楊佳文 ，趙尊練，張管曲，謝芳琴，姜長岳，張永香，韓曉萍，徐乃林

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，陜西楊凌 712100； 3.富平縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西富平 711700；4.寶雞市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，陜西寶雞 721001)

陜西線辣椒炭疽病原菌的鑒定及生物學(xué)特性研究

楊佳文1，趙尊練1，張管曲2，謝芳琴2，姜長岳1，張永香1，韓曉萍3，徐乃林4

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，陜西楊凌 712100； 3.富平縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西富平 711700；4.寶雞市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，陜西寶雞 721001)

為了搞清陜西省線辣椒主產(chǎn)區(qū)炭疽病的致病菌類型及其主要生物學(xué)特性，對采自陜西省寶雞市線辣椒主產(chǎn)區(qū)具有炭疽病癥狀的80份線辣椒果實樣品進行致病病原菌分離、鑒定、主要生物學(xué)特性研究及多基因聯(lián)合分析。結(jié)果表明，從80份病樣中共鑒定出4種不同的炭疽菌，即尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)、大豆炭疽菌(Colletotrichumtruncatum)、菠菜炭疽菌(Colletotrichumspinaciae)和博寧炭疽菌(Colletotrichumboninense)，4種炭疽菌所占比率依次為83.75%、13.75%、1.25%和1.25%；尖孢炭疽菌對線辣椒的致病力最強，其次是大豆炭疽菌，菠菜炭疽菌對線辣椒致病力較弱，博寧炭疽菌對線辣椒沒有致病力。生物學(xué)特性研究表明，溫度25 ℃、連續(xù)光照、pH=6、碳源葡萄糖、氮源酵母浸膏最適合尖孢炭疽菌菌絲生長，溫度30 ℃、連續(xù)光照、pH為5～6、碳源麥芽糖、氮源酵母浸膏最適合尖孢炭疽菌菌株產(chǎn)孢；溫度30 ℃、連續(xù)光照、pH為7、碳源果糖、氮源蛋白胨最適合大豆炭疽菌菌絲生長，溫度30 ℃、連續(xù)黑暗、pH為5～6、碳源麥芽糖、氮源脯氨酸最適合大豆炭疽菌菌株產(chǎn)孢；溫度30 ℃、連續(xù)光照、pH為9～11、碳源麥芽糖、氮源蛋白胨最適合菠菜炭疽菌菌絲生長；溫度30 ℃、連續(xù)黑暗、pH為5～6、碳源麥芽糖、氮源蛋白胨最適合菠菜炭疽菌菌株產(chǎn)孢。在陜西省線辣椒上發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌，為首次報道；在辣椒上發(fā)現(xiàn)菠菜炭疽菌，亦為首次報道。

線辣椒；炭疽??；病原鑒定；多基因聯(lián)合分析；生物學(xué)特性

辣椒是茄科辣椒屬植物，原產(chǎn)自南美洲[1]。線辣椒屬于一年生辣椒種(CapsicumannuumL.)，是中國加工辣椒的一種重要類型[2]，在陜西、新疆、四川、湖南、甘肅、河北等省(市、自治區(qū))有較大面積的種植，年種植面積穩(wěn)定在40 000～50 000 hm2[3]。陜西的線辣椒主要分布在陜西省關(guān)中地區(qū)，目前關(guān)中西部的寶雞地區(qū)是陜西省線辣椒的傳統(tǒng)主產(chǎn)區(qū)。近幾年來，這一產(chǎn)區(qū)的炭疽病呈現(xiàn)逐年加重的趨勢，到2013年前后，少數(shù)區(qū)域病害的損失達到90%左右，已經(jīng)上升為當(dāng)?shù)鼐€辣椒的首要病害。

