(Alternariabrassicicola)、康乃馨根腐病菌(Fusariumsp.)和石榴枯萎病菌(Ceratocystisfimbriata)均保存于紅河學院生命科學與技術學院植物病理學標本室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖18 g、瓊脂13.5 g、蒸餾水1 L。

1.2 內(nèi)生木霉P3.9菌株多功能性的測定

1.2.1 對不同植物病原菌的抑制作用 將供試植物病菌和內(nèi)生木霉P3.9菌株在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫擴大培養(yǎng)5 d，采用對峙培養(yǎng)法[18]，在培養(yǎng)基同一半徑周圍，用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，將木霉與病菌兩兩組合，同時接種于無菌PDA平板(直徑90 mm)中，兩接種點相距45 mm，以不接種木霉菌株作對照， 設3次重復，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，第7天測定病菌的菌落直徑，計算其生長抑制率。

抑制率=[(dCK-dB)/dCK]×100%

式中，dCK表示對照病菌菌落直徑，dB表示處理病菌菌落直徑。

1.2.2 抗化學農(nóng)藥特性 培養(yǎng)基：K2HPO45.71 g、KH2PO41.7 g、(NH4)2SO42.63 g、MgSO4·7H2O 0．095 g、MnSO40.05 g、FeSO40.05 g、CaCl20.003 g、瓊脂13 g，蒸餾水定容至1 L。

將木霉菌株接種于分別含有終質量濃度為100 mg/L的甲基硫菌靈、甲硫異菌脲、多菌靈、撲海因、硫磺三唑酮、甲霜靈錳鋅、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和百菌清的固體基礎培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察其生長狀況以判定是否具有抗藥性。若是產(chǎn)孢，用蒸餾水沖洗孢子，制成孢子液(1×107L-1)在200 r/min搖床上震蕩20 min，備用，用血球計數(shù)板在顯微鏡下統(tǒng)計孢子數(shù)。

1.2.3 降解纖維素能力 CM固體培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.5 g、K2HPO42.0 g、NaH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、微晶纖維素5.0 g、瓊脂13.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.4。

將木霉菌株接種至CM固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔48 h觀察菌落形態(tài)，并通過十字交叉法測量菌落直徑，每處理設3次重復。培養(yǎng)6 d后，用1 g/L的剛果紅溶液浸泡平板10 min，用 8 g/L 的NaCl水溶液漂洗15 min，觀察平板上是否出現(xiàn)透明降解圈，以驗證纖維素是否被有效降解。

1.2.4 解無機磷能力 解磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g、(NH4)2SO40.50 g、NaC1 0.30 g、KC1 0.30 g、MgSO4·7H2O 0.30 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、Ca3(PO4)25.00 g，pH 7.0～7.5，固體培養(yǎng)基的瓊脂粉。

將木霉菌株接種于解磷固體培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察有無透明水解圈以判定其是否具有解無機磷的能力。

1.2.5 對枇杷植株的促生作用 枇杷嫁接苗種植于營養(yǎng)袋(23 mm×18 mm)中，常規(guī)肥水管理，苗齡為1 a時做接種試驗。將內(nèi)生木霉P3.9菌株在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)3 d，用5 mm直徑的打孔器打取菌餅，備用，同時用同一規(guī)格的打孔器將枇杷苗主干韌皮部打出孔，去除韌皮部，每株枇杷苗主干打10個孔。將上述菌餅放置于除去韌皮部的枇杷主干孔中，用保鮮膜密封保濕。以接種PDA圓餅做對照。設10個重復。第180天統(tǒng)計枇杷葉片數(shù)量，用游標卡尺測量葉面積及株高。用攜式葉綠素檢測儀測定葉片葉綠素質量分數(shù)。

1.2.6 在枇杷植株及根際中的定殖能力 枇杷苗栽種及木霉P3.9菌株接種方法同“1.2.5”，第180天，隨機取枇杷苗根、莖、葉組織，根、莖切成1 cm左右的小段，葉切成0.5 mm×0.5 mm的小塊，用φ=70%的酒精漂洗1 min，再用次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干水分后，接種于PDA平板，每個培養(yǎng)皿接5塊組織，置于28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察是否分離到木霉。分離未接木霉的枇杷組織做對照。木霉選擇性培養(yǎng)基配方[19]: MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.9 g、KCl 0.15 g、(NH4)2SO41.0 g、葡萄糖 3.0 g、玫瑰紅四氯四碘螢素鈉鹽(C20H2O5Cl4I4Na2) 0.033 g、瓊脂粉20 g，五氯硝基苯(w=75%可濕性粉劑) 0.2 g、水1 L，pH 6.0 (滅菌前調節(jié))，五氯硝基苯在培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右時，于倒平板前加入到三角瓶中，并充分搖勻。

