雒江菡,于瑞洪，閻 紅

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150001；2.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025)

魚腥草多糖提取工藝及抑菌活性研究

雒江菡1,于瑞洪2，閻 紅1

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150001；2.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025)

以魚腥草為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了魚腥草多糖的提取工藝，并對其抑菌活性進(jìn)行了研究。確定最優(yōu)提取工藝條件為：提取溫度80 ℃、料液比1∶40(g∶mL)、提取時(shí)間6 h，在此條件下，提取率為9.74%。魚腥草多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌作用，而對枯草芽孢桿菌無明顯的抑菌作用。該研究對魚腥草在食品和藥品等方面的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

魚腥草多糖；提取工藝；抑菌活性

魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)，又名折耳根、豬鼻孔、顫兒根、臭根草、魚鱗草等,在我國長江以南的各個(gè)地區(qū)分布較廣，尤其以湖南、貴州、湖北、四川等省居多。魚腥草活性成分較多，除含有揮發(fā)性成分外，還含有酚類物質(zhì)、黃酮類、生物堿、有機(jī)酸和多糖等物質(zhì)[1]。具有利尿通淋、清熱解毒、消腫排膿等作用。魚腥草是藥食兩用的植物資源，極具開發(fā)潛力，受到人們的廣泛關(guān)注。多糖是一類重要的具有生物活性的大分子物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫力以及降血糖等功效[2]。目前，國內(nèi)外關(guān)于多糖提取工藝的研究較多，但以魚腥草為原料進(jìn)行多糖提取的工藝研究甚少。作者以魚腥草為原料提取魚腥草多糖，對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開發(fā)魚腥草的藥用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

魚腥草，北京同仁堂。

葡萄糖(分析純)，天津天力化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有公司；營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，中科院微生物研究所。

紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；DZTW型調(diào)溫電熱套，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；BSA223S-CW型精密電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取

準(zhǔn)確稱取干燥、剪碎的魚腥草樣品2 g，將其置于回流裝置中，加入一定量的水，在一定溫度下水浴加熱提取一定時(shí)間；濾去殘?jiān)?，收集濾液，離心得上清液，濃縮至10 mL，加入濃縮液5倍量的95%乙醇進(jìn)行醇析；第2 d，除去上清液，將醇析物蒸干得魚腥草多糖提取物；加入蒸餾水溶解，定容至10 mL，再將多糖水溶液轉(zhuǎn)至離心管中，加入等體積的Sevage試劑混合振蕩20 min，離心，取上清液，重復(fù)3次；合并得到魚腥草多糖粗品，定容至100 mL，進(jìn)行多糖含量測定[3]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸比色法[4]。精密稱取干燥至恒重的葡萄糖0.010 g，加水定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10 mL 具塞比色管中，補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，精密加入5%苯酚1 mL，混合均勻后快速加入濃硫酸5 mL，搖勻后置于沸水浴中保溫15 min，取出，室溫放置15 min，在紫外可見分光光度計(jì)的495 nm 波長處，以蒸餾水調(diào)零，測定各組的吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.6207x+0.0079(A為吸光值；x為葡萄糖濃度，mg·mL-1)，R2=0.9992。

多糖提取率的測定：將魚腥草多糖粗品利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用水定容到100 mL，取1 mL進(jìn)行含量測定。魚腥草多糖提取率按下式計(jì)算：

式中：c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的多糖含量，mg·mL-1；N為稀釋倍數(shù)；V為多糖樣品的測定體積，mL；m為魚腥草質(zhì)量,mg。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

采用濾紙片法測定魚腥草多糖的抑菌活性。將吸水性強(qiáng)的定性濾紙用打孔器制作成直徑為6 mm 的圓形濾紙片，高壓蒸汽滅菌。將已滅菌的細(xì)菌培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，倒平板；凝固后取0.1 mL供試菌進(jìn)行涂布，將蘸有魚腥草多糖的濾紙片放在涂布后的平板上，每種菌種做3個(gè)平行；然后將帶有濾紙片的培養(yǎng)皿正置于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，取出，測量抑菌圈直徑，取其平均值[5]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

在80 ℃下，采用80 mL水對魚腥草樣品進(jìn)行提取，考察提取時(shí)間(3 h、4 h、5 h、6 h、7 h)對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.1 The effect of extraction time on thepolysaccharides extraction rate

由圖1可知，多糖提取率隨提取時(shí)間的延長而升高，提取5 h后，多糖提取率上升緩慢。加入提取溶劑水后，水通過滲透作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，魚腥草內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得松軟，有利于多糖有效成分的浸出。浸提初期，魚腥草內(nèi)有效成分開始浸出，并逐漸形成濃度差，使有效成分浸出量逐漸增多，隨著提取時(shí)間的延長，濃度差減小并逐漸趨于平衡。因此，水提法魚腥草多糖提取時(shí)間選擇5 h。

2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響

采用80 mL水對魚腥草樣品提取5 h，考察提取溫度(60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃)對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著提取溫度的升高，多糖提取率逐漸升高；但當(dāng)提取溫度升高到80 ℃以后，多糖提取率略有降低。這可能是因?yàn)?，提取溫度升高，多糖分子運(yùn)動能力增強(qiáng)，易于從魚腥草中轉(zhuǎn)移到浸提液中，但較高的提取溫度使多糖分子降解。因此，水提法魚腥草多糖提取溫度選擇80 ℃。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on thepolysaccharides extraction rate