辣椒炭疽病由子囊菌門內(nèi)的有絲分裂孢子真菌炭疽菌引起，炭疽病菌感染辣椒最早在印度發(fā)現(xiàn)[4]。有資料認為，引起辣椒炭疽病的真菌共有12 種，分別是膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黑色炭疽菌(C.coccodes)、黑點炭疽菌(C.capsici)、黑線炭疽菌(C.dematium)、殼皮炭疽菌(C.crassipes)、C.brevispora、博寧炭疽菌(C.boninense)、大豆炭疽菌(C.truncatum)、君子蘭炭疽菌(C.cliviae)、喀斯特炭疽菌(C.karstii)、C.fructicola和尖孢炭疽菌(C.acutatum)[5]。但在中國大部分辣椒產(chǎn)區(qū)以膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)和黑點炭疽菌(C.capsici)侵染比較普遍[6]。關(guān)于炭疽病病原菌的分類鑒定，目前應(yīng)用比較普遍的方法有傳統(tǒng)分類指標(biāo)(分生孢子，附著孢，分生孢子梗和產(chǎn)孢細胞，剛毛、菌核和厚垣孢子，純培養(yǎng)特征，寄主專一性，無性型與有性型之間的聯(lián)系及配對型)鑒定、分子生物學(xué)鑒定(核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列即ITS，多基因系統(tǒng)學(xué)分析)和次生代謝特異性鑒定[7]。

關(guān)于陜西省辣椒炭疽病的病原菌，迄今為止，只有鞏振輝等[8]于24 a前做過簡單的形態(tài)學(xué)及致病力鑒定。一方面，只憑形態(tài)學(xué)鑒定難以準(zhǔn)確地區(qū)分一些相似菌種；另一方面，時隔20多年，也很有可能產(chǎn)生新的菌種。因此，本研究通過分離、回接、傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定、多基因聯(lián)合分析等手段，鑒定陜西省線辣椒主產(chǎn)區(qū)炭疽病的致病菌類型，同時對其生物學(xué)特性進行研究，以期為這一病害的防控提供理論支持和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 病原菌的采集、分離和純化

2015年10月，在陜西省線辣椒炭疽病高發(fā)季節(jié)，分別在陜西省線辣椒主產(chǎn)區(qū)的鳳翔縣、隴縣、岐山縣、千陽縣等地采集具有炭疽病癥狀的線辣椒果實樣品80份。按常規(guī)組織分離法分離、純化病原菌[9]。在線辣椒病健交界處剪取大小為4 mm×4 mm的組織塊，將組織塊放入φ=70%酒精中消毒30 s，再放入φ=5% NaClO中消毒3～5 min，然后用無菌水清洗3次。將清洗后的組織塊放在無菌濾紙上吸干，再轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基中，每皿3塊，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)純化和斜面培養(yǎng)后的菌株保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)7 d后，觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色等特征；挑取菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)、大小和剛毛有無情況；在產(chǎn)孢的菌落中加入50 mL無菌水，借助血球計數(shù)板調(diào)整成數(shù)量密度為1×105mL-1的孢子懸浮液 ，滴在凹玻片上，放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿里，在25 ℃的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，24 h后觀察附著孢的形態(tài)、大小。

1.3 病原菌的致病性測定

用移液槍將已配制的數(shù)量密度為1×105mL-1孢子懸浮液通過針刺法接種到健康線辣椒，每個線辣椒果實接種3～4個點，并用無菌水處理作對照。接種后的線辣椒放入墊有濾紙的托盤中，覆蓋保鮮膜，在25 ℃的培養(yǎng)箱中加水保濕培養(yǎng)。逐日觀察發(fā)病情況，7 d后再次分離病原菌。

1.4 病原菌DNA的提取

用滅菌槍頭挑取新鮮菌絲于研缽中，倒入液氮充分研磨并采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取試劑盒提取菌絲總DNA。

1.5 病原菌的PCR擴增及電泳檢測

選擇形態(tài)學(xué)鑒定出的炭疽菌代表菌株，擴增各代表菌株的DNA核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列，幾丁質(zhì)合成酶Ⅰ(CHSⅠ)序列、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)序列、肌動蛋白(ACT)序列。擴增所用引物分別為核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS) 通用引物對ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS5：5′-GGAAGTAAAAGT- CGTAACAAGG-3′[10]；幾丁質(zhì)合成酶Ⅰ基因(CHSⅠ) 通用引物對CHSⅠ-79F：5′-TGGG-GCAAGGATGCTTG-GAAGAAG-3′和CHSⅠ-354R：5′-TGGAAGAACCATCTGTGAGAGT-TG-3′[11]；3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)通用引物對GDF1：5′-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3′[12]和GDR1：5′-GGGTGGAG-TCGTACTTGAGCATGT-3′[13]；肌動蛋白基因(ACT)通用引物對ACT-512F：5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′和ACT-783R：5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′[11]。

