崔建強，賴普輝

(陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院,陜西 西安 710246)

響應曲面法優(yōu)化野菊花中總黃酮的超聲提取工藝

崔建強，賴普輝

(陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院,陜西 西安 710246)

以總黃酮得率為評價指標，采用單因素實驗和響應曲面法實驗優(yōu)化野菊花中總黃酮超聲提取工藝。確定最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)60%、超聲提取時間40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超聲提取溫度50 ℃、超聲功率1 080 W，在此條件下，總黃酮得率可達0.881%。該提取工藝設計合理，為進一步研究野菊花中總黃酮的應用提供了科學依據(jù)。

總黃酮；超聲波；響應曲面法

野菊花(Chrysanthemumindicum)是菊科植物野菊花的干燥頭狀花序，在我國分布廣泛[1]。其內(nèi)含有大量的黃酮類化合物，黃酮類化合物具有多種藥理活性，如清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[2-3]。超聲提取工藝是一種新型提取方法，具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點[4]。作者在單因素實驗的基礎上，以總黃酮得率為評價指標，通過響應曲面法優(yōu)化野菊花中總黃酮的超聲提取工藝，擬為研究野菊花中總黃酮的應用提供科學依據(jù)。

1 實驗

1.1材料、試劑與儀器

野菊花，購于西安萬壽路中藥材市場。

蘆丁標準品、無水乙醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；石油醚，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；蒸餾水，自制；5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液，分析純，上海友思生物技術公司。

智能型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；低溫恒溫箱、多用途恒溫超聲波提取機，無錫德譜儀器制造有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；GY-753型粉碎機，天津泰斯特儀器有限責任公司；紫外可見分光光度計，上海圣科儀器設備有限公司。

1.2野菊花預處理

挑選品質(zhì)優(yōu)良的野菊花在80 ℃干燥5 h，用粉碎機粉碎成細粉，過60目篩。精密稱取野菊花粉末5 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL石油醚于70 ℃水浴鍋中回流3 h，除去脂肪。

1.3 總黃酮得率的測定

1.3.1 蘆丁標準溶液的配制

精密稱取蘆丁標準品5 mg，加入甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，即得到濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。

1.3.2 檢測波長的確定

取蘆丁標準溶液，在400～600 nm范圍內(nèi)全波長掃描。結果發(fā)現(xiàn)，蘆丁標準品在510 nm處出現(xiàn)最大吸收峰。因此，以510 nm作為檢測波長[5]。

1.3.3 標準曲線的繪制

分別精密吸取蘆丁標準溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min；加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min；加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min。用紫外可見分光光度計在510 nm處測吸光度。以吸光度為縱坐標、蘆丁標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。擬合線性回歸方程為y=13.209x+0.2418，R2=0.9912，線性范圍為8～40 μg·mL-1。

1.3.4 總黃酮得率的計算

稱取預處理過的野菊花粉末5 g，超聲提取得到一定量的浸膏。將浸膏用無水乙醇溶解定容在V1容量瓶中，稀釋一定倍數(shù)，按1.3.3方法測定510 nm處吸光度，按下式計算總黃酮得率。

式中：W0為總黃酮含量,mg·mL-1；V1為樣液總體積，mL；W為野菊花粉末質(zhì)量，g;N為稀釋倍數(shù)。

1.4 提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗

分別稱取野菊花粉末5 g，在保持其它條件不變的情況下進行超聲提取，依次考察超聲提取時間(30 min、40 min、50 min、60 min)、超聲提取溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，mL∶g)、乙醇體積分數(shù)(20%、40%、60%、80%)、超聲功率(720 W、900 W、1 080 W、1 260 W)5個因素對總黃銅得率的影響。

1.4.2 響應曲面法實驗

依據(jù)單因素實驗結果，找出對總黃酮得率影響最大的4個因素，采用Box-Behnken實驗設計3個水平進行響應曲面法實驗，根據(jù)響應曲面構建的三維圖確定最佳超聲提取工藝。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果(圖1)

圖1 單因素實驗結果Fig.1 Results of single-factor experiment

從圖1可以看出，超聲功率(圖1c)對總黃酮得率的影響最小，當超聲功率為1 080 W時，總黃酮得率最大。原因可能是，當超聲功率增大時，超聲波強度會使空化閥逐漸升壓，產(chǎn)生空化作用，當空化作用最強時提取率最佳；當超聲功率超過空化閥升壓后，會產(chǎn)生反作用，使提取率降低。因此考慮到高效、節(jié)能，選擇1 080 W為最佳超聲功率。其它4個因素通過響應曲面法優(yōu)化。

2.2 響應曲面法實驗結果

2.2.1 實驗設計

根據(jù)單因素實驗結果，選取乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間、液料比、超聲提取溫度作為自變量，以總黃酮得率為響應值，通過Box-Behnken實驗設計，構建三維數(shù)學模型優(yōu)化總黃酮的超聲提取工藝[6-8]。實驗的因素與水平見表1，響應曲面法實驗結果見表2。

