陶國(guó)翔，李愛秀*，張 敏，劉子泉

(1.武警后勤學(xué)院基礎(chǔ)部藥物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室，天津300309；2.武警后勤學(xué)院科研部，天津300309；3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 全軍災(zāi)害應(yīng)急救援醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300162)

漆酶與ABTS間的結(jié)合模式與作用機(jī)制研究

陶國(guó)翔1，李愛秀1*，張 敏2，劉子泉3

(1.武警后勤學(xué)院基礎(chǔ)部藥物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室，天津300309；2.武警后勤學(xué)院科研部，天津300309；3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 全軍災(zāi)害應(yīng)急救援醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300162)

選擇常見的電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)2,2′-連氮基-雙(3-乙基-苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)為研究對(duì)象，通過探究漆酶與ABTS之間的結(jié)合模式，在分子水平上揭示兩者的相互作用機(jī)制，為發(fā)掘漆酶新介質(zhì)、拓寬漆酶應(yīng)用范圍奠定理論基礎(chǔ)。首先，基于分子對(duì)接建立變色栓菌漆酶-ABTS復(fù)合物模型；然后，與枯草芽孢桿菌漆酶-ABTS復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，綜合兩復(fù)合物結(jié)合特點(diǎn)，在分子水平上闡明漆酶與ABTS間的作用機(jī)制。結(jié)果表明，ABTS結(jié)構(gòu)中的富電子基團(tuán)深入活性位點(diǎn)，且靠近電子接收位點(diǎn)組氨酸；漆酶活性位點(diǎn)內(nèi)多個(gè)中性氨基酸與ABTS發(fā)生疏水作用，穩(wěn)定結(jié)合構(gòu)象；最終在漆酶作用下ABTS生成陽(yáng)離子中間體發(fā)揮介導(dǎo)作用。

漆酶；ABTS；漆酶-ABTS體系；分子對(duì)接；作用機(jī)制

漆酶(laccase，EC1.10.3.2)作為一種含銅氧化酶，主要存在于真菌、細(xì)菌、植物或昆蟲的分泌物中[1-2]，其中真菌漆酶由于穩(wěn)定性強(qiáng)、產(chǎn)量大、氧化電勢(shì)高等優(yōu)勢(shì)，其理化性質(zhì)得到深入研究，目前已有100種真菌漆酶得到純化，38個(gè)真菌漆酶晶體結(jié)構(gòu)得到解析[3]。其中，變色栓菌漆酶是真菌漆酶中高產(chǎn)優(yōu)良品種，常作為研究漆酶結(jié)構(gòu)和功能的首選。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中有關(guān)變色栓菌漆酶的晶體結(jié)構(gòu)編號(hào)為1KYA和1GYC，其中1KYA為變色栓菌漆酶內(nèi)嵌配體的晶體結(jié)構(gòu)，有助于確定漆酶結(jié)合位點(diǎn)及底物活性構(gòu)象，為研究漆酶-底物間的結(jié)合模式與作用機(jī)制提供重要參考。

漆酶通過所含銅離子與底物之間的電子傳遞實(shí)現(xiàn)了對(duì)酚類、芳香胺類等漆酶天然底物的催化氧化[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在漆酶催化體系中加入一種小分子“介質(zhì)”(mediator)，兩者共同構(gòu)成“漆酶-介質(zhì)體系(laccase mediator system，LMS)”[5]，在LMS中，介質(zhì)充當(dāng)漆酶與底物之間電子傳遞的“電子梭”，減少漆酶與底物間空間阻礙，并間接提高漆酶氧化電勢(shì)，從而提升電子傳遞效率，實(shí)現(xiàn)了漆酶對(duì)更多底物的催化氧化，拓寬了作用底物范圍，同時(shí)提高了催化效率[6]。