PCR擴增體系(50 μL)設(shè)定為：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，通用引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 37 μL。擴增條件設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，48 ℃(ITS通用引物對)、56 ℃(GHSⅠ、GDPH通用引物對)、57 ℃(ACT通用引物對)退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。得到的PCR擴增產(chǎn)物用0.01 g/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)培清JS-2000凝膠成像儀拍照后委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 多基因聯(lián)合分析

在NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫中，將所測基因序列進行Blast對比，選擇含有ITS、ACT、CHSⅠ、GAPDH4個基因的相似序列菌株作為模式菌株，將每個基因結(jié)合模式菌株的參考序列用Clustal W進行排序、切除兩端，按照ITS、ACT、CHSⅠ、GAPDH的順序首尾串聯(lián)，最后引入外類群菌株，用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining(N-J)法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 病原菌的生物學(xué)特性研究

1.7.1 不同光照周期下菌株生長量和產(chǎn)孢量的測定 將直徑為5 mm的菌餅接入PDA培養(yǎng)基中央，分別在24 h持續(xù)光照、24 h持續(xù)黑暗、12 h/12 h光暗交替的培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)5 d后，用游標(biāo)卡尺對供試菌株菌落的直徑進行測量，取3次測量的平均值。培養(yǎng)12 d后，取培養(yǎng)基中央的10塊菌餅放入無菌燒杯中，加入10 mL無菌水，壓碎菌餅并不斷攪拌菌液，使得分生孢子充分混勻于無菌水中，再用血球計數(shù)板測定每毫升菌液的產(chǎn)孢量。

1.7.2 不同溫度下菌株生長和產(chǎn)孢量的測定 將直徑為5 mm的菌餅接入到PDA培養(yǎng)基中央，分別放置在溫度為5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃ 的培養(yǎng)箱中12 h光暗交替培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。供試菌株直徑、產(chǎn)孢量的測量方法同上。

1.7.3 不同pH條件下菌株生長和產(chǎn)孢量的測定 滅菌后的培養(yǎng)基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將pH調(diào)為4、5、6、7、8、9、10、11等。將直徑為5 mm菌餅接入不同pH的培養(yǎng)基中央，每處理3次重復(fù)，放置在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。供試菌株直徑、產(chǎn)孢量的測量方法同上。

1.7.4 不同碳、氮源條件下菌株生長和產(chǎn)孢量的測定 以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照。替換其中的碳源和氮源，將直徑為5 mm菌餅接入不同碳、氮源的培養(yǎng)基中央，每處理3次重復(fù)，放置在25 ℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)。供試碳源為：蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉。供試氮源為：硝酸鈉、蛋白胨、酵母浸膏、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸。供試菌株直徑、產(chǎn)孢量的測量方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

通過病原菌形態(tài)學(xué)鑒定及致病性測定，從80個線辣椒樣本中共鑒定出4種不同的炭疽菌。每種炭疽菌選取代表菌株進行后續(xù)試驗，根據(jù)采集地名的首字母和分離的順序，將代表菌株分別命名為LX1、LX2、QY3、QS3。從表1可以看出，在80個線辣椒炭疽病樣本中，LX2分離出的比率最高，為83.75%；其次是LX1，比率為13.75%。QY3和QS3僅分離到1株，比率各為1.25%。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

從圖1可以看出，菌株LX2培養(yǎng)初期菌中央呈橘色，后期菌落為墨綠色，背面淺灰色至深灰色，菌絲白色絨毛狀，致密；菌落圓形，邊緣整齊；菌落生長速度中等，PDA上25 ℃培養(yǎng)5 d，直徑為38.72 mm；PDA上產(chǎn)孢快，5 d左右產(chǎn)孢；分生孢子盤稀少，不產(chǎn)剛毛；不產(chǎn)菌核；分生孢子直，無色單孢，長橢圓形，一端尖，有的兩端略尖，大小為(8.1～17.9) μm×(2.1～4.0) μm；分生孢子團橘紅色；附著胞淺褐色至淺黑色，較小，球形，大小為(5.4～6.6) μm×(4.1～6.2) μm。參照真菌手冊以及植物病原真菌學(xué)[14-15]，初步將菌株LX2鑒定為尖孢炭疽菌(C.acutatum)。