在云南省蒙自市枇杷根腐病病區(qū)采集根際土樣，每個樣地分別選取3個樣點，在每個樣點(1 m×1 m)按五點取樣法取深度0～15 cm的枇杷根際土樣。裝袋密封帶回實驗室，利用四分法將土樣充分混勻，分別稱取400 g裝入2個淺盤中，高壓蒸汽連續(xù)滅菌。將1×107mL-1木霉孢子懸浮液100 mL施入其中一個淺盤中，另外一個撒等量清水為對照，置于28 ℃下保濕培養(yǎng)。設3個重復。于木霉接種第30天取10 g土樣配制成10-5g/mL的土壤懸浮液10 μL，加入木霉選擇性培養(yǎng)基中，采用稀釋涂布平板法計數(shù)，28 ℃培養(yǎng)3 d，測定木霉菌落數(shù)。

1.2.7 對枇杷根腐病的盆栽防效 枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株接種方法同“1.2.5”。設3個處理，處理1為同時接種枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株及枇杷根腐病病菌，處理2為枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株接種7 d后接種枇杷根腐病病菌，處理3為枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株接種7 d前接種枇杷根腐病病菌，以接種PDA圓餅為對照。每個處理設5個重復。每天觀察枇杷苗長勢及發(fā)病情況。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncan’s多重比較法統(tǒng)計分析處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1內(nèi)生木霉P3.9菌株對不同植物病原菌的抑制作用

由表1可知：內(nèi)生木霉P3.9菌株對供試的7種植物病菌均有抑制作用，抑菌率均高于60%。其中，對枇杷根腐病菌、石榴干腐病菌、辣椒黃萎病菌和辣椒黑斑病菌4種病菌的抑菌率高于80%。相比較而言，對枇杷根腐病菌和石榴干腐病菌的抑菌率最大，分別為93%和88%。與其他病菌差異極顯著。說明內(nèi)生木霉P3.9菌株對這2種病害的生防潛力最大。P3.9菌株分離自枇杷主干韌皮部，理論上更容易定殖于枇杷根際及其植株中，生防潛力更大。

表1 內(nèi)生木霉P3.9菌株對不同植物病原菌的抑菌作用Table 1 Inhibitory effect of endophytic Trichoderma P3.9 strain to different plant pathogens

注：不同小寫字母代表在Plt;0.05水平差異顯著;不同大寫字母代表在Plt;0.01水平差異極顯著。下同。

Note：Different lowercase letter means significant difference(Plt;0.05),different capital letter means difference(Plt;0.01).The same below.

2.2 內(nèi)生木霉P3.9菌株的抗化學農(nóng)藥特性

由表2可知：內(nèi)生木霉P3.9菌株能被甲基硫菌靈、甲硫異菌脲、多菌靈和撲海因4種化學農(nóng)藥100% 抑制，說明此菌株對上述4種化學農(nóng)藥不具抗藥性。百菌清、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、甲霜靈錳鋅和硫磺三唑酮5種化學農(nóng)藥能不同程度地抑制P3.9菌株生長。其中，在含硫磺三唑酮的培養(yǎng)基中，P3.9菌株產(chǎn)孢量與其余農(nóng)藥差異極顯著，產(chǎn)孢量最多，與對照產(chǎn)孢量在同一個數(shù)量級(107mL-1)。而且此農(nóng)藥不能抑制P3.9菌株的菌絲生長，說明內(nèi)生木霉P3.9菌株對硫磺三唑酮具有極強的抗藥性。另外，對百菌清、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑和甲霜靈錳鋅4種化學農(nóng)藥也具有不同程度的抗藥性。其中，甲霜靈錳鋅對P3.9菌株的菌絲生長與其他農(nóng)藥差異極顯著，菌落直徑最大，與對照菌落直徑相等。說明內(nèi)生木霉P3.9菌株對甲霜靈錳鋅的抗藥性也很強。

表2 內(nèi)生木霉P3.9菌株的抗化學農(nóng)藥特性Table 2 Characteristics of endophytic Trichoderma P3.9 strain resistant to chemical pesticide

2.3 內(nèi)生木霉P3.9菌株降解纖維素的能力

內(nèi)生木霉P3.9菌株在含有微晶纖維素的培養(yǎng)基上生長良好，菌落直徑達88.0 mm。使培養(yǎng)基變透明(圖1-A)，含微晶纖維素的培養(yǎng)基混濁(圖1-B)。說明內(nèi)生木霉P3.9菌株對纖維素有極強的降解能力。