高活性化合物2,2′-連氮基-雙(3-乙基-苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)是漆酶的特殊底物，也是使用最廣泛的介質(zhì)之一[7]，這是由于ABTS在漆酶作用下的氧化產(chǎn)物較ABTS穩(wěn)定性更強(qiáng)，可通過測(cè)定氧化產(chǎn)物的含量最終確定漆酶的活性[8]。作為介質(zhì)，ABTS充當(dāng)“電子梭”在漆酶和底物之間發(fā)揮電子傳遞作用，最終使底物降解。ABTS用于LMS的首次報(bào)道是漆酶-ABTS體系對(duì)紙漿中殘余木質(zhì)素的降解[5]，該體系對(duì)木質(zhì)素的高效降解實(shí)現(xiàn)了對(duì)這類可再生資源的高值化利用[9]；工業(yè)中，漆酶-ABTS體系可高效降解廢水中的含氮雜環(huán)化合物[10-11]；農(nóng)業(yè)中，漆酶-ABTS體系可對(duì)土壤、水體、大氣中殘留的有機(jī)磷酸酯農(nóng)藥進(jìn)行降解[12]。漆酶-ABTS體系對(duì)多種底物的催化降解，在多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，但是ABTS具有一定毒性和刺激性，且合成成本較高，限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用，對(duì)漆酶-ABTS體系的深入研究，揭示分子機(jī)制并發(fā)掘新介質(zhì)，有助于克服其自身缺陷，進(jìn)一步開發(fā)LMS的應(yīng)用潛力。

目前，已有研究者提出在漆酶作用下ABTS電子轉(zhuǎn)移的變化過程[13]：ABTS被氧化后分兩步失去電子最終生成陽(yáng)離子ABTS2+，在ABTS2+的介導(dǎo)下漆酶實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的催化降解，見圖1。但是，變色栓菌漆酶與ABTS分子間的結(jié)合模式及其相互作用機(jī)制尚不清楚。作者通過分子對(duì)接技術(shù)建立變色栓菌漆酶-ABTS復(fù)合物，并與已解析的枯草芽孢桿菌漆酶-ABTS晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比[14]，驗(yàn)證變色栓菌漆酶-ABTS復(fù)合物的合理性并探究其分子作用機(jī)制，為漆酶結(jié)構(gòu)改造、發(fā)現(xiàn)新介質(zhì)等奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 ABTS電子轉(zhuǎn)移機(jī)制示意圖Fig.1 The schematic diagram of electron transfermechanism of ABTS

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 技術(shù)平臺(tái)

本研究所有計(jì)算在PC機(jī)上進(jìn)行，利用分子模擬與分子設(shè)計(jì)軟件包(molecula operating environment，MOE 2009)完成。

1.2 漆酶和介質(zhì)結(jié)構(gòu)

真菌漆酶結(jié)構(gòu)來源于變色栓菌漆酶-底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)：1KYA)，將1KYA漆酶晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入MOE軟件包，刪除雜原子、溶劑分子、配體分子等，保留漆酶A鏈，在Amber99力場(chǎng)下，采用Protonate 3D模塊對(duì)其加氫加電荷，作為漆酶初始構(gòu)象[15]。細(xì)菌漆酶結(jié)構(gòu)來源于枯草芽孢桿菌漆酶-ABTS復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)：3ZDW)。

介質(zhì)ABTS結(jié)構(gòu)使用MOE-Build模塊繪制，并在Conformation search模塊下進(jìn)行構(gòu)象搜索，保留最低能量構(gòu)象為對(duì)接初始構(gòu)象。

1.3 研究方法

在MOE-Dock模塊下進(jìn)行分子對(duì)接，以變色栓菌漆酶配體為中心，配體5 ?范圍內(nèi)氨基酸構(gòu)成的疏水區(qū)域?yàn)閷?duì)接位點(diǎn)，設(shè)置力場(chǎng)為MMFF94x，放置函數(shù)為Triangle Mather，打分函數(shù)為L(zhǎng)ondon dG，優(yōu)化函數(shù)為Forcefield，對(duì)接完成后，選取介質(zhì)分子及對(duì)接位點(diǎn)氨基酸，在MMFF94x力場(chǎng)下進(jìn)行能量?jī)?yōu)化[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 漆酶與ABTS的結(jié)合模式與作用機(jī)制

漆酶與ABTS相互作用示意圖見圖2。

a.變色栓菌漆酶-ABTS的3D結(jié)合模式 b.變色栓菌漆酶-ABTS的2D相互作用 c.枯草芽孢桿菌漆酶-ABTS的3D結(jié)合模式 d.枯草芽孢桿菌漆酶-ABTS的2D相互作用圖2 漆酶與ABTS相互作用示意圖Fig.2 The schematic diagram of interaction between laccase and ABTS