表1 陜西線辣椒炭疽菌分離結(jié)果Table 1 The isolated Colletotrichum from Xianlajiao chili pepper in Shaanxi rovince

A.菌落 Colony；B.分生孢子盤 Acervulus；C.分生孢子 Conidia；D.附著孢 Appressorium

從圖2可以看出，菌株LX1菌絲稀少，絨毛狀，背面深灰色至黑色；培養(yǎng)初期菌落中央墨綠色呈放射狀，其上密生黑色小點，為分生孢子盤；菌落圓形生長，邊緣整齊；有黃色輪紋，后期輪紋消失，菌落全變墨綠色；菌落生長速度快，PDA上25 ℃培養(yǎng)5 d，直徑為53.15 mm；PDA上產(chǎn)孢慢，15 d左右產(chǎn)孢；分生孢子盤產(chǎn)生大量剛毛，淺褐色至深褐色，1～3個隔；不產(chǎn)菌核；分生孢子團乳白色；分生孢子月牙形，單孢，兩端較彎，大小為(14.4～23.8) μm×(2.7～3.7) μm；附著孢淺褐色至淺黑色，橢圓形，大小為(6.4～12.5) μm×(5.0～7.2) μm。參照真菌手冊以及植物病原真菌學(xué)[14-15]，初步將菌株LX1鑒定為大豆炭疽菌(C.truncatum)。

從圖3可以看出，菌株QY3菌落墨綠色，背面深灰色，粘附水珠，絨毛狀，圓形生長，邊緣菌絲白色；菌落始終無色素變化，生有黑色突起粒狀物；菌落生長速度慢，PDA上25 ℃培養(yǎng)5 d，直徑為22.24 mm；PDA上產(chǎn)孢慢，20 d左右產(chǎn)孢；喜堿性，pH為10時，培養(yǎng)5 d菌落直徑為36.62 mm；分生孢子盤產(chǎn)生大量剛毛，淺褐色至深褐色，2～3個隔；不產(chǎn)菌核；分生孢子近直，無色單孢，紡錘形；一側(cè)直，另一側(cè)略彎，大小為(14.7～19.0) μm×(3.4～4.5) μm；附著孢淺褐色至淺黑色，棍棒形或橢圓形，部分邊緣不規(guī)則，大小為(6.7～16.4) μm×(4.6～7.0) μm。與Damm等[16]、Kurt等[17]對菠菜炭疽菌的描述相似，初步將菌株QY3鑒定為菠菜炭疽菌(C.spinaciae)。

A.菌落 Colony；B.分生孢子盤及剛毛 Acervulus and setae；C.分生孢子 Conidia；D.附著孢 Appressorium

A.菌落 Colony；B.剛毛 Setae；C.分生孢子 Conidia；D.附著孢 Appressorium

從圖4可以看出，菌株QS3菌落淡黃色，背面白色，絨毛狀，圓形生長，邊緣整齊；后期分泌黃色色素，產(chǎn)生子囊殼，形成黑色產(chǎn)孢器；分生孢子團粉紅色；菌落生長速度快，PDA上25 ℃培養(yǎng)5 d，直徑為48.32 mm；PDA上產(chǎn)孢慢，30 d左右產(chǎn)孢；不產(chǎn)生剛毛；能觀察到有性態(tài)，子囊長棍狀，由8個子囊孢子構(gòu)成，子囊孢子紡錘形，大小為(12.3～17.5) μm×(3.3～6.3)μm；分生孢子盤不產(chǎn)剛毛；不產(chǎn)菌核；分生孢子橢圓形，無色單孢，兩端鈍圓，有的基部平截呈臍狀；含有1～3個油滴，大小為(10.5～17.7) μm×(5.4～7.4) μm；附著孢淺褐色至淺黑色，邊緣不規(guī)則，大小為(5.3～11.4) μm×(5.8～8.9)μm。其有性態(tài)及無性態(tài)特征與張?zhí)盏萚18]對博寧炭疽菌的描述相似，初步將菌株QS3鑒定為博寧炭疽菌(C.boninense)。