2.4 內(nèi)生木霉P3.9菌株的解磷能力

內(nèi)生木霉P3.9菌株在含有磷酸鈣的培養(yǎng)基上生長良好，菌落直徑達88.0 mm。使培養(yǎng)基變透明(圖2-A)，含磷酸鈣的培養(yǎng)基混濁(圖2-B)。說明內(nèi)生木霉P3.9菌株對難溶磷有極強的降解能力。

A.被降解 Degraded;B.未降解 Undegraded cellalose

A.被降解 Degraded;B.未降解 Undegraded cellalose

2.5 內(nèi)生木霉P3.9菌株對枇杷植株的促生作用

由表3及圖3可知：枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株在接種于枇杷主干韌皮部第30天(圖3-B)，其葉片數(shù)量、葉面積、葉綠素質量分數(shù)及株高與接種第3天(圖3-A)差異極顯著，各項指標均高于對照。葉片數(shù)量比對照每株多6片，葉面積每片葉比對照大39.8 cm2，葉綠素質量分數(shù)每片葉比對照大0.01 mg/g，株高每株比對照大5 mm。說明此菌株對枇杷植株有促生作用。

2.6內(nèi)生木霉P3.9菌株在枇杷根際及其植株中的定殖能力

枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株在枇杷植株及其根際中接種第30天，同時能再次分離到木霉菌株(圖4-B，圖5-A)，而未接種木霉的對照中未分離到木霉(圖4-A，圖5-B)。說明此菌株能在枇杷根際及其植株中定殖。

表3 內(nèi)生木霉P3.9菌株對枇杷植株的促生作用Table 3 Growth-promoting effect of endophytic Trichoderma P3.9 strain on loquat

2.7內(nèi)生木霉P3.9菌株對枇杷根腐病的盆栽防效

由表4可知，只接種PDA圓餅的對照植株(圖6-a)不發(fā)病。只接種枇杷根腐病病菌的枇杷植株(圖6-g)最后整株枯死。枇杷根腐病病菌接種第7天接種枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株(圖6-b,6-c)、木霉P3.9菌株接種第7天接種根腐病病菌(圖6-d,6-e)、同時接種木霉P3.9菌株及根腐病病菌(圖6-f)的植株，其病害控制百分比差異極顯著。其中，病原菌接種前7天接種木霉的防治效果優(yōu)于病原菌接種7 d后接種木霉的防治效果，前者防治效果達80%，后者防治效果為40%。病原菌與木霉同時接種，防治效果為60%。說明在病菌入侵之前，提前活體接種木霉P3.9菌株能起到預防控制病害的作用。

A:接種時枇杷植株生長狀況 Growth status of loquat plant before inoculation; B:第30天時枇杷植株生長狀況 Growth status of loquat plant inoculated by endophyticTrichodermaP3.9 strain for 30 days;a～c.接種內(nèi)生木霉P3.9菌株的枇杷植株 Loquat plants inoculated by endophyticTrichodermaP3.9 strain; d～f.對照枇杷植株 Loquat plants of CK

圖3枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株促進枇杷植株生長狀況
Fig.3LoquatplantgrowthpromotedbyendophyticTrichodermaP3.9strain

A.不接種內(nèi)生木霉P3.9菌株的枇杷韌皮部組織上分離的枇杷內(nèi)生菌株 Endophytic fungi isolated from phloem tissue of loquat without inoculating endophyticTrichodermaP3.9 strain; B.接種內(nèi)生木霉P3.9菌株的枇杷韌皮部組織分離的木霉菌株和其他枇杷內(nèi)生菌株 EndophyticTrichodermastrains isolated from phloem tissue of loquat inoculated by endophyticTrichodermaP3.9 strain and the other endophytic fungi

圖4枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株在枇杷植株中的定殖狀況
Fig.4ColonizationofendophyticTrichodermaP3.9straininloquatplant

A.接種內(nèi)生木霉P3.9菌株的枇杷根際土壤中再次分離到木霉菌株 EndophyticTrichodermastrains isolated again from rhizospere soil of loquat plant inoculated by endophyticTrichodermaP3.9 strain; B.不接種內(nèi)生木霉P3.9菌株的枇杷根際土壤中未分離到木霉菌株 NoTrichodermastrain isolated from rhizospere soil of CK

圖5內(nèi)生木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的定殖狀況
Fig.5ColonizationofendophyticTrichodermaP3.9straininrhizosperesoilofloquatplant

表4 木霉P3.9菌株對枇杷根腐病的防治效果Table 4 Effect of endophytic Trichoderma P3.9 strain to control loquat root rot