從分子對(duì)接得到變色栓菌漆酶-ABTS的3D結(jié)合模式圖(圖2a)可知，ABTS結(jié)構(gòu)中連氮基和與其相連的噻唑環(huán)深入到活性位點(diǎn)中，磺酸基暴露在活性位點(diǎn)外。從變色栓菌漆酶-ABTS的2D相互作用(圖2b)進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，ABTS失去電子后的ABTS2+與漆酶活性位點(diǎn)中的Ala161、Phe162、Leu164、Phe265、Gly392和Ala393產(chǎn)生疏水作用，并且介質(zhì)中間體氮陽(yáng)離子與Phe265產(chǎn)生π-陽(yáng)離子相互作用。堿性氨基酸His458作為電子受體接收來自介質(zhì)的電子，與酸性氨基酸Asp206共同維持體系pH值穩(wěn)定。

來自細(xì)菌的枯草芽孢桿菌漆酶內(nèi)嵌ABTS的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)已得到解析，晶體結(jié)構(gòu)中漆酶與ABTS間的結(jié)合模式能較好地體現(xiàn)相互作用時(shí)的特點(diǎn)。利用MOE軟件包圖形顯示功能得到枯草芽孢桿菌漆酶-ABTS的3D結(jié)合模式(圖2c)，該漆酶活性位點(diǎn)空腔淺而寬，ABTS結(jié)構(gòu)中富含電子的連氮基和與其相連的噻唑環(huán)呈現(xiàn)“U”型形狀深入活性位點(diǎn)內(nèi)部，該結(jié)合模式利于ABTS與漆酶間的電子傳遞。從枯草芽孢桿菌漆酶-ABTS的2D相互作用(圖2d)發(fā)現(xiàn)，漆酶活性位點(diǎn)內(nèi)的中性氨基酸Pro226、Ala227、Cys229、Cys322、Gly323和Pro384與ABTS發(fā)生疏水作用。

通過對(duì)比兩個(gè)復(fù)合物結(jié)合模式發(fā)現(xiàn)，ABTS結(jié)構(gòu)中富含電子的連氮基和與其相連的噻唑環(huán)均深入到漆酶活性位點(diǎn)，這種結(jié)合模式有助于ABTS與漆酶發(fā)生電子傳遞，漆酶-ABTS的2D相互作用圖證實(shí)了以上推斷，ABTS在漆酶作用下發(fā)生電子傳遞后生成ABTS2+。漆酶-ABTS相互作用過程中，漆酶活性位點(diǎn)內(nèi)的中性氨基酸和堿性氨基酸組氨酸在二者相互作用過程中發(fā)揮重要作用。

2.2 討論

我們?cè)谇捌谘芯苛硗庖环N機(jī)制的介質(zhì)——?dú)滢D(zhuǎn)移介質(zhì)時(shí)，已建立了得到驗(yàn)證的漆酶-介質(zhì)對(duì)接模型[17]。本研究采取相同的對(duì)接參數(shù)得到變色栓菌漆酶-ABTS復(fù)合物。在該復(fù)合物中ABTS與漆酶結(jié)合穩(wěn)定，且結(jié)合構(gòu)象與復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中ABTS的結(jié)合構(gòu)象相似；其中，漆酶-ABTS相互作用的氨基酸類型、數(shù)目、強(qiáng)度等與復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中漆酶-ABTS相互作用特點(diǎn)相似?？梢钥闯觯瑥?fù)合物在漆酶-ABTS結(jié)合穩(wěn)定性、ABTS結(jié)合構(gòu)象和氨基酸相互作用方面與復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出相似的結(jié)合特點(diǎn)，也進(jìn)一步說明所建立的變色栓菌漆酶-ABTS復(fù)合物模型是可靠的。