2.3 多基因聯(lián)合分析結(jié)果

以Colletotrichumlindemuthianum(CBS131.57)為外類群，將形態(tài)學(xué)鑒定出的炭疽菌代表菌株以N-J法構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。從圖5可知，菌株QY3與3株編號為CBS150.35、CBS125374、CBS128.57的菠菜炭疽菌在100%水平上聚為一支；菌株LX1與編號為CBS151.35的大豆炭疽菌在100%水平上聚為一支；菌株LX2與編號為CBS144.29的尖孢炭疽菌在100%水平上聚為一支；菌株QS3與編號為CBS128526的博寧炭疽菌在100%水平上聚為一支。

A.菌落 Colony；B.分生孢子 Conidia；C.子囊 Ascus；D.子囊孢子 Ascospore；E.附著孢 Appressorium

圖5 基于ITS、ACT、CHSⅠ、GAPDH合并序列以N-J法構(gòu)建的炭疽菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The N-J phylogenic tree of Colletotrichum based on the sequences of ITS,ACT,CHSⅠ and GAPDH

2.4 致病性鑒定結(jié)果

4種炭疽菌回接線辣椒的致病性鑒定結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，LX2、LX1和QY3接種的線辣椒均長出病斑，再次分離后得到和接種時相同的病原菌。QS3接種的線辣椒沒有病斑，但能再次分離到和接種相同的病原菌。由此可見，4種炭疽菌均具有在線辣椒果實上定殖的能力。同時從圖6可知，尖孢炭疽菌對線辣椒的致病力最強，其次是大豆炭疽菌，菠菜炭疽菌對線辣椒致病力較弱，博寧炭疽菌對線辣椒果實沒有致病力。

2.5 病原菌的生物學(xué)特性

將對線辣椒果實有致病力的尖孢炭疽菌、大豆炭疽菌和菠菜炭疽菌進行生物學(xué)特性研究，測定3種菌株在不同處理下5 d后的菌落直徑，12 d 后的產(chǎn)孢量。經(jīng)觀察，大豆炭疽菌和菠菜炭疽菌在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢慢，12 d時分生孢子無或極少，故將大豆炭疽菌和菠菜炭疽菌產(chǎn)孢量的測定時間分別定為17 d和22 d。

2.5.1 光照對菌株生長和產(chǎn)孢的影響 尖孢炭疽菌、大豆炭疽菌在24 h連續(xù)光照下菌落生長直徑最大；光照條件對菠菜炭疽菌菌絲生長的影響不大。大豆炭疽菌在24 h連續(xù)黑暗下產(chǎn)孢最好；尖孢炭疽菌在24 h連續(xù)光照下產(chǎn)孢最好；菠菜炭疽菌在光暗交替下產(chǎn)孢最好(表2)；光照能促進尖孢炭疽菌分泌色素。連續(xù)光照加快尖孢炭疽菌橘色色素的分泌(圖7)，大豆炭疽菌和菠菜炭疽菌無此現(xiàn)象。

A .LX2(尖孢炭疽菌C.acutatum)；B.LX1(大豆炭疽菌C.truncatum)；C.QY3(菠菜炭疽菌C.spinaciae)；D.QS3(博寧炭疽菌C.boninense)

圖6分離到的4種炭疽菌回接青線辣椒6d時的發(fā)病狀況
Fig.6ThediseasesymptomsofXianlajiaochilipepperinfectedbydifferentColletotrichumatthe6thdayaftervaccination

表2 光照條件對3種線辣椒致病炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響Table 2 The effects of light conditions on mycelium growth and sporulation of different Xianlajiao chili pepper Colletotrichum

注：數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，不同字母表示差異顯著(Plt;0.05)，下同。

Note：The data were shown as the mean±standard deviation,and different letters indicated significant difference atPlt;0.05.The same below.