2.1.3 料液比對多糖提取率的影響

在80 ℃下，分別采用20 mL、40 mL、60 mL、80 mL、100 mL水對魚腥草樣品提取5 h，考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on thepolysaccharides extraction rate

由圖3可知，多糖提取率隨著提取溶劑量的增加逐漸升高。這主要是由于，當(dāng)提取溶劑量較少時(shí)，溶劑中的多糖分子達(dá)到飽和，從而抑制魚腥草中多糖分子的溶出，因此，隨著提取溶劑量的增加，多糖提取率升高；當(dāng)料液比為1∶40后，多糖提取率變化不大，這或許是魚腥草中多糖成分已基本溶出。另外，提取溶劑不宜過多，因?yàn)檫^多的溶劑增加了提純和濃縮的工作量。因此，水提法魚腥草多糖提取的料液比選擇1∶40。

通過單因素實(shí)驗(yàn)可知，魚腥草多糖提取最佳工藝條件為：提取時(shí)間5 h，提取溫度80 ℃，料液比1∶40。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝條件，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(33)正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2。

表1正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1Factors and levels of orthogonal experiment

表2正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

Tab.2Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，最優(yōu)水平組合為：提取溫度80 ℃、料液比1∶40、提取時(shí)間6 h，提取率為9.74%，此時(shí)魚腥草多糖濃度為5.19 mg·mL-1。極差分析結(jié)果表明，在3個(gè)因素中，影響魚腥草多糖提取的主次順序?yàn)椋毫弦罕萭t;提取溫度gt;提取時(shí)間。其中料液比對魚腥草多糖提取的影響最大，提取時(shí)間的影響最小，優(yōu)化后的工藝條件跟單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似。

2.3 抑菌活性研究

采用最佳工藝條件(提取溫度80 ℃、料液比1∶40、提取時(shí)間6 h)下提取的魚腥草多糖進(jìn)行枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性研究，結(jié)果見表3。

由表3可知，魚腥草多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用更強(qiáng)，而對枯草芽孢桿菌抑菌作用并不明顯。

表3魚腥草多糖抑菌效果比較

Tab.3Bacteriostasis comparison ofpolysaccharides from Houttuynia cordata Thunb.

3 結(jié)論

以魚腥草為原料，采用水提法提取魚腥草多糖。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)分析可知，影響魚腥草多糖提取因素的主次順序?yàn)椋毫弦罕萭t;提取溫度gt;提取時(shí)間，最優(yōu)工藝條件為：提取溫度80 ℃、料液比1∶40(g∶mL)、提取時(shí)間6 h，在此條件下，提取率為9.74%，此時(shí)魚腥草多糖濃度為5.19 mg·mL-1。

魚腥草多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用更強(qiáng)，而對枯草芽孢桿菌無明顯的抑菌作用。魚腥草中多糖含量較高，并且具有一定的抑菌作用，具有廣闊的研發(fā)前景。

[1] 伍賢進(jìn)，李勝華，盧紅梅，等.魚腥草不同部位揮發(fā)油組分分析及其抗菌活性研究[J].中國抗生素雜志，2014，39(9)：1001-1003.

[2] 蘇杰，李娜，惠伯棣，等.魚腥草作為保健食品原料潛力的概述[J].食品工業(yè)科技，2017，38(6):391-396.

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[5] NIE S P,XIE M Y.A review on the isolation and structure of tea polysaccharides and their bioactivities[J].Food Hydrocolloids，2011，25:144-149.

ExtractionProcessandBacteriostasisofPolysaccharidesfromHouttuyniacordataThunb.

LUO Jiang-han1，YU Rui-hong2,YAN Hong1

(1.InstituteofCellandMolecularBiology,CollegeofPharmaceuticalSciences，
HarbinUniversityofCommerce，Harbin150001,China;2.HeilongjiangVocationalCollegeofBiologyScienceandTechnology,Harbin150025,China)

UsingHouttuyniacordataThunb. as a raw material,we investigated the extraction process of polysaccharides fromHouttuyniacordataThunb. by a single-factor experiment and an orthogonal experiment,and studied bacteriostasis of polysaccharides.The optimum extraction conditions were determined as follows：extraction temperature was 80 ℃，solid-liquid ratio was 1∶40(g∶mL),and extraction time was 6 h.Under above conditions,the extraction rate was 9.74%.Polysaccharides fromHouttuyniacordataThunb.strongly inhibited the growth ofEscherichiacoliandStaphylococcusaureus,and weakly inhibited the growth ofBacillussubtilis.This study lays the foundation for further development and application ofHouttuyniacordataThunb.in food and drug fields.

polysaccharides fromHouttuyniacordataThunb.;extraction process；bacteriostasis

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610240007)

2017-06-20

雒江菡(1980-)，女，山東寧津人，博士，講師，研究方向：中藥學(xué)，E-mail:649993192@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.007

雒江菡,于瑞洪，閻紅.魚腥草多糖提取工藝及抑菌活性研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(11)：27-29，43.

TQ461

A

1672-5425(2017)11-0027-03