綜合漆酶-ABTS復(fù)合物和復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)3ZDW的結(jié)合模式分析發(fā)現(xiàn)，漆酶與ABTS相互作用時(shí)，ABTS結(jié)構(gòu)中的連氮基和噻唑環(huán)靠近活性位點(diǎn)的電子受體組氨酸His458/His497，可順利完成電子傳遞；活性位點(diǎn)的中性氨基酸與ABTS產(chǎn)生較強(qiáng)的疏水作用，穩(wěn)定了ABTS與漆酶之間的結(jié)合構(gòu)象，在中性氨基酸的疏水作用下，ABTS發(fā)生電子傳遞，生成陽(yáng)離子中間體，該陽(yáng)離子中間體在漆酶與底物之間發(fā)生電子傳遞起到介導(dǎo)催化反應(yīng)的作用。

前期研究還發(fā)現(xiàn)，氫轉(zhuǎn)移介質(zhì)與漆酶產(chǎn)生作用的關(guān)鍵是酸性氨基酸Asp206與介質(zhì)中的供氫基團(tuán)之間的氫鍵作用[17]，而本研究的電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)ABTS并不與漆酶活性位點(diǎn)中的酸性氨基酸產(chǎn)生氫鍵作用，起主導(dǎo)作用的氨基酸為活性位點(diǎn)內(nèi)的中性氨基酸和組氨酸。由此可見，介質(zhì)在生成介質(zhì)中間體過程中遵循不同反應(yīng)機(jī)制的介質(zhì)與漆酶發(fā)生相互作用時(shí)，起主導(dǎo)作用的氨基酸類型是不同的。

3 結(jié)論

通過分子對(duì)接得到變色栓菌漆酶-ABTS復(fù)合物模型，并與枯草芽孢桿菌漆酶-ABTS復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)作對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合模式相似，從中總結(jié)出電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)ABTS與漆酶之間的結(jié)合模式與作用機(jī)制，提出了不同介導(dǎo)機(jī)制的介質(zhì)與漆酶反應(yīng)時(shí)，起主導(dǎo)作用的氨基酸的差異。主要表現(xiàn)在，漆酶-ABTS相互作用時(shí)，富含電子的基團(tuán)深入漆酶活性位點(diǎn)中，該基團(tuán)接近電子接收位點(diǎn)組氨酸利于發(fā)生電子傳遞，ABTS與漆酶活性位點(diǎn)中的中性氨基酸發(fā)生疏水作用，維持了ABTS與漆酶相互作用時(shí)構(gòu)象的穩(wěn)定，這對(duì)于反應(yīng)的發(fā)生起到關(guān)鍵作用。

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BindingModeandInteractionMechanismofLaccaseandABTS

TAO Guo-xiang1，LI Ai-xiu1*，ZHANG Min2，LIU Zi-quan3

(1.DrugDesignLaboratoryoftheBasicScienceDepartment，LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce，Tianjin300309，China;2.ScientificResearchDepartment，LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce，Tianjin300309，China；3.KeyLaboratoryofDisasterandEmergencyRescueMedicine，AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce，Tianjin300162，China)

In order to find new mediators and provide a theoretical basis for further study on extending the application scope of laccase,we selected the electron transfer mediator—2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) as an object to reveal the binding mode and interaction mechanism at the molecular level between laccase and ABTS.On the basis of molecular docking,we built a complex model ofTrametesversicolorlaccase-ABTS,and compared the crystal structure ofBacillussubtilislaccase-ABTS complex.Moreover,we explained the interaction mechanism of laccase and ABTS at the molecular level with the binding characteristics of two complexes.The results indicated that the rich electronics group in ABTS penetrated into the laccase active site,and approached the electron acceptor histidine.Many neutral amino acids interacted with ABTS by hydrophobic interaction at laccase active site,and stablilized the binding conformation.Finally，ABTS turned into cationic intermediate and played a mediated role under the action of laccase.

laccase；ABTS；laccase-ABTS system；molecular docking；interaction mechanism

武警后勤項(xiàng)目(WJHQ2012-14)，武警后勤學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目(WHZ201201)，天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目(2015KZ123)，武警后勤學(xué)院基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(WHJ2016025)

2017-06-30

陶國(guó)翔(1991-)，男，河北南宮人，碩士研究生，研究方向：計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，E-mail：taoguoxiang91@126.com；通訊作者：李愛秀，教授，E-mail：liaixiu2006@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.006

陶國(guó)翔，李愛秀，張敏，等.漆酶與ABTS間的結(jié)合模式與作用機(jī)制研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(11)：23-26.

O641 Q814.9

A

1672-5425(2017)11-0023-04