A.連續(xù)黑暗 Continuous dark；B.光暗交替 Alternation of light and dark；C.連續(xù)光照 Continuous light

2.5.2 溫度對菌株生長和產(chǎn)孢的影響 從表3可以看出，大豆炭疽菌的生長溫度范圍為10～35 ℃，最適宜菌絲生長的溫度為30 ℃；尖孢炭疽菌和菠菜炭疽菌的生長溫度范圍為10～30 ℃，最適宜菌絲生長的溫度均為25 ℃；在5～25 ℃， 3種菌株菌絲的生長速度隨著溫度的升高加快。超過最適宜溫度后，3種菌株菌絲的生長速度隨著溫度的升高而減慢。大豆炭疽菌、尖孢炭疽菌和菠菜炭疽菌均在30 ℃時產(chǎn)孢最好。

表3 溫度對不同線辣椒炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響Table 3 The effects of temperature on mycelial conidial production of different Xianlajiao chili pepper Colletotrichum

2.5.3 pH對菌株生長和產(chǎn)孢的影響 從表4可知，3種炭疽菌的菌絲生長和產(chǎn)孢pH都為4～11；尖孢炭疽菌和大豆炭疽菌最適宜菌絲生長的pH為6～7；菠菜炭疽菌喜堿性，菌絲生長最適宜的pH為9～11。3種炭疽菌均在弱酸條件下易產(chǎn)孢，最適宜的產(chǎn)孢pH均為5～6。

2.5.4 碳源對菌株生長和產(chǎn)孢的影響 大豆炭疽菌在以淀粉和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲稀疏，在以果糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲潔白致密，菌落直徑最大,但在不同碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑大小差異不顯著，僅在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上能大量產(chǎn)孢。尖孢炭疽菌在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大，但菌絲稀疏，在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌株產(chǎn)孢最好。菠菜炭疽菌在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大，產(chǎn)孢最好，在其余碳源上產(chǎn)孢極少(表5)。

表4 pH對不同線辣椒炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響Table 4 The effects of pH value on mycelial conidial production of different Xianlajiao chili pepper Colletotrichum

表5 碳源對不同線辣椒炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響Table 5 The effects of carbon source on mycelium growth and sporulation of different Xianlajiao chili pepper Colletotrichum

2.5.5 氮源對菌株生長和產(chǎn)孢量的影響 大豆炭疽菌在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大，在以脯氨酸為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最好。尖孢炭疽菌在以酵母浸膏為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大，產(chǎn)孢最好。菠菜炭疽菌在以甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上菌絲最濃密，在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大，在以酵母浸膏為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最好，而在以硝酸鈉和苯丙氨酸為氮源的培養(yǎng)基上幾乎不產(chǎn)孢(表6)。

表6 氮源對不同線辣椒炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響Table 6 The effects of nitrogen source on mycelium growth and sporulation of different Xianlajiao chili pepper

3 討 論

炭疽病是辣椒上常見的真菌病害之一，主要發(fā)生在成熟的辣椒果實上，也在未成熟的辣椒果實、葉片和莖桿上發(fā)生[19]。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和多基因序列分析，陜西省線辣椒主產(chǎn)區(qū)發(fā)生的炭疽病主要由尖孢炭疽菌(C.acutatum)和大豆炭疽菌(C.truncatum)引發(fā)，它們對線辣椒有很強的侵染力。特別是尖孢炭疽菌，發(fā)病快，傳染力極強，其形態(tài)特征與夏花等[20]在湖南省芷江縣的辣椒上發(fā)現(xiàn)的尖孢炭疽菌基本相同。尖孢炭疽菌的寄主范圍很廣，具有很強的寄主組織?；?，能夠?qū)Ｒ坏匚：Σ葺?、蘋果、辣椒、枇杷、芒果、銀杏等的果實及甜橙花[21]。但在陜西省內(nèi)活體辣椒上發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌(C.acutatum)尚屬首次。關(guān)于尖孢炭疽菌生物學(xué)特性的研究報道很少，本研究結(jié)果與夏花[22]的研究結(jié)果基本一致，與唐景美[23]的部分研究結(jié)果有出入。本研究結(jié)果與夏花[22]的研究結(jié)果均表明尖孢炭疽菌在24 h連續(xù)光照下菌絲生長和產(chǎn)孢最好，而唐景美[23]的研究結(jié)果卻是在黑暗條件下菌絲生長最好，在光暗交替下產(chǎn)孢最好。產(chǎn)生這種差異的原因有待進一步研究。