表1實驗的因素與水平

Tab.1Factors and levels of experiment

表2響應曲面法實驗結果

Tab.2Results of response surface methodology experiment

2.2.2 數(shù)學模型的建立及顯著性檢驗結果

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多項式的回歸方程擬合，得到回歸方程模型為：Y=0.86-0.034A+7.712×10-3B+0.021C-5.291×10-3D+0.017AB-0.015AC+0.021AD-7.500×10-4BC-0.051BD+0.021CD-0.093A2-0.12B2-0.077C2-0.12D2(R2=0.9227，Plt;0.0001)。通過采用響應面的ANOVA來進行回歸參數(shù)分析，檢驗回歸方程模型和各項參數(shù)的顯著性,結果如表3所示。

表3響應面回歸模型的方差分析

Tab.3Variance analysis of regression equation model for response surface

注：***表示Plt;0.0001，差異極顯著；**表示Plt;0.01，差異較顯著；*表示Plt;0.05，差異顯著。

2.2.3 交互作用的分析和優(yōu)化

乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間、液料比和超聲提取溫度4個實驗參數(shù)兩兩交互作用對總黃酮得率影響的趨勢圖如圖2所示。

從圖2a可以看出，超聲提取時間的坡面比乙醇體積分數(shù)的坡面平緩，說明乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率影響較為顯著；二者等高線圖趨于圓形，說明二者交互作用對總黃酮得率無顯著影響，由等高線可以確定的最佳參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)60%，超聲提取時間40 min。

從圖2b可以看出，液料比的坡面比乙醇體積分數(shù)的坡面平緩，說明乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率影響較為顯著；二者等高線圖趨于圓形，說明二者交互作用對總黃酮得率無顯著影響，由等高線可以確定的最佳參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)60%，液料比15∶1。

由圖2c可以看出，超聲提取溫度的坡面比乙醇體積分數(shù)的坡面平緩，說明乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率影響相對較為顯著；二者等高線圖趨于橢圓形，說明二者交互作用對總黃酮得率有顯著影響，由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)60%，超聲提取溫度50 ℃。

由圖2d可以看出，液料比的坡面比超聲提取時間的坡面陡峭，說明液料比對總黃酮得率影響相對較為顯著；二者等高線趨于圓形，說明二者交互作用對總黃酮得率無顯著影響，由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)為：液料比15∶1,超聲提取時間40 min。

由圖2e可以看出，超聲提取時間的坡面比超聲提取溫度的坡面陡峭，說明超聲提取時間對總黃酮得率影響相對顯著；二者等高線圖趨于橢圓形，說明二者交互作用對總黃酮得率有顯著影響，由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)為：超聲提取溫度50 ℃，超聲提取時間40 min。

由圖2f可以看出,液料比的坡面比超聲提取溫度的坡面陡峭，說明液料比對總黃酮得率有顯著影響；二者等高線圖趨于橢圓形，說明二者交互作用對總黃酮得率有顯著影響，由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)為：液料比15∶1,超聲提取溫度50 ℃。

由響應曲面圖可得出最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)60%，超聲提取時間40 min，液料比15∶1，超聲提取溫度50 ℃。

圖2 等高線圖和三維圖 Fig.2 The contour map and the response surface map

2.2.4 回歸模型驗證

從2.2.3響應曲面的圖形可以看出有最大的響應值，通過軟件分析，預測最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)60%、超聲提取時間40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超聲提取溫度50 ℃、超聲功率1 080 W，在此條件下，進行3次驗證實驗，總黃酮平均得率為0.881%，與預測值相符。表明該模型設計合理。

3 結論

通過單因素實驗和響應曲面法實驗確定超聲提取野菊花中總黃酮的最佳工藝為：乙醇體積分數(shù)60%、超聲提取時間40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超聲提取溫度50 ℃、超聲功率1 080 W。對該工藝參數(shù)進行了驗證，總黃酮得率為0.881%。該提取工藝設計合理，為進一步研究野菊花中總黃酮的應用提供了科學依據(jù)。

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OptimizationinUltrasonicExtractionofTotalFlavonoidsinChrysanthemumindicumbyResponseSurfaceMethodology

CUI Jian-qiang，LAI Pu-hui

(SchoolofMedicine,ShaanxiInstituteofInternationalTradeamp;Commerce，Xi′an710246，China)

Using total flavonoids yield as an evaluation index,we optimized the extraction process of total flavonoids fromChrysanthemumindicumby a single-factor experiment and a response surface methodology.The optimum extraction process could be determined as follows:ethanol volume fraction of 60%,ultrasonic extraction time of 40 min,extraction temperature of 50 ℃,liquid-solid ratio of 15∶1(mL∶g),and ultrasonic power of 1 080 W.Under above conditions,the total flavonoids yield reached 0.881%.The extraction process is designed rationally,which provides a scientific basis for the further research on the application of total flavonoids fromChrysanthemumindicum.

total flavonoids；ultrasound；response surface methodology

陜西國際商貿(mào)學院科研項目(SMXY201715)

2017-07-07

崔建強(1979-)，男，陜西西安人，講師，研究方向：藥物分析化學，E-mail:1030287236@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.008

崔建強,賴普輝.響應曲面法優(yōu)化野菊花中總黃酮的超聲提取工藝[J].化學與生物工程，2017，34(11)：30-34，48.

TQ461

A

1672-5425(2017)11-0030-05