A：a.PDA圓餅接種枇杷植株對照 Loquat plant inoculated by PDA disc of root rot pathogen; b、c.病菌接種第7天接種木霉枇杷植株 Loquat plant inoculated sequentially by root rot pathogen and P3.9 strain with 7 days interval inoculation; d、e.木霉接種第7天接種病菌枇杷植株 Loquat plant inoculated sequentially by P3.9 strain and root rot pathogen with 7 days interval;B：f.同時接種木霉與病菌接種枇杷植株 Loquat plant inoculated simultaneously by root rot pathogen and P3.9 strain;g.只接種病原菌枇杷植株對照 Loquat plant inoculated only by root rot pathogen

圖6木霉P3.9菌株對盆栽枇杷根腐病的防治效果
Fig.6EffectofendophyticTrichodermaP3.9straintocontrolofloquatrootrot

3 討 論

本研究結果表明，枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株對枇杷根腐、石榴干腐、辣椒黃萎病、辣椒黑斑病、萬壽菊葉斑病、康乃馨根腐病和石榴枯萎病7種植物病原菌有不同程度的抑菌作用，抑菌率均高于60%。其中，對枇杷根腐病菌的抑制作用最強，抑菌率達93%。與前人的報道一致[20]。對硫磺三唑酮、甲霜靈錳鋅、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和百菌清5種化學農(nóng)藥有不同程度的耐藥性，其中，對硫磺三唑酮耐藥性最高，其菌絲生長及產(chǎn)孢能力幾乎不受影響。與前人的報道一致[1-4]。對纖維素及磷具有極強的降解能力。能增加枇杷葉片數(shù)量及葉面積、株高和葉綠素質量分數(shù)，對枇杷促生作用明顯，與前人的報道[6-12]一致[13-16,21]。能定殖于枇杷植株及其根際土壤中，對枇杷根腐病的防效可達80%，與前人的報道一致[17,19]。此菌株分離自枇杷主干韌皮部[22]，抗菌譜廣[23]，對枇杷根際土壤真菌[24]和枇杷內(nèi)生真菌[25]有極強的抑制作用，其固體發(fā)酵工藝[26]簡單。這種集抗菌、耐藥、解磷、降解纖維素和促生5種功能于一身的木霉菌株，尚屬首次報道?？煞乐味喾N植物病害，降解土壤不可溶或難溶的無機磷，供作物吸收，減少磷肥的使用量，也可幫助降解有機堆肥，促進作物生長，甚至與化學農(nóng)藥混配使用，提高病害防治效果，減少農(nóng)藥使用量。因此，枇杷內(nèi)生木霉P3.9 菌株具有廣闊的開發(fā)應用前景。

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(責任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

MultifunctionofEndophyticTrichodermaP3.9StrainandControlEffectonLoquatRootRot

LU Haiju, SHEN Yunmei, TAO Hongzheng, JIANG Tao and WANG Chuanming

(Department of Life Science and Technology, Honghe College, Mengzi Yunnan 661199, China)

In order to determine the multifunction characteristics and biocontrol potential of endophyticTrichodermaP3.9 strain，Abilities of inhibiting different plant pathogens，resistance to different fungicides，degradation of cellulose and calcium phosphate，growth-promoting，colonization and control of loquat root rot were tested by methods of mycelial growth rates，transparent zone，observation of agronomic trait，tissue isolation of plant，gradient dilution of soil and pot-culture.The results showed that the P3.9 strain had inhibiting effect on seven kinds of plant pathogens.Moreover, the strongest inhibiting effect was detected on loquat root rot, with the inhibition rate of 93%.The P3.9 strain had also a degree of resistance to seven kinds of fungicides, and the best resistance effect was detected on sulfur-triadimenol.It had strong ability of degrading cellulose and calcium phosphate, promoting growth of loquat plant.The P3.9 strain was colonize in loquat plant and rhizospere soil.Control effect of P3.9 strain on loquat root rot was 80%.

EndophyticTrichoderma；Antagonism；Resistance to fungicide；Cellulose degradation；Calcium phosphate degradation；Growth-promoting effect； Colonization ability

2016-12-20

2017-03-12

The National Natural Science Foundation of China(No.31660147 );Yunnan Applied Basic Research Projects(No.2016FB066);the Key Project of Applied Scientific Research of Honghe College(No.XJY15Z06).

LU Haiju,female,professor，Ph.D.Research area: plant diseases caused by fungi and biological control.E-mail:luhaiju2011@126.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.032.html

2016-12-20

2017-03-12

國家自然科學基金(31660147)；云南省應用基礎研究計劃(2016FB066)；紅河學院應用型科學研究重點項目(XJY15Z06)。

魯海菊，女，教授，博士，主要從事植物真菌病害及其生物防治研究。E-mail：luhaiju2011@126.com

S667.3

A

1004-1389(2017)11-1681-08