大豆炭疽菌同樣是寄主范圍廣泛的一種重要病原菌，和辣椒炭疽菌、蔥炭疽菌等彎孢類炭疽菌在形態(tài)上相似，其形態(tài)特征與Ramdial等[24]在印度特立尼亞青椒上分離出比例高達72%的大豆炭疽菌形態(tài)特征基本一致。曾大興等[25]曾運用RAPD技術(shù)對38個不同寄主來源的彎孢類炭疽菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育及分類進行研究，結(jié)果顯示辣椒炭疽菌、大豆炭疽菌有很高的遺傳相似性，可能是同一個種，而國際上也普遍認為大豆炭疽菌和辣椒炭疽菌同物異名。本研究以多基因系統(tǒng)分析建立的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果為主要依據(jù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，將菌株LX1最終鑒定為大豆炭疽菌。關(guān)于大豆炭疽菌生物學(xué)特性的研究報道也很少。本研究結(jié)果表明，該菌菌絲生長的最適條件為30 ℃、24 h連續(xù)光照、pH 6～7，產(chǎn)孢的最適條件為30 ℃、24 h連續(xù)黑暗、pH 5～6，與孫志峰[26]對浙江大豆上的大豆炭疽菌的研究結(jié)果(菌絲生長的最適條件為30 ℃、24 h連續(xù)光照、pH 5～7，最佳碳氮源蔗糖、酵母粉)基本一致，其中一些小的差異，可能是地域差異造成。夏花等[22]對尖孢炭疽菌的研究結(jié)果就表明，該菌菌絲生長的最適溫度在湖南為28 ℃，在湖北則為22 ℃ 。

菠菜炭疽菌(C.spinaciae)最初被當(dāng)作黑線炭疽菌的小變體[27]，直到2009年Damm等[16]分離來自草本植物的97種彎孢類炭疽菌，采用多基因聯(lián)合分析方法，才將菠菜炭疽菌確認為一個獨立的種，該種與蔥類炭疽菌遺傳關(guān)系最近。本研究通過ITS、ACT、CHSⅠ和GPDH等4個基因聯(lián)合分析并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，將分離自陜西千陽縣線辣椒上的菌株QY3鑒定為菠菜炭疽菌。通過回接試驗，證實菠菜炭疽菌對線辣椒具有侵染力。這是首次在辣椒上發(fā)現(xiàn)菠菜炭疽菌。關(guān)于菠菜炭疽菌的生物學(xué)特性國內(nèi)尚未見報道。本研究結(jié)果表明，該菌在PDA上25 ℃培養(yǎng)20 d左右產(chǎn)孢，菌落生長直徑很?。粔A性環(huán)境可刺激菌絲的生長，麥芽糖能促進菌株產(chǎn)孢。此生理特征是由某種原因?qū)е拢€是菠菜炭疽菌具有的普遍特征，有待進一步研究。

博寧炭疽菌具有典型的分生孢子基部臍狀平截的特征，最初被鑒定為膠孢炭疽菌種群中的一種。2003年，Moriwaki等[28]首次在日本分離到博寧炭疽菌，通過ITS序列分析將其與膠孢炭疽菌區(qū)分，建立新的分類單元。2006年，云南昆明植物園蘭科植物上分離到的博寧炭疽菌并成為當(dāng)年中國新記錄的炭疽菌種[29]。該菌寄主廣泛，能夠危害油茶、春蘭、墨蘭、獼猴桃等作物[30-33]，尤其對石蒜科、蘭科、山龍眼科和茄科類作物有突出的侵染力[34]。2010年，F(xiàn)arr等[35]在巴西首次報道博寧炭疽菌能侵染辣椒。同年，國內(nèi)楊友聯(lián)[36]在貴州、云南、廣西等地采集的辣椒上也分離到1株博寧炭疽菌。楊友聯(lián)將該菌在PDA上培養(yǎng)，未能觀察到分生孢子基部臍狀平截的特征。本研究在陜西岐山縣采集的線辣椒上分離到1株博寧炭疽菌菌株，在PDA上培養(yǎng)能觀察到該特征。將該菌株以有傷方式接至健康的線辣椒，線辣椒果實無病斑，但分離病原菌時，有較少幾率能分離到與接種相同的病原菌。說明博寧炭疽菌對線辣椒的果實沒有致病力，但在線辣椒果實上有一定的定殖能力。

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CorrespondingauthorZHAO Zunlian,male,research fellow.Research area:pepper breeding and cultivation,E-mail:jimzhao@nwsuaf.edu.cn

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsibleeditor:GUOBaishou)

IdentificationandBiologicalCharacterizationofAnthraxBacteriainXianlajiaoChiliPepperinShaanxiProvince

YANG Jiawen1,ZHAO Zunlian1,ZHANG Guanqu2,XIE Fangqin2, JIANG Changyue1,ZHANG Yongxiang1,HAN Xiaoping3and XU Nailin4

(1.College of Horticulture,Northwest Aamp;F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.College of Plant Protection,Northwest Aamp;F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 3.Fuping Agricultural Technology Extension Centre,Fuping Shaanxi 711700,China; 4.Baoji Agricultural Technology Extension Centre,Baoji Shaanxi 721001,China)

In order to determine the types and biological characteristics of anthrax bacteria in Xianlajiao chili pepper in Shaanxi province,80 pepper fruit samples with anthracnose symptoms were collected from Baoji,the main production area of Xianlajiao Chili pepper in Shaanxi province and the pathogens were isolated and identified biological characteristics and sequence analyzed using Multi-gene combination method .The results showed that four different types of anthrax strain were identified from 80 samples,includingColletotrichumacutatum,Colletotrichumtruncatum,Colletotrichumspinaciae,andColletotrichumboninense,and their proportion were 83.75%,13.75%,1.25% and 1.25% respectively,C.acutatumpresented the strongest virulence to Xianlajiao pepper fruit,followed byC.truncatumandC.spinaciaewith weak pathogenicity,butC.boninensewas avirulence.The study of the biological characteristics analysis displayed the optimal environment and medium conditions for the hypha growth and spore production for every type of anthrax bacteria.ForC.acutatum,the optimal conditions for hypha growth included environment condition of 25 ℃ temperature,continuous illumination,and medium with pH 6,glucose for carbon source,yeast extract for nitrogen source,the optimal conditions for spore production included environment condition of 30 ℃ temperature,continuous illumination,and medium with pH 5-6,maltose for carbon source,yeast extract is for nitrogen source.ForC.truncatum,the optimal conditions for hypha growth and spore production were 30 ℃,continuous illumination,pH 7,fructose,peptone,and 30 ℃,continuous darkness,pH 5-6,maltose,proline,respectively.ForC.spinaciae,the optimal conditions for hypha growth and spore production were 30 ℃,continuous illumination,pH 9-11,maltose,peptone,and 30 ℃,continuous darkness,pH 5-6,maltose,peptone,respectively.This is the first report about the identification ofC.acutatumin Xianlajiao chili pepper in Shaanxi province,and the infection ofC.spinaciaeto Xianlajiao chili pepper is firstly reported in the world.

Xianlajiao chili pepper; Anthracnoses; Pathogen identification; Multi-gene combination analysis; Biological characteristics

2016-10-07

2017-04-14

Shaanxi Innovation Project of Science and Technology(No.2015KTCL02-20); Shaanxi Major Agro-technique Extension Service Pilot Project(No.2016SC-00).

YANG Jiawen,female,master student.Research area:pepper breeding and biotechnology,E-mail:jwyang10@163.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.034.html

2016-10-07

2017-04-14

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃(2015KTCL02-20)；陜西省重大農(nóng)技推廣服務(wù)試點項目(2016SC-00)。

楊佳文，女，碩士研究生，研究方向為辣椒育種與生物技術(shù)。E-mail:jwyang10@163.com

趙尊練，男，博士，研究員，研究方向為辣椒育種與栽培。E-mail:jimzhao@nwsuaf.edu.cn

S436.418

A

1004-1389(2017)11-